免疫檢查點抑制劑相關(guān)生物標志物的研究及臨床應(yīng)用*

陳彥青，曹 炬

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科,重慶 400016

隨著2011年美國食品及藥物管理局(FDA)批準的首個免疫檢查點抑制劑(ICIs)Ipilimumab的上市，醫(yī)學(xué)界開啟了ICIs用于臨床抗腫瘤治療的新紀元，是腫瘤免疫治療的革命性里程碑。免疫檢查點指免疫細胞在維持免疫耐受過程中為調(diào)節(jié)和控制免疫應(yīng)答的持久性而具有的一系列抑制通路[1]。而腫瘤細胞又恰好可以通過激活免疫檢查點通路抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答[2]。因此，ICIs主要通過抑制T細胞介導(dǎo)的這種抑制性免疫應(yīng)答，促進免疫介導(dǎo)的腫瘤細胞清除。目前，ICIs主要分為兩類：一類是靶向細胞毒性T淋巴細胞抗原-4(CTLA-4)的抗體；另一類是靶向程序性細胞死亡蛋白-1(PD-1)及其配體程序性死亡受體配體-1(PD-L1)的抗體。盡管ICIs療法可以為一部分患者提供持久的治療效果，但一部分患者會發(fā)生耐藥，還有一部分患者會出現(xiàn)自身免疫樣毒性，也就是免疫相關(guān)不良事件(irAEs)。耐藥可以分為兩大類：一類是原發(fā)性耐藥，患者對ICIs沒有任何反應(yīng)并且腫瘤進展迅速；另一類是獲得性耐藥，患者最初對ICIs治療有反應(yīng)，但最終出現(xiàn)臨床和/或放射學(xué)上的疾病進展[3]。而irAEs可以發(fā)生在皮膚、甲狀腺、胃腸道、肝、肺等任何器官，根據(jù)惡性腫瘤的類別、ICIs的種類和易感性而存在個體差異[4-9]，嚴重者會出現(xiàn)腫瘤暴發(fā)性進展甚至死亡。ICIs相關(guān)生物標志物的研究可以避免上述耐藥、不良反應(yīng)的發(fā)生，幫助臨床實現(xiàn)個體化精準治療，選擇合適的方法進行治療，延緩患者疾病的進展，提高患者的療效，減少不必要的經(jīng)濟負擔(dān)，早期識別不良反應(yīng)，避免不良反應(yīng)的發(fā)生，延長患者的生存期。因此，尋找能夠判斷ICIs療效、耐藥，預(yù)測和診斷irAEs的生物標志物亟不可待。

1 ICIs及其相關(guān)反應(yīng)的機制

1.1ICIs的作用機制 CTLA-4通路與PD-1通路有許多相似之處，兩者都在活化的T細胞中有表達，均是B7/CD28共刺激受體家族的成員，且均能抑制T細胞增殖、葡萄糖代謝、細胞因子表達和T細胞存活[10]。但兩者也有許多不同之處，其反應(yīng)時間、反應(yīng)場所、具體表達細胞、配體表達細胞及具體作用機制均有不同，具體如下。

1.1.1CTLA-4類抗體的作用機制 首個被美國FDA批準上市的ICIs Ipilimumab就是靶向CTLA-4的抗體，主要用于黑色素瘤的治療[11-12]。CTLA-4，又名CD152，僅由T細胞表達。在靜止的T細胞中，CTLA-4是一種胞內(nèi)蛋白，當(dāng)主要組織相容性復(fù)合物(MHCs)與T細胞受體(TCRs)結(jié)合，共刺激受體CD28與配體CD80(B7.1)和CD86(B7.2)結(jié)合后，CTLA-4轉(zhuǎn)移到細胞表面，競爭性地與共刺激因子CD80/CD86結(jié)合，介導(dǎo)抑制性信號進入T細胞，從而阻止T細胞增殖和活化。與CD28相比，CTLA-4與CD80/86配體的親和力更高[13]。因此，CTLA-4可以在淋巴結(jié)免疫應(yīng)答的早期控制T細胞的增殖和活化。不同于效應(yīng)T細胞(Teff)，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)構(gòu)成性表達CLTA-4[14]，在炎性反應(yīng)刺激下，抗原提呈細胞(APCs)上調(diào)CD80/CD86的表達，減弱Treg表面CTLA-4對CD28的競爭性抑制，從而激活共刺激信號，促進T細胞增殖，增強炎癥免疫應(yīng)答。而在腫瘤微環(huán)境(TME)中，CD80/CD86受Treg的控制，大量的Treg抑制免疫應(yīng)答。而CTLA-4抗體具有比CD80/CD86更高的CTLA-4親和力，其與CTLA-4結(jié)合可使Treg耗竭或功能性阻斷。CTLA-4抗體還可以防止APCs跨內(nèi)吞作用，增加其表面CD80/CD86的表達，并通過表達FcR-Ⅳ腫瘤內(nèi)巨噬細胞介導(dǎo)的直接Treg毒性和抗體依賴性細胞毒性，增強T細胞活化和抗腫瘤免疫應(yīng)答[15-16]。

