泡狀棘球蚴原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)的相互作用研究

楊海成，楊照輝，史康杰，溫鈺鵬，張示杰

泡狀棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)是一種人獸共患病，當(dāng)人誤食多房棘球絳蟲(Echinococcusmultilocularis，E.multilocularis)的蟲卵時，蟲卵發(fā)育成六鉤蚴入血，成蟲寄生于肝臟可致AE。E.multilocularis的生命周期復(fù)雜，根據(jù)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其終宿主為野生或家養(yǎng)犬科動物，如北極狐、豺、狼或狗等，而人類是中間宿主[1]。E.multilocularis的幼蟲期是AE的病原體，估計每年有17 400例感染，其中大多數(shù)發(fā)生在中國，多聚集在新疆、青海、西藏等地[2]。AE是一種破壞性的臨床病癥，其特征在于寄生蟲的進行性、浸潤性增殖，多似惡性腫瘤[3]。AE主要影響肝臟，若治療不及時，往往病死率極高[4]。肝臟中最常見的惡性腫瘤為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，隨著社會進入老齡化，我國HCC的患病數(shù)依然很龐大，5年轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率均高于60%[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴原頭節(jié)無法長時間在體外培養(yǎng)，直到Hemphill與Gottstein首次提出泡球蚴原頭節(jié)與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)可顯著延長原頭節(jié)在體外的存活時間[6]。目前雖有原頭節(jié)與飼養(yǎng)細胞共培養(yǎng)的報道，發(fā)現(xiàn)Hela細胞可作為泡球蚴的飼養(yǎng)細胞，促進泡球蚴的生長發(fā)育，但泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細胞(hepatoma cells，HepG2)共培養(yǎng)較少見。近年有關(guān)寄生蟲感染后導(dǎo)致宿主體內(nèi)感染灶內(nèi)細胞增殖的研究逐漸增多，多房棘球絳蟲[7]、枯氏錐蟲(Trypanosomacruzi)[8]、剛第弓形蟲(Toxoplasmagondii)[9]感染后，細胞內(nèi)ERK信號通路被激活，促進宿主細胞增殖。體外實驗表明，泡狀棘球蚴囊液中存在多種促炎細胞因子。因此我們將人源肝癌HepG2細胞作為飼養(yǎng)細胞與泡球蚴原頭節(jié)共培養(yǎng)觀察泡球蚴原頭節(jié)的存活及成囊情況，反之再去觀察泡狀棘球蚴原頭節(jié)對飼養(yǎng)細胞的作用?；诖讼敕?，我們初步分析E.multilocularis與肝癌HepG2細胞的相互作用及其機制，為包蟲病合并肝癌的臨床早期診治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1倫理聲明 本實驗所用動物均按照2017年3月1日《實驗動物管理條例》嚴格執(zhí)行，并且經(jīng)過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意(許可證號：2015-018-01)。

1.2 材 料

1.2.1原頭節(jié)及肝癌細胞的制備 從新疆維吾爾自治區(qū)疾控中心購SPF級長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)50只(雌雄各25只)，實驗動物許可證號：SCXK(新)2017-0021，鼠齡在6～8周之間，體重(40±5)g，用于E.multilocularis的保種與傳代。新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供感染E.multilocularis6個月以上的長爪沙鼠(15只)，按照原頭節(jié)提取方法提取原頭節(jié)。肝癌HepG2細胞購于武漢普諾賽公司，使用含1%青鏈霉素(購于Gibco公司)及10%胎牛血清(購于Gibco公司)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2主要試劑 伊紅染料、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、CCK8檢測試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒、RIPA細胞裂液等。

1.3原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng) 肝癌HepG2細胞采用10%的胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，隔天換液或傳代。待肝癌細胞貼壁后，將原頭節(jié)按數(shù)量加入到培養(yǎng)瓶中，換液前提前收集泡狀棘球蚴原頭節(jié)。

