植物黃酮抗骨質(zhì)疏松作用的研究進展

屈杭帥 鄭敬民

浙江省臺州醫(yī)院，浙江 臺州 317000

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種全身性骨代謝疾病，以骨量降低、骨組織微觀結構破壞為特征，造成骨強度降低、骨脆性增加。國際骨質(zhì)疏松基金會研究報告指出，中國骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率約為7 %，其中大于50歲的女性患病率高達50 %，預估 2020年至2050年中國患有骨折疏松癥人數(shù)約為2.9億[1]。長期以來，人們認為更年期雌激素缺乏或雌激素和雄激素丟失是導致骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生的首要原因[2]。但近年研究證據(jù)表明，慢性炎性反應、骨免疫異常[3]、氧化應激[4]等發(fā)病機制均可通過影響成骨細胞和破骨細胞的來源、增殖、分化、凋亡及其功能，最終導致骨質(zhì)疏松癥。

目前臨床用于抗骨質(zhì)疏松的藥物多為抑制骨吸收類制劑，臨床療效明確，但不良反應也愈發(fā)引起重視。如雙膦酸鹽類藥物會對胃腸道造成損傷，還會引起下頜骨壞死[5]；雌激素被廣泛用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，但增加了絕經(jīng)后婦女中風、血栓栓塞、腿部痙攣和血管運動癥狀的發(fā)生率[6]。鑒于目前合成性骨質(zhì)疏松抑制劑的不良副作用，開發(fā)新的靶向藥物具有迫切的現(xiàn)實意義。黃酮類化合物(Flavonoids) 廣泛存在于自然界的植物中，是植物中的次生代謝產(chǎn)物，因此也稱植物黃酮，主要以結合態(tài)或自由態(tài)形式廣泛存在于蔬菜、水果、豆類和茶葉等食源性植物中。植物黃酮已被證實具有抗骨質(zhì)疏松活性，且不良反應小、價格低廉、作用機制廣泛，是安全理想的天然抗骨質(zhì)疏松用藥。多年來，國內(nèi)外研究者們已從植物中篩選出大量抗骨質(zhì)疏松成分，研究較多的有骨碎補總黃酮、淫羊藿總黃酮、大豆異黃酮等，相應活性成分有柚皮苷、淫羊藿苷、大豆苷元等，其中骨碎補黃酮和淫羊藿黃酮已被開發(fā)并應用于臨床治療。本文就植物黃酮在細胞分子水平、動物研究、臨床應用和網(wǎng)絡藥理學方面的最新研究結果進行綜述，為進一步挖掘植物黃酮中高活性的成分提供研究思路和參考依據(jù)。

1 植物黃酮防治骨質(zhì)疏松癥細胞水平及相關信號通路的研究

1.1 植物黃酮對骨髓間充質(zhì)干細胞及相關信號通路的影響

骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是從骨髓中分離得到的具有很強的多向分化能力和增殖活性細胞，正常分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞，在骨代謝中發(fā)揮著重要作用[7]。但在老年時，BMSCs向成骨細胞的分化程度相對較低，骨形成減少，導致老年骨質(zhì)疏松[8]。此外，骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老也是老年性骨質(zhì)疏松癥的重要原因[9]，但確切機制尚不清楚。因此，BMSCs的異常分化和衰老導致成骨細胞數(shù)量減少、骨形成減少，從而導致老年骨質(zhì)疏松癥[10]。

二氫楊梅素(DMY)是一種黃酮類化合物，Zhang等[11]采用DMY誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)DMY (0.1～50 μm)對細胞增殖無殺傷作用，但能提高堿性磷酸酶活性、成骨細胞特異性基因表達和礦物沉積，還能增強β-catenin的活性表達，降低Dickkopf-1(DKK-1)和硬化劑的表達。Wnt/β-catenin信號通路抑制劑(Dkk-1和β-catenin特異性siRNA)可降低DMY誘導的骨礦生成。這些結果表明，DMY在體外通過Wnt/β-catenin信號通路促進人骨髓間充質(zhì)干細胞的成骨分化。槲皮素是一種植物類黃酮，具有雌激素作用，Pang等[7,12]用槲皮素處理骨髓間充質(zhì)干細胞。CCK-8、ALP、ARS染色和Western blot結果表明，槲皮素促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化，增強骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、Smad1、Smad4、runt相關的轉錄因子2(RUNX2)、osterix(OSX)、骨橋蛋白(OPN)信號通路的激活和Smad1磷酸化。Zhang等[13]發(fā)現(xiàn)槲皮素還能通過miRNA206/Cx 43途徑促進BMSCs的成骨分化。Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)雙氫睪酮類黃酮化合物柚皮苷，通過上調(diào)microRNA-20a的表達水平來調(diào)控成骨水平，并下調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ(pPARγ)的表達水平，促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖，且呈劑量依賴性。此外，柚皮苷顯著提高OC、ALP和I型膠原的mRNA表達水平。