1.1.2PD-1/PD-L1類抗體的作用機制 PD-1在活化的T細胞、B細胞和自然殺傷(NK)細胞上均有表達，并且是外周組織后期抗腫瘤免疫的重要組成之一[17-18]。PD-1，又名CD274，是B7/CD28共刺激受體家族中的成員，通過與配體PD-L1和PD-L2結(jié)合來抑制T細胞活化[19]，維持免疫穩(wěn)態(tài)。PD-L1在多種腫瘤細胞中高表達[20]，并且在TME中，宿主樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、成纖維細胞及T細胞中也表達PD-L1，從而抑制抗腫瘤免疫[21-22]。此外，PD-L1的表達還受JAK2、STAT等基因轉(zhuǎn)錄信號通路[23-24]，轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾[25-26]及外泌體轉(zhuǎn)運[27]等的調(diào)控。用抗體阻斷PD-1受體或其配體PD-L1可重新激活TME中耗竭的免疫細胞并消除癌細胞，增強抗腫瘤免疫活性，還能降低PD-L1驅(qū)動的非免疫檢查點功能，減弱DNA損傷反應(yīng)和修復(fù)[28-29]。并且，通過抗體下調(diào)APC和DC上的PD-L1表達還可以提高對ICIs聯(lián)合療法的反應(yīng)率[30-31]。

1.2ICIs耐藥的機制 目前，對ICIs耐藥機制的研究依賴于臨床前研究和相關(guān)的臨床數(shù)據(jù)[32]。而由于缺乏對ICIs長期療效和臨床反應(yīng)相關(guān)的臨床、分子、免疫學(xué)因素的認識，ICIs治療相關(guān)的原發(fā)性和獲得性耐藥機制也尚未完全闡明。但已經(jīng)明確的是，ICIs耐藥往往與抗原加工和呈遞中的體細胞突變，與細胞黏附、血管生成[33]和細胞外基質(zhì)重塑有關(guān)的基因上調(diào)[34]，以及一些信號通路的改變有關(guān)。其中，原發(fā)性耐藥的機制包括抗原突變、腫瘤抗原表達缺失[35]、HLA表達缺失、抗原加工機制改變[36]，以及T細胞功能不全。T細胞功能不全包括與MAPK、PTEN/PI3K[37]、WNT/β-catenin[38]和BRAF[39]等致癌基因信號和組成性PD-L1表達[40]改變有關(guān)的遺傳性T細胞抵抗,與干擾素-γ(IFN-γ)信號通路突變有關(guān)的T細胞不敏感，由Treg/Teff比例失調(diào)引起的T細胞抑制功能失調(diào)和腫瘤特異性TCRs缺乏的T細胞缺乏。而目前對繼發(fā)性耐藥機制的研究還較少，但類似于原發(fā)性耐藥，其機制同樣也包括靶抗原、HLA喪失，干擾素信號改變及T細胞功能喪失。但又不同于原發(fā)性耐藥患者中β2-微球蛋白(β2-MG)缺失引起的MHCⅠ類抗原提呈缺失，大多數(shù)具有β2-MG突變和蛋白表達缺失的患者仍然對ICIs敏感，不表現(xiàn)為繼發(fā)性耐藥，提示雖然原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥的表型機制相似，但其根本機制有本質(zhì)區(qū)別，有待進一步探索。

