劉 艷，殷 鑫，潘 娟，管 偉，楊炳友，匡海學(xué)

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040）

茄根為茄科植物茄Solanum melongenaL.的干燥根及莖基,是民間常用中藥材,具有清熱止血、祛風(fēng)利濕等功效,傳統(tǒng)用于治療凍瘡、腳氣、血痢、風(fēng)濕熱痹等［1］。茄在世界范圍內(nèi)種植廣泛,其果實(shí)被作為大眾蔬菜食用,然而,每年果實(shí)采收的同時(shí)會(huì)有大量的茄根被丟棄,造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)。近年來(lái),越來(lái)越多的研究者開(kāi)始關(guān)注茄根的生物活性,發(fā)現(xiàn)其在抗炎方面較為突出［2-6］。為了深入探索茄根抗炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)對(duì)茄根乙醇提取物的化學(xué)成分進(jìn)行研究,從中分離得到12 個(gè)含氮化合物,所有化合物均為首次從該植物中分離得到。同時(shí),采用LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7生成NO 細(xì)胞模型評(píng)價(jià)所得化合物的抗炎活性,化合物4、8、10～12 具有潛在的抗炎活性。

1 材料

Bruker-400 超導(dǎo)核磁共振光譜儀(德國(guó)Bruker公司)；ACQUITY Ultra Performance LCTM液質(zhì)聯(lián)用色譜儀、Delta 600-2487 型制備HPLC、2695-2998-2414 型分析HPLC、Waters Sunfire C18分析型色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Waters Sunfire C18制備型色譜柱(19 mm×250 mm,10 μm) (美國(guó)Water 公司)；柱色譜用硅膠(200～300 目,青島海洋化工廠)；MCI 柱色譜反相(日本三菱公司)；YMC ODS-7515-12A 柱色譜反相 (日本YMC 公司)；Sephadex LH-20 柱色譜 (瑞 典 GE Life Sciences 公司)；TLC 用硅膠板(Silicagel 60 F254)、反相板(Rp-18 F254) (德國(guó)Merck 公司)；所用試劑均為分析純(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

茄根于9 月末采收于河北省安國(guó)市,放置通風(fēng)處陰干。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥用植物教研室樊銳鋒鑒定為茄科茄屬植物茄Solanum melongenaL.的干燥根。原植物標(biāo)本(20161010)保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室。

2 提取與分離

干燥茄根(20 kg) 切段后,用70%乙醇回流提取3 次,每次2 h,減壓回收溶劑,得浸膏1.503 kg。之后采用MCI 柱色譜法,依次用30%、60%、80%甲醇洗脫,收集各組分洗脫液,回收溶劑,得30%甲醇洗脫組分597 g、60%甲醇洗脫組分403 g、80%甲醇洗脫組分171 g。60%甲醇組分(200 g) 通過(guò)硅膠柱色譜,用二氯甲烷-甲醇(1 ∶0～0 ∶1) 梯度洗脫,所得洗脫液經(jīng)過(guò)反復(fù)TLC 分析鑒別后合并,最終得到Fr.1～9 共9 個(gè)流分。Fr.2 經(jīng)過(guò)ODS 柱甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 梯度洗脫,獲得Fr.2 A～H 共8 個(gè)組分。Fr.2C 經(jīng)過(guò)ODS 柱甲醇-水(10 ∶90～100 ∶0) 梯度洗脫,獲得Fr.2C1～9 共9 個(gè)組分。Fr.2C3 經(jīng)Sephadex LH-20 柱甲醇-水 (70 ∶30) 洗脫,依次得化合物3(1.2 mg)、7 (8.7 mg)。Fr.2C7 為化合物1 (5.7 mg)。Fr.3 經(jīng)半制備型HPLC 甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 獲得Fr.3 A～F 共6 個(gè)組分。Fr.3B 經(jīng)半制備型HPLC 甲醇-水(12 ∶88) 得化合物10 (8.6 mg)、11 (4.0 mg)、12 (5.4 mg)。Fr.3D 經(jīng)過(guò)ODS 柱甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 梯度洗脫,獲得Fr.3D1～7 共7 個(gè)組分。Fr.3D5 為化合物4(8.3 mg)。Fr.4 經(jīng)過(guò)ODS 柱色譜甲醇-水(20 ∶80～100 ∶0) 梯度洗脫,獲得Fr.4 A～H 共8 個(gè)組分。Fr.4 A 經(jīng)半制備型HPLC 甲醇-水(42 ∶58)得到化合物2 (6.5 mg)、8 (6.2 mg)。Fr.4E 經(jīng)ODS 柱色譜甲醇-水(15 ∶85～100 ∶0) 梯度洗脫,獲得Fr.4E1～6 共6 個(gè)組分。Fr.4E1 經(jīng)半制備型HPLC 甲醇-水(54 ∶46) 得化合物5 (15.0 mg)、6 (9.1 mg)。Fr.4E1 經(jīng)Sephadex LH-20 柱色譜甲醇-水(100 ∶0) 洗脫,獲得化合物9 (1.1 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:180.101 1 ［M+H］+(計(jì)算值180.102 5),分子式C10H13NO2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.01 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.70 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),2.67(2H,t,J=7.3 Hz,H-7),3.32 (2H,t,J=7.3 Hz,H-8),1.89 (3H,s,H-10)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:131.3 (C-1),130.7 (C-2,6),116.2 (C-3,5),156.9 (C-6),35.7 (C-7),42.4 (C-8),173.0 (C-9),22.5 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］ 基本一致,故鑒定為N-acetyltyramine。