1.4原頭節(jié)活性檢測及成囊情況 將存在飼養(yǎng)細胞的原頭節(jié)組與無飼養(yǎng)細胞的原頭節(jié)組重新?lián)Q液時計時，每隔2 d取等量的原頭節(jié)數(shù)量進行活性檢測，使用伊紅染色的方法計算活性，以抗紅染原頭節(jié)計算存活量，以紅染原頭節(jié)計算死亡量，存活率=[存活量/(存活量+死亡量)]×100%。在原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)時，每隔7 d換液，每次取10 μL培養(yǎng)液計算成囊率，成囊率=(成囊泡數(shù)/視野下總原頭節(jié)數(shù))×100%。

1.5CCK8法檢測HepG2細胞增殖情況 按5×105/mL密度將HepG2細胞種植在24孔板中并設(shè)置空白組比較，培養(yǎng)12 h后，以不同濃度(0、3 000、6 000、9 000 個/孔)的原頭節(jié)加入到肝癌細胞中，每組設(shè)置3個對照組，待共培養(yǎng)48 h與72 h后，將原頭節(jié)從上清中完全取出，每孔加入25 μL CCK-8試劑，避光，37 ℃條件中孵育1.5 h，使用酶標(biāo)儀在450 nm吸光度時的吸光度(A)值，以此來計算細胞的增值率。增值率=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。

1.6流式細胞儀檢測肝癌細胞凋亡情況 按5×105/mL密度將HepG2細胞種植在6孔板中，采用不同數(shù)量(0、3 000、6 000、9 000 個/孔)的原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)48 h后，徹底去除原頭節(jié)后，使用預(yù)冷的PBS沖洗干凈后，加入胰酶消化后收集細胞，分別加入PI和Annexin V-FITC抗體后，設(shè)置對照組，避光情況下上機檢測。

1.7實時熒光定量PCR檢測HepG2細胞中caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2的mRNA表達水平

使用上述方法處理后的細胞，Trizol法提取細胞中總RNA，調(diào)平后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存條件：37 ℃ 2 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，4 ℃保存。將所得cDNA進行實時熒光定量PCR，所用PCR引物序列見表1。擴增條件為:95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。使用2-△△Ct計算公式得出mRNA的表達量。

1.8Western Blot方法測定蛋白表達量 使用上述處理過的細胞加入RIPA細胞裂解液，獲取肝癌細胞中總蛋白樣品，用BCA的方法檢測蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后使各組濃度一致，應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，加入一抗、二抗，化學(xué)發(fā)光得出灰度值計算目的蛋白表達量。

表1 實時熒光PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

2 結(jié) 果

2.1肝癌細胞作為飼養(yǎng)細胞可以促進泡球蚴原頭節(jié)的存活和提高活性 隨著肝癌HepG2細胞濃度的增加，原頭節(jié)形態(tài)以及活性有著顯著變化。實驗組與對照組相比較，原頭節(jié)形態(tài)更穩(wěn)定，成活率更高，使用伊紅染色時，有飼養(yǎng)細胞存在的原頭節(jié)抗紅染能力越強，存活率為[(91.42±2.47)%]顯著高于無飼養(yǎng)細胞組[(73.10±4.68)%，t=-7.738，P<0.05]，見表2。

表2 飼養(yǎng)細胞與E.multilocularis共培養(yǎng)后E.multilocularis的存活情況Tab.2 Survival of E. multilocularis after co-culture with feeder cells

2.2肝癌細胞作為飼養(yǎng)細胞可以促進泡球蚴原頭節(jié)成囊 存在肝癌細胞作為飼養(yǎng)細胞時，原頭節(jié)成囊率[(66.72±2.02)%]顯著高于無飼養(yǎng)細胞組的成囊率[(30.21±2.25)%，t=11.228，P<0.01]。隨著定期更換飼養(yǎng)細胞時，囊泡的直徑會不斷變大。

2.3泡球蚴原頭節(jié)促進肝癌細胞增殖及抑制凋亡

2.3.1利用CCK8法檢測泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)48 h和72 h后肝癌細胞的增殖情況 將泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)48 h后，與無原頭節(jié)共培養(yǎng)組比較，實驗組(4.13±0.04,4.43±0.07,3.77±0.04)均促進肝癌細胞增殖(t=-130.912、-89.051、-134.067，P均<0.01)，濃度為9 000個/孔組較前兩組有所降低，但均高于對照組。將共培養(yǎng)時間增加到72 h時，實驗組(5.24±0.06,5.84±0.04,6.94±0.05)均高于對照組(t=-125.853、-206.432、-219.405，P均<0.01)。見圖1。