1.3irAEs的機制 irAEs的機制尚未完全明確，但可以肯定其機制與其相應(yīng)藥物的治療機制基本一致。其潛在機制主要包括針對腫瘤和健康組織中抗原的T細胞活性增加，之前存在的自身抗體水平增加以及炎癥細胞因子表達上升。有研究發(fā)現(xiàn)，在1例患者的心肌和腫瘤組織中有類似的T細胞克隆[41],提示在正常組織中，針對腫瘤的T細胞與針對相關(guān)抗原的T細胞之間存在交叉反應(yīng)[42]，T細胞抗腫瘤活性增加的同時可能也會攻擊正常的組織細胞，導(dǎo)致細胞介導(dǎo)的組織損傷。同時，ICIs可能重新激活原本處于休眠狀態(tài)的自身反應(yīng)性T細胞，導(dǎo)致T細胞對腫瘤抗原和自身抗原的耐受性下降，自身反應(yīng)性B細胞活化并最終形成自身抗體，引起irAEs，但目前仍缺乏irAEs患者自身抗體表達差異的前后對照研究。T細胞活化必然會引起炎癥因子表達增加，炎癥因子的級聯(lián)放大效應(yīng)在irAEs的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮了重要作用。雖然CTLA-4通路與PD-1/PD-L1通路存在一些相似之處，但其本質(zhì)不同。因此，其機制也因ICIs種類而各有側(cè)重。CTLA-4抗體側(cè)重于破壞穩(wěn)態(tài)外周的陰性選擇，促進了新的自我反應(yīng)性T細胞的發(fā)育，而PD-1主要激活轉(zhuǎn)錄因子，改變耗竭T細胞的表觀基因，導(dǎo)致其重新激活并增加了攻擊自身組織的可能性。并且，CTLA-4抗體可以直接與垂體等正常組織的CTLA-4結(jié)合，增強補體介導(dǎo)的細胞毒副作用[43]。特定irAEs可能涉及不同的病理學(xué)、生理學(xué)機制，需要具體問題具體分析。而遺傳學(xué)、免疫系統(tǒng)狀態(tài)，以及如宿主微生物組學(xué)、腸道菌群等的其他環(huán)境因素在irAEs中的作用仍不清楚，還有待進一步了解。

2 ICIs相關(guān)生物標志物

2.1評估ICIs療效的生物標志物 ICIs療效與腫瘤基因組學(xué)、宿主遺傳學(xué)，及免疫微環(huán)境(IME)有關(guān)的PD-L1表達、淋巴細胞表型、炎癥因子表達等有關(guān)。腫瘤種類不同，免疫檢查點的應(yīng)用不同，ICIs引起的免疫應(yīng)答也不同。并且ICIs藥物史會影響生物標志物的預(yù)測效力，但并不會影響藥物的療效。

腫瘤基因組學(xué)的生物標志物主要通過基因突變影響T細胞對腫瘤細胞的識別來評估ICIs的療效。與ICIs療效呈正相關(guān)的潛在腫瘤基因組學(xué)相關(guān)的生物標志物包括腫瘤突變負荷(TMB)、MHCs特異的親和力指數(shù)(DAI)、錯配修復(fù)缺陷(MMRd)和插入缺失突變。與ICIs療效呈負相關(guān)的潛在腫瘤基因組學(xué)相關(guān)的生物標志物包括CTLA-4抗體耐藥相關(guān)的黑色素瘤相關(guān)抗原(CRMA)、腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性(ITH)和體細胞拷貝數(shù)(SCNAs)。另外，有研究表明BRAF[44]、PBRM1[45]缺失突變與PD-1抗體療效呈正相關(guān)關(guān)系，KRAS突變合并LKB1缺陷與PD-1療效呈負相關(guān)關(guān)系[46]； SERPINB3和SERPINB4突變與CTLA-4抗體療效呈正相關(guān)關(guān)系[47-48]。

宿主遺傳學(xué)相關(guān)的生物標志物主要與宿主免疫基因多態(tài)性有關(guān)，包括HLA-Ⅰ多樣性和FcγR單核苷酸多態(tài)性，均與ICIs療效呈正相關(guān)關(guān)系。HLA-Ⅰ多樣性主要表現(xiàn)在HLAB和HLAC位點：HLAB編碼的MHCs能夠與更多樣化的TCRs結(jié)合，HLAC在APCs中的表達高于其他細胞。并且，從TMB和TCRs的角度考慮，HLA-Ⅰ 多樣性也能促進ICIs療效提高。研究表明，在黑色素瘤中，等位基因CD16AV158F編碼的FcγR與IgG免疫球蛋白的親和力增加，與CTLA抗體療效呈正相關(guān)關(guān)系[49]。

與IME有關(guān)的生物標志物包括免疫細胞、細胞因子及PD-L1。免疫細胞包括腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)、CD8+T細胞、CD4+記憶T細胞和骨髓源性抑制細胞(MDSCs)。細胞因子主要是TGF-β，其可以促進CD8+T細胞排斥。而PD-L1作為PD-1/PD-L1抗體的作用靶點，和TMB都是ICIs治療的獨立預(yù)測因子。其中，與ICIs療效呈正相關(guān)的是TILs、CD8+T細胞、CD4+記憶T細胞和PD-L1。其余與ICIs療效呈負相關(guān)關(guān)系。