化合物2:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:164.105 1 ［M+H］+(計(jì)算值164.107 5),分子式C10H13NO。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.15～7.28 (5H,m,H-2,3,4,5,6),2.77 (2H,t,J=7.6 Hz,H-7),3.37 (2H,t,J=7.6 Hz,H-8),1.89 (3H,s,H-10)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ:140.5 (C-1),129.5 (C-2),129.8 (C-3),127.3 (C-4),129.8 (C-5),129.5 (C-6),36.5 (C-7),42.1 (C-8),173.2(C-9),22.5 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］ 基本一致,故鑒定為N-(2-phenylethyl) acetamide。

化合物3:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:164.073 6 ［M+H］+(計(jì)算值164.071 2),分子式 C9H10NO2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.41 (2H,d,J=8.4 Hz,H-2,6),6.43 (2H,d,J=8.4 Hz,H-3,5),7.47(1H,d,J=15.8 Hz,H-7),6.43 (1H,d,J=15.8 Hz,H-8)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:127.6(C-1),130.7 (C-2),116.7 (C-3),160.7 (C-4),116.7 (C-5),130.7 (C-6),142.9 (C-7),117.8 (C-8),171.7 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］基本一致,故鑒定為3-(4-aminophenyl) -prop-2-enoic acid。

化合物4:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:227.140 2 ［M+H］+(計(jì)算值227.139 6),分子式C11H18N2O3。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.49 (1H,m,H-3a),3.52(1H,m,H-3b),1.91 (1H,m,H-4a),2.02(1H,m,H-4b),1.97 (1H,m,H-5a),2.31(1H,m,H-5b),4.07 (1H,brs,H-6),4.19(1H,d,J=7.2 Hz,H-9),2.16 (1H,m,H-10),1.44 (1H,m,H-11a),1.31 (1H,m,H-11b),0.93 (3H,t,J=7.4 Hz,H-12),1.06 (3H,d,J=7.2 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:172.4 (C-1),46.2 (C-3),23.2 (C-4),29.6 (C-5),61.3 (C-6),167.6 (C-7),60.0 (C-9),25.4 (C-10),37.1 (C-11),15.5 (C-12),12.6(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 基本一致,故鑒定為callyspongidipeptide A。