①P<0.01 vs 對照組 (0個/孔). 圖1 CCK8法檢測不同數(shù)量原頭節(jié)對肝癌HepG2細胞增殖情況Fig.1 CCK8 method for detecting the proliferation of HepG2 with different numbers of protoscolex

2.3.2Annexin V-FITC/PI 流式細胞術(shù)檢測原頭節(jié)抑制肝癌HepG2細胞凋亡情況 如圖2所示，檢測共培養(yǎng)48 h后的肝癌細胞凋亡情況，流式結(jié)果顯示：對照組凋亡率為(25.27±0.05)%，濃度為3 000個/孔組凋亡率為(17.28±0.10)%, 6 000個/孔組為(9.96±0.03)%, 9 000個/孔組為(18.78±0.07)%。與對照組相比，實驗組中3 000個/孔、6 000個/孔和9 000個/孔組肝癌HepG2細胞發(fā)生凋亡的比例均降低(t=18.829、31.523、11.644，P均<0.01)，但6 000個/孔組凋亡比例最低，見圖2。

①P<0.01 vs 對照組(0 個/孔)圖2 Annexin V-FITC/PI 流式細胞術(shù)檢測肝癌HepG2細胞凋亡情況Fig.2 Annexin V-FITC/PI flow cytometry detecting HepG2 cell apoptosis

2.3.3泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)后肝癌細胞中mRNA的變化 與對照組相比較，實驗組中Bcl-2表達升高(F=75.801，P<0.01)，而Bax、caspase3、caspase9、P21、P53表達降低(F=70.206、360.218、240.962、687.871、182.437，P均<0.01)，但發(fā)現(xiàn)濃度6 000個/孔組的促凋亡基因下降不明顯，而促增殖基因反而升高明顯。見圖3。

2.3.4原頭節(jié)與肝癌細胞共培養(yǎng)后可降低肝癌HepG2細胞的Bax、caspase3和caspase9表達，并促進Bcl-2表達 利用Western-blot檢測不同數(shù)量原頭節(jié)對HepG2中Bax、caspase3和caspase9的表達，均呈現(xiàn)不同程度的降低(F=703.092、48.490、968.834，P均<0.01)，但隨著原頭節(jié)數(shù)量的不斷增加Bcl-2的表達卻增加(F=103.726，P<0.01)，見圖4。說明原頭節(jié)可通過caspase通路及線粒體通路來影響HepG2細胞的凋亡。

①P<0.01 vs 對照組(0 個/孔)圖3 Real-Time PCR檢測凋亡相關(guān)分子caspase3、caspase9、Bax、Bcl-2、P21、P53的mRNA表達情況Fig.3 Real-time PCR detection of the mRNA expression of the apoptosis-associated molecules caspase3, caspase9, Bax, Bcl-2, P21 and P53

3 討 論

泡狀棘球蚴病雖是良性病變，但呈現(xiàn)惡性生長，較易侵襲和轉(zhuǎn)移，故生存率較低。原發(fā)性肝癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多階段的過程，需要基因改變和表觀遺傳的共同參與。而泡狀棘球蚴的生長發(fā)育是依賴于宿主環(huán)境而呈現(xiàn)浸潤性生長，研究表明不同動物種屬之間的細胞因子如胰島素、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β等不僅結(jié)構(gòu)上有明顯的同源性，而且在功能上也可以相互替代[10]。因此利用這一點宿主可能提供某些細胞因子為其生長提供幫助，而動物進化及生長最早是建立在細胞間通訊的基礎(chǔ)之上。有研究表明EGFR通路可參與泡狀棘球蚴生發(fā)層細胞的增殖和存活，抑制EGFR通路可誘導(dǎo)泡球蚴生發(fā)細胞的caspase3酶活性升高，出現(xiàn)凋亡特征[11]。研究團隊還發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制EGF所誘導(dǎo)的ERK磷酸化，可導(dǎo)致生發(fā)層細胞的凋亡，抑制其增殖[12]。泡狀棘球蚴甚至還表達G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)、蛋白酶、鐵離子通道等[13]。本研究發(fā)現(xiàn)泡球蚴原頭節(jié)的生長發(fā)育離不開飼養(yǎng)細胞，當(dāng)肝癌HepG2細胞與之共培養(yǎng)時，原頭節(jié)存在顯著的高存活率，延長了泡球蚴原頭節(jié)在體外培養(yǎng)的時間，且更易成囊成泡，為后期研究生發(fā)層細胞提供可靠來源。發(fā)生此現(xiàn)象的原因可能是肝癌HepG2細胞分泌了某些細胞因子作用于泡狀棘球蚴原頭節(jié)的對應(yīng)受體導(dǎo)致相關(guān)通路的激活，以此來促進其生長發(fā)育。