此外，還有一些全身性的生物標志物也與ICIs療效有關(guān)，如淋巴細胞計數(shù)、單核細胞計數(shù)、Treg水平、嗜酸性粒細胞計數(shù)、白細胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10表達及乳酸脫氫酶活性等。值得注意的是，MMRd實際上會表現(xiàn)出微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)，MSI陽性腫瘤實質(zhì)是一種特殊的高TMB腫瘤，其會高表達PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3及IDO1。因此，除PD-L1之外，PD-1、CTLA-4、LAG3及IDO1也可能成為與ICIs治療的潛在生物標志物。

2.2ICIs耐藥的生物標志物 由于缺乏MHC Ⅰ類分子，抗原加工和提呈受干擾，上文提到的CRMA，也是CTLA-4抗體治療耐藥的生物標志物。而SCNAs會干擾腫瘤抗原與MHCs的裝配，也是耐藥的生物標志物之一。另外，PTEN失活[37]、IFN-γ信號通路相關(guān)的基因突變，以及WNT/β-catenin信號通路也是ICIs耐藥的生物標志物[38]。

2.3預(yù)測和診斷irAEs的生物標志物 目前，普遍認為女性、身體機能狀態(tài)較差及少肌性肥胖均是irAEs的危險因素。而irAEs診斷主要通過排除其他感染、藥物等原因，依賴常規(guī)的實驗室指標、影像學(xué)表征及病理學(xué)分析確定的終末器官功能障礙。若診斷不足可能會導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)亩拘灾委煹某掷m(xù)及不良反應(yīng)的加??；相反，若過度診斷則可能導(dǎo)致不適當(dāng)?shù)腎CIs使用的永久保留或終止，以及不適當(dāng)?shù)奶瞧べ|(zhì)激素或其他免疫抑制劑的使用。因此，急需一些生物標志物來早預(yù)測、早預(yù)防、早診斷、早治療irAEs。

預(yù)測和診斷irAEs的潛在生物標志物可分為細胞、內(nèi)分泌激素、自身免疫抗體、細胞因子及趨化因子、微生物、遺傳及影像學(xué)指標幾大類。細胞類包括上文提到的Treg，低基礎(chǔ)Treg水平可能增加ICIs引起的結(jié)腸炎發(fā)生的風(fēng)險，而CD4+T細胞則恰恰相反，高基礎(chǔ)水平反而會增加ICIs引起的結(jié)腸炎發(fā)生的風(fēng)險，但兩者對于預(yù)測irAEs均缺乏特異度，無法將其與預(yù)測ICIs療效區(qū)分開。還有淋巴細胞計數(shù)、中性粒細胞與淋巴細胞比值、嗜酸性粒細胞計數(shù)、T細胞多樣性和CD8+T細胞均與irAEs的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)關(guān)系。前3者雖然便宜、常用，但缺乏靈敏度和特異度；后兩者價格昂貴，且對于irAEs患者個體的提示意義尚不明確，可用性有限。內(nèi)分泌激素中唯一能預(yù)測和診斷irAEs的促甲狀腺激素(TSH)和自身免疫抗體中的抗甲狀腺球蛋白是與ICIs引起的甲狀腺炎呈正相關(guān)的生物標志物，且具有特異度。其他的自身免疫抗體類生物標志物還包括GAD65抗體、胰島素抗原-2抗體、鋅轉(zhuǎn)運體8抗體、胰島素抗體和抗核抗體，前4者是診斷ICIs引起的糖尿病的生物標志物，價格昂貴，可用度有限；后者與irAEs發(fā)展有關(guān)，但對irAEs患者個體缺乏特異度。

能夠預(yù)測和診斷irAEs的細胞因子和趨化因子類的生物標志物有很多，可以獨立應(yīng)用作為irAEs生物標志物的包括IFN-γ、IL-6、IL-17、瘦素、可溶性CD163和CRP。治療后的IFN-γ低水平提示ICIs引起的肺炎，是其特異性指標。低基礎(chǔ)水平的IL-6提示ICIs引起的結(jié)腸炎，而出現(xiàn)irAEs后的IL-6升高提示銀屑病加重。高基礎(chǔ)水平的IL-17提示結(jié)腸炎，但其檢測試劑價格昂貴，且受目前臨床細胞因子檢測水平的限制。治療后的瘦素低水平、可溶性CD163高水平及CRP表達上升均提示出現(xiàn)irAEs風(fēng)險增加。細胞因子中IL-8和可溶性CD25同時低基礎(chǔ)水平提示ICIs引起的結(jié)腸炎風(fēng)險增加，而TNF-α和IFN-α2同時表達升高提示嚴重的irAEs。當(dāng)趨化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL19聯(lián)用，其低基線水平提示irAEs風(fēng)險增加；而ICIs治療后趨化因子CXCL9、CXCL10、CCL5和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)均升高提示irAEs風(fēng)險增加。將G-CSF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、分型趨化因子、成纖維細胞生長因子-2、IFN-α2、IL-12p70、IL-1a、IL-1b、IL-RA、IL-2和IL-13聯(lián)用，進行綜合評分，高基礎(chǔ)水平評分和治療后評分均提示出現(xiàn)irAEs風(fēng)險增加。