1.2 植物黃酮對破骨細胞、成骨細胞及相關信號通路的影響

骨處于不斷的重塑狀態(tài)，這對于維持正常的骨骼結構和功能是非常重要的。因此，失衡會導致骨質(zhì)疏松等疾病。許多類型的細胞和因子參與了骨重塑的過程。成骨細胞和破骨細胞是參與這些進展的兩個主要細胞，破骨細胞負責骨吸收，成骨細胞負責新骨形成[14]。

柳穿魚黃素是一種主要存在于大薊科飛機草等植物當中的黃酮類化合物。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn)，在骨髓來源的巨噬細胞(BMMs)培養(yǎng)過程中，柳穿魚黃素抑制核因子kappa B配體(RANKL)在骨髓源巨噬細胞(BMMs)培養(yǎng)中誘導破骨細胞形成，這表明這種天然產(chǎn)物可以通過抑制RANKL信號下行級聯(lián)作用于破骨細胞前體。此外，在Akt和有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信號共刺激作用下，柳穿魚黃素通過削弱活化T細胞胞漿1 (NFATc-1)和c-Fos的核因子，抑制RANKL介導的破骨細胞形成。這些發(fā)現(xiàn)表明，柳穿魚黃素可能通過阻斷破骨細胞的活化而發(fā)揮抗吸收作用。Al Mamun等[16]研究了在小鼠原代培養(yǎng)的破骨細胞中，長柄菊類黃酮(TPF) 對RANKL誘導的破骨細胞分化的影響，并在體外探索了其分子機制。研究發(fā)現(xiàn)TPF降低了抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)陽性多核破骨細胞的活性，抑制了TRAP和堿性磷酸酶(ACP)的活性，降低了破骨細胞分化基因的表達，包括組織蛋白酶K、金屬蛋白酶-2 (MMP-2)、MMP-9、MMP-13和破骨細胞相關受體(OSCAR)的表達。此外，TPF顯著降低c-Fos、活化T細胞胞質(zhì)1 (NFATc1)核因子、活化蛋白-1 (AP-1)等轉錄因子的表達水平。這些結果表明TPF抑制了破骨細胞的分化和活性。山奈酚是從許多食用植物和傳統(tǒng)藥物中提取的多酚黃酮類化合物，Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚對自噬相關因子p62/SQSTM1的表達有強烈的抑制作用。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)僅應用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制自噬時，破骨細胞和凋亡相關因子沒有受到顯著影響。然而在用山奈酚處理細胞后，這些因子抑制自噬并激活細胞凋亡。因此推測山奈酚通過降解p62/SQSTM1來抑制自噬激活的細胞凋亡。進一步研究p62/SQSTM1基因作為自噬機制的靶點，可能有助于闡明山奈酚在骨代謝紊亂治療中的潛在作用。Adhikary等[18]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚通過BMP 2和ERK途徑抑制地塞米松誘導的成骨細胞凋亡，促進成骨細胞的分化和增殖。Kim等[19]驗證高良姜素、淫羊藿苷、山奈酚和槲皮素等黃酮類化合物在低劑量時可以增加人SV40轉染成骨細胞(hFOB 1．19)的增殖。高良姜素、淫羊藿苷、山奈酚、槲皮素可減少唑來膦酸鈉誘導的細胞損傷，尤其高良姜和山奈酚對唑來膦酸具有顯著的細胞保護作用。

2 植物黃酮防治骨質(zhì)疏松癥動物水平的研究

骨質(zhì)疏松癥主要類型是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、廢用性骨質(zhì)疏松癥和糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥[20]。為了避免實驗研究對人體的各種傷害，同時能在較短的時間內(nèi)成功地模擬疾病的病理狀態(tài)，科學家們構建骨質(zhì)疏松動物模型，為人類認識骨質(zhì)疏松的病理和藥物的作用效果提供一種手段。目前研究中常用的骨質(zhì)疏松動物模型，一般分為4大類：激素干預型、廢用型、營養(yǎng)型，其他類型等骨質(zhì)疏松模型，實際上應用最廣泛的是激素干預型中通過去卵巢誘發(fā)的骨質(zhì)疏松動物模型[21]。