①P<0.01 vs 對照組(0 個/孔)圖4 Western-blot 檢測HepG2中Bax、Bcl-2、caspase3和caspase9的表達Fig.4 Western-blotting detection of the expression of Bax, Bcl-2, caspase3 and caspase9 in HepG2 cells

Romic B等[14]對肝細胞癌(HCC)合并肝包蟲病的研究進行了系統(tǒng)回顧，分析了HCC癌變的性質(zhì)，以了解肝癌變的診斷特征并作出合適的治療。Kübeck M等[15]報告了目前肝癌合并AE的病例，闡述了泡狀棘球蚴可導(dǎo)致慢性肝實質(zhì)性改變，以此來促進肝癌的發(fā)生。上述研究僅局限于通過臨床病例進行分析，并未有明確的分子機制來闡明發(fā)生的原因。Stadelnan B等[16]發(fā)現(xiàn)E.multilocularisPGI與人類的PGI在核酸序列上有86%的同源性，這種酶可作為一種生長因子在肝癌發(fā)生上起重要作用。另有研究人員發(fā)現(xiàn)AE可影響人類的免疫系統(tǒng)，以此來增加惡性腫瘤發(fā)生的風(fēng)險。caspase3對于腫瘤的凋亡是一個重要分子，剪切的caspase3是促進凋亡的主要裂解酶，而Bcl-2可抑制caspase3的活性，Bax與Bcl-2同源為一種水源性相關(guān)蛋白，Bax的過度表達可拮抗Bcl-2的保護作用[17]。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)原頭節(jié)存在時，CCK8檢測結(jié)果顯示共培養(yǎng)時肝癌細胞表現(xiàn)出活躍增殖現(xiàn)象，且流式結(jié)果與CCK8一致表現(xiàn)出凋亡減少，顯著低于對照組，但濃度6 000 個/孔組的凋亡率低于3 000 個/孔組與9 000 個/孔組，發(fā)生這種原因的可能是9 000 個/孔組原頭節(jié)密度較大，影響了肝癌HepG2細胞的代謝。實驗組的P21、P53、caspase3、caspase9及Bax低于對照組，Bcl-2高于對照組，隨著原頭節(jié)數(shù)量的增加，增殖呈現(xiàn)上升趨勢，表明無論從caspase家族或線粒體通路都是原頭節(jié)抑制肝癌細胞的凋亡而促進增殖，這說明原頭節(jié)可能分泌某些促增殖因子例如EGF、OPN等，它們作用于肝癌細胞表面受體導(dǎo)致此現(xiàn)象的出現(xiàn)。

本實驗是研究泡球蚴原頭節(jié)與肝癌細胞的相互作用，可為后期體外培養(yǎng)原頭節(jié)及生發(fā)層細胞提供依據(jù)，也可為預(yù)防泡球蚴病合并肝癌患者復(fù)發(fā)或惡化提供理論依據(jù)。研究證實了泡球蚴原頭節(jié)可促進肝癌細胞的增殖而抑制其凋亡，這可為后期研究提供理論依據(jù)以及組織損傷修復(fù)的新藥開發(fā)奠定基礎(chǔ)。但本研究對具體分泌了哪些因子導(dǎo)致該現(xiàn)象的產(chǎn)生尚無定論，機制尚未闡明。因此需要進一步探索以解釋更深的機制，也需進一步加強泡球蚴原頭節(jié)生物制劑的基礎(chǔ)實驗和臨床研究。

利益沖突：無