微生物組學(xué)方面的標志物包括厚壁菌門糞桿菌屬、擬桿菌和與多胺轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、硫胺素、核黃素、泛酸鹽合成有關(guān)的微生物代謝產(chǎn)物，其相關(guān)指標的基線水平上升均會增加出現(xiàn)irAEs的風(fēng)險，而擬桿菌和微生物代謝產(chǎn)物相關(guān)指標是提示ICIs引起的結(jié)腸炎的特異性指標。遺傳學(xué)標志物包括HLA-DR4表型、CD177和癌胚抗原細胞黏附因子1(CEACAM1)，HLA-DR4與ICIs引起的糖尿病有關(guān)，治療后的CD177和CEACAM1升高，提示irAEs風(fēng)險增加。最后是影像學(xué)指標胸部CT，其評分升高與ICIs引起的肺炎有關(guān)，具有良好的靈敏度和特異度。

3 ICIs相關(guān)生物標志物的臨床應(yīng)用

目前，經(jīng)過Ⅲ期臨床試驗驗證的生物標志物僅有TMB和PD-L1，雖然它們已是臨床應(yīng)用ICIs的常規(guī)監(jiān)測指標，但其仍有一些缺陷。在非小細胞肺癌中，帕博利珠單抗的應(yīng)答率在高水平PD-L1表達的情況下為45%～50%，但在無PD-L1表達的情況下其應(yīng)答率仍有10%～15%。并且在兩個獨立的CTLA4抗體治療黑色素瘤患者的隊列研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SCNAs與TMB聯(lián)用時，其對ICIs療效的預(yù)測效果優(yōu)于TMB[50]?？梢?，將潛在的生物標志物最終應(yīng)用于臨床還有很長的路要走。

而因功能障礙的終末器官不同，目前用于監(jiān)測和診斷irAE的常規(guī)臨床實驗室檢測方法包括用于腎炎的血清肌酐，用于肝炎的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和膽紅素，用于心肌炎或肌炎的肌鈣蛋白和肌酸激酶，用于胰腺炎的脂肪酶及用于垂體炎和甲狀腺炎等內(nèi)分泌疾病的腎上腺皮質(zhì)營養(yǎng)激素、皮質(zhì)醇、促黃體生成激素、促卵泡激素、胰島素樣生長因子1、生長激素、TSH和游離甲狀腺素等。但是，它們都無法為有關(guān)毒性的病理學(xué)、生理學(xué)機制提供有意義的見解或預(yù)測價值。且癌癥患者治療中常發(fā)生的肝腎功能障礙并不是ICIs誘導(dǎo)的宿主免疫增強所特有的。目前，雖然將這些常規(guī)的臨床實驗室檢測指標作為一般推薦，但實際上支持這些參數(shù)的最佳篩查頻率的證據(jù)也是缺乏的，而irAEs的其他生物標志物還處于早期探索階段。

4 總結(jié)與展望

目前，ICIs治療已被寫入各種復(fù)發(fā)性惡性腫瘤和中晚期癌癥的臨床應(yīng)用指南中，甚至能夠躋身于Ⅰ級推薦。但由于在我國，一些ICIs尚未獲得腫瘤治療的適應(yīng)證，且相關(guān)診斷試劑獲批較晚，目前仍缺乏基于我國人群的相關(guān)研究及循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。雖然已有研究表明[50]ICIs確實對腫瘤有效且能延長患者的總生存期，但其具體機制尚未完全闡明，對其相關(guān)生物標志物的研究也處于早期探索階段。隨著檢測技術(shù)的快速發(fā)展、相關(guān)醫(yī)學(xué)技術(shù)的突飛猛進，相信在不久的將來，ICIs的作用機制將會進一步明確，其相關(guān)生物標志物的研究會進一步發(fā)展，早日應(yīng)用到臨床以指導(dǎo)癌癥患者用藥，延長患者生存期，提高患者生活質(zhì)量。