Xu等[22]探討淫羊藿苷聯(lián)合脂肪源性干細胞對絕經(jīng)后卵巢切除后骨質(zhì)疏松大鼠模型的治療作用。采用ELISA法測定血清中堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、骨保護素和骨鈣-羧谷氨酸蛋白水平。采用雙能X線骨密度儀測定骨密度。實驗結果顯示淫羊藿苷聯(lián)合干細胞顯著降低血清中堿性磷酸酶、酒石酸抗性酸性磷酸酶和骨鈣素-羧谷氨酸蛋白水平，顯著提高骨保護素水平，顯著提高腰椎骨密度，增強了股骨的生物力學特性，包括最大彎曲載荷、彎曲剛度和骨折能量。結果提示淫羊藿苷與干細胞聯(lián)合改善大鼠骨質(zhì)疏松所致的骨量減少和骨組織微結構的破壞。Or?oli等[23]通過分析實驗動物的股骨骨密度、骨鈣磷總水平、股骨幾何和物理特征以及肝、腎細胞脂質(zhì)過氧化和谷胱甘肽水平評估植物黃酮對健康大鼠骨骼系統(tǒng)的影響，結果發(fā)現(xiàn)槲皮素、白楊素、柚皮素3種植物黃酮均能改善維甲酸誘導的骨重系數(shù)、骨長、骨徑、骨灰分含量和鈣磷含量的降低，降低維甲酸誘導的氧化應激和骨質(zhì)流失。Kai等[24]采用懸尾法建立骨質(zhì)疏松模型，骨密度測定結果表明，葛根素能顯著提高后肢懸吊引起的脛骨和椎骨的骨密度。力學參數(shù)實驗表明，葛根素能有效提高脛骨和椎骨的最大載荷和彈性模量。酸性復紅染色結果顯示，葛根素組骨小梁數(shù)量增加，骨小梁厚度變厚，骨分離變小，后懸術后骨微結構得到明顯改善。血清生化指標顯示葛根素可促進骨形成指數(shù)骨鈣。

3 植物黃酮防治骨質(zhì)疏松癥臨床個體水平的研究

近年來研究發(fā)現(xiàn)，植物黃酮在臨床防治OP效果顯著，研究較多的是骨碎補黃酮和淫羊藿黃酮。強骨膠囊作為治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的代表性中成藥，其有效基礎物質(zhì)是骨碎補總黃酮。楊鋒等[25]將合并牙列缺損或缺失的骨質(zhì)疏松患者隨機分為實驗組(強骨膠囊治療組)和對照組(阿侖膦酸鈉片治療組)兩組，每組各23例。實驗結果發(fā)現(xiàn)在藥物治療后第3、6個月后，實驗組牙槽骨的頰(唇)側皮質(zhì)骨密度較對照組顯著增高，表明骨碎補黃酮能增加OP患者牙槽骨骨密度水平，且療效高于阿侖膦酸鈉片。張金虎[26]將110例KOA患者隨機分成對照組和治療組，每組55例，治療組給予骨碎補總黃酮聯(lián)合硫酸氨基葡萄糖治療，對照組單純給予硫酸氨基葡萄糖治療。經(jīng)過3個月的藥物治療，通過比較患者的Lequesne評分、VAS評分較、CTX-1、TRACP-5b、TNF-α和TGF-β1，發(fā)現(xiàn)治療組治療有效率顯著高于對照組。表明骨碎補總黃酮聯(lián)合硫酸氨基葡萄糖治療膝骨關節(jié)炎具有較好的臨床效果。吳浩然等[27]以黃芪桂枝五物湯合補骨脂、骨碎補、杜仲三味小方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變合并骨質(zhì)疏松癥，臨床效果滿意。樓興法[28]研究發(fā)現(xiàn)老年骨質(zhì)疏松性橈骨遠端骨折患者輔以淫羊藿總黃酮治療后，骨折愈合時間有效縮短，腕關節(jié)功能恢復較快，骨質(zhì)疏松得到改善。RCE是一種富含異黃酮苷元和益生菌的新型紅三葉草提取物，Lambert等[29]發(fā)現(xiàn)RCE攝入與補充(鈣、鎂和骨化三醇)相結合比單獨補充更有效，更加有效地減輕雌激素缺乏引起的骨密度損失，改善骨周轉率，促進有利的雌激素代謝產(chǎn)物，并刺激絕經(jīng)后骨質(zhì)減少的婦女產(chǎn)生馬酚。