化合物5:白色晶體,易溶于甲醇。HR-ESIMSm/z:222.079 2 ［M+H］+(計(jì)算值222.076 6),分子式C11H11NO4。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:8.30 (1H,dd,J=8.4,2.1 Hz,H-2),7.25 (1H,d,J=8.4 Hz,H-3),8.52 (1H,d,J=2.1 Hz,H-6),2.43 (2H,t,J=7.9 Hz,H-3′),1.89 (2H,m,H-4′),3.80 (2H,t,J=7.0 Hz,H-5′)；13CNMR (100 MHz,CD3OD)δ:127.6 (C-1),130.6(C-2),117.8 (C-3),157.9 (C-4),123.5 (C-5),130.2 (C-6),168.6 (C-7),175.4 (C-2′),31.6 (C-3′),19.2 (C-4′),49.8 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］ 基本一致,故鑒定為pistaciamide。

化合物6:淡黃色晶體,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:325.142 5 ［M+H］+(計(jì)算值325.140 0),分子式C15H20N2O6。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.86 (1H,s,H-5),7.06 (1H,s,H-8),2.15 (3H,s,H-9),2.13 (3H,s,H-10),5.36 (1H,dd,J=14.0,9.6,H-1′a),4.91(1H,dd,J=14.0,2.4,H-1′b),5.16 (1H,m,H-2′),4.65 (1H,m,H-3′),4.70 (1H,m,H-4′),4.41 (1H,dd,J=10.6,2.7,H-5′a),4.56(1H,dd,J=10.6,4.5,H-5′b)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:157.8 (C-2),155.4 (C-3),125.2 (C-4a),118.0 (C-5),132.6 (C-6),132.1 (C-7),117.1 (C-8),126.6 (C-8a),20.0(C-9),19.5 (C-10),46.9 (C-1′),71.6 (C-2′),75.7 (C-3′),75.1 (C-4′),65.6 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［12］ 基本一致,故鑒定為tatarine C。

化合物7:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:243.099 5 ［M+H］+(計(jì)算值243.098 1),分子式C10H14N2O5。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.80 (1H,s,H-4),1.87 (3H,s,H-7),6.27 (1H,t,J=7.0 Hz,H-1′),2.23(2H,m,H-2′),4.39 (1H,m,H-3′),3.90 (1H,brd,J=3.4,H-4′),3.72 (1H,dd,J=12.0,3.4,H-5′a),3.79 (1H,dd,J=12.0,3.6,H-5′b)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:166.4 (C-2),111.5 (C-3),138.1 (C-4),152.3 (C-6),12.4(C-7),86.2 (C-1′),41.1 (C-2′),72.2 (C-3′),88.8 (C-4′),62.8 (C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［13］ 基本一致,故鑒定為thymidine。

化合物8:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:186.117 7 ［M+H］+(計(jì)算值186.113 0),分子式 C9H15NO3。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:2.33 (2H,m,H-3),2.48 (1H,m,H-4a),2.14 (1H,m,H-4b),4.27 (1H,dd,J=9.1,4.4 Hz,H-5),4.16 (2H,t,J=6.6,H-7),1.64 (2H,m,H-8),1.40 (2H,m,H-9),0.95 (3H,t,J=7.4,H-10)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:174.1 (C-2),30.3 (C-3),25.9 (C-4),57.1 (C-5),181.0 (C-6),66.3 (C-7),31.7 (C-8),20.1 (C-9),14.0 (C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［14］ 基本一致,故鑒定為butyl-2-pyrrolidone-5-carboxylate。

化合物9:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:119.062 8 ［M+H］+(計(jì)算值119.060 9),分子式C7H6N2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:7.93 (1H,s,H-3),8.06 (1H,dd,J=6.8,1.5 Hz,H-4),7.16 (1H,m,H-5),7.19 (1H,m,H-6),7.42 (1H,dd,J=6.8,1.5 Hz,H-7)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:133.4 (C-3),122.4 (C-4),122.0 (C-5),127.6(C-6),112.9 (C-7),138.2 (C-8),123.6 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［15］ 基本一致,故鑒定為indazole。