4 植物黃酮防治骨質(zhì)疏松癥網(wǎng)絡藥理學方面的研究

中藥復方由多種天然產(chǎn)物配伍而成，存在成分復雜、靶點和機制不清，因此研究難度大。網(wǎng)絡藥理學的目的是通過網(wǎng)絡分析和網(wǎng)絡驗證，實現(xiàn)生物活性化合物與目標之間的相互作用和目標之間的相互作用，從而發(fā)現(xiàn)和驗證關鍵節(jié)點。網(wǎng)絡藥理學研究主要包括目標發(fā)現(xiàn)、生物活性化合物篩選、毒性評價、機理研究和質(zhì)量控制研究[30]。將網(wǎng)絡藥理學應用在中藥復方研究，能幫助解決傳統(tǒng)中藥復方機制研究的難題，使先前難以定性的機制得以預測和驗證。

淫羊藿葉是治療骨質(zhì)疏松癥最常見的中草藥之一，柯志鵬等[31]通過成分-靶網(wǎng)絡分析表明，黃酮類化合物具有雌激素樣活性、抗氧化和清除自由基的活性，在防治骨質(zhì)疏松方面具有一定的作用。另一方面，高度靶點主要與性激素、破骨細胞分化、骨基質(zhì)降解、藥物靶網(wǎng)活性氧等有關。Xu等[32]通過有效成分篩選、藥物相似性評價、中藥特征映射、靶標預測、驗證和網(wǎng)絡分析，建立了淫羊藿類藥物與雌激素抗骨質(zhì)疏松癥關系的系統(tǒng)藥理學模型。分析結果表明，淫羊藿類藥物通過直接調(diào)節(jié)雌激素相關的11個靶點和一組靶蛋白在5個雌激素相關通路上發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。馬江濤等[33]基于網(wǎng)絡藥理學，通過TCMSP等平臺篩選得到骨碎補治療骨質(zhì)疏松性骨折的14個有效成分和51個中藥-疾病靶標，探討了骨碎補治療骨質(zhì)疏松性骨折的作用機制。仙靈骨葆膠囊具有滋強筋壯骨功效，主治瘀血阻絡所致骨質(zhì)疏松癥。綦向軍等[34]基于網(wǎng)絡藥理學獲取仙靈骨葆115種活性成分，活性成分所涉及的靶標共有301個。黃酮類化合物(槲皮素、山奈酚)作為其中核心活性成分，主要通過調(diào)節(jié)OPG/RANK/RANKL，抑制破骨細胞，促進成骨細胞分化；淫羊藿苷元可增強成骨細胞活性。肉蓯蓉(Cistache tubulosa，CT)是一種應用廣泛的中藥，分別被廣泛應用于骨質(zhì)疏松癥(OP)和阿爾茲海默癥(AD)的治療[35]。Li等[35]通過整合多個數(shù)據(jù)庫和網(wǎng)絡藥理學層面的廣泛分析，篩選出CT中22種與81例OP和AD 相關靶點密切相關的雙效活性成分，進一步分析發(fā)現(xiàn)其中的黃酮類化合物具有較好的生物活性。

5 展望

細胞、動物實驗和臨床實踐表明，植物黃酮對骨質(zhì)疏松癥有顯著的治療作用。植物黃酮的有效成分具有多種多樣的化學結構，包括骨碎補總黃酮、淫羊藿總黃酮、大豆異黃酮等。植物黃酮抗骨質(zhì)疏松作用機制涉及多種調(diào)控途徑，如Wnt/β-catenin、BMP/Smad、MAPK通路和RANKL/OPG系統(tǒng)。因此利用網(wǎng)絡藥理學加深對植物黃酮防治骨質(zhì)疏松的藥理學研究，篩選植物黃酮中有效核心成分并開發(fā)新型抗骨質(zhì)疏松藥物，在抗骨質(zhì)疏松臨床治療中具有廣闊的應用前景。