化合物10:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:211.141 8 ［M+H］+(計(jì)算值211.144 7),分子式C11H19N2O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.50 (2H,m,H-3),1.87 (1H,m,H-4a),2.01 (1H,m,H-4b),2.29 (1H,m,H-5a),1.92 (1H,m,H-5b),4.12 (1H,m,H-6),4.26 (1H,t,J=6.8,H-9),1.98 (1H,m,H-10a),1.51 (1H,m,H-10b),1.98 (1H,m,H-11),0.96 (3H,d,J=6.4,H-12),0.94 (3H,d,J=6.2,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:172.8 (C-1),46.4 (C-3),23.7 (C-4),29.1 (C-5),60.3 (C-6),168.9 (C-7),54.6 (C-9),39.4 (C-10),25.8 (C-11),23.3 (C-12),22.2(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 基本一致,故鑒定為cyclo-［(S) -pro-(R) -leu］。

化合物11:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:214.150 8 ［M+H］+(計(jì)算值214.155 6),分子式C10H20N3O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.60 (1H,m,H-3a),3.49(1H,m,H-3b),2.02 (1H,m,H-4a),1.93(1H,m,H-4b),2.32 (1H,m,H-5a),1.95(1H,m,H-5b),4.02 (1H,br.s,H-6),4.19(1H,t,J=7.6,H-9),2.47 (1H,m,H-10),1.08 (3H,d,J=7.2,H-11),0.92 (3H,d,J=6.9,H-12)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:172.6(C-1),46.2 (C-3),23.3 (C-4),29.5 (C-5),61.5 (C-6),167.6 (C-7),60.0 (C-9),29.9 (C-10),18.8 (C-11),16.7 (C-12)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］ 基本一致,故鑒定為seco-［(S) -pro-(R) -val］。

化合物12:無(wú)定形粉末,易溶于甲醇。HRESI-MSm/z:245.130 0 ［M+H］+(計(jì)算值245.129 0),分子式C14H17N2O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:3.36 (1H,m,H-3a),3.52(1H,m,H-3b),1.79 (2H,m,H-4),1.22 (1H,m,H-5a),2.08 (1H,m,H-5b),4.06 (1H,ddd,J=10.7,6.3,1.7,H-6),4.44 (1H,ddd,J=9.8,4.9,1.7,H-9),3.13 (1H,dd,J=14.2,4.8,H-10a),3.18 (1H,dd,J=14.2,5.2,H-10b),7.24 (5H,m,H-2′～6′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ:166.9 (C-1),46.0 (C-3),22.8(C-4),29.4 (C-5),60.1 (C-6),170.9 (C-7),57.7 (C-9),38.2 (C-10),137.3 (C-1′),131.1(C-2′),129.5 (C-3′),128.1 (C-4′),129.5 (C-5′),131.1 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［16］ 基本一致,故鑒定為(L) -pro-(L) -phe。

4 抗炎活性測(cè)試

采用LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 生成NO 的細(xì)胞模型評(píng)價(jià)化合物1～12 的抗炎活性,吲哚美辛作為陽(yáng)性藥。RAW264.7 細(xì)胞接種于96 孔板中,加入1 μg/mL LPS 刺激,孵育后加入充分溶解的各濃度藥物(終濃度為1、5、10、20、40、80 μmol/L),孵育后轉(zhuǎn)移上清液至新96 孔板,分別加入Griess試劑A、B 液各50 μL,避光顯色15 min,570 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)各孔吸光度(OD) 值,計(jì)算其半數(shù)抑制濃度(IC50) 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 生成NO 的抑制率（，μmol/L）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on LPS-induced NO production by RAW264.7（，μmol/L）

表1 各化合物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 生成NO 的抑制率（，μmol/L）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on LPS-induced NO production by RAW264.7（，μmol/L）

5 討論

茄根在民間被廣泛用于治療凍傷,雖然近年來(lái)也有研究者關(guān)注茄根的生物活性,但大多停留在民間驗(yàn)方和粗提物的水平。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)開(kāi)展茄根中含氮成分的分離和抗炎活性評(píng)價(jià)研究,發(fā)現(xiàn)了其中可能具有抗炎作用的活性成分,以期豐富茄根的化學(xué)成分,同時(shí)也為進(jìn)一步闡明茄根治療凍傷的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供參考。