張帆 梁清洋 韓超 劉佳* 唐毓金*

1.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨外科，廣西 百色 533000 2.右江民族醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，廣西 百色 533000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種與衰老相關的骨骼疾病，包括骨質(zhì)和骨骼結(jié)構(gòu)的惡化，從而增加骨折的風險。OP是我國最常見的慢性疾病之一，在老年人的骨疾病中居于首位。社會老齡化的日益加重，使我國OP患者數(shù)量突破了1億，預計30年后，患者數(shù)量極有可能增長一倍。流行病學調(diào)研[1]顯示，年齡超過50歲的人群OP患病率為19.2 %，其中男性為6.0 %，女性為32.1 %，城市地區(qū)為16.2 %，農(nóng)村地區(qū)為20.7 %，年齡超過60歲的人群患病率更是超過30 %?？梢缘贸?，隨著未來我國老年人口數(shù)的不斷增加，骨質(zhì)疏松癥將持續(xù)成為一場公共衛(wèi)生和醫(yī)療保健領域的嚴峻挑戰(zhàn)。

成骨細胞(osteoblasts，OB)起源于骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSC)，是存在于骨組織中，起到接受刺激和發(fā)揮效應作用的細胞，它最終可以分化為成熟的骨細胞。各種因素的刺激都可以造成細胞分化的增殖或凋亡，產(chǎn)生許多骨骼相關的疾病[2]。破骨細胞(osteoclasts，OC)，由Kolliker于1873年首次發(fā)現(xiàn)，來源于單核-巨噬細胞系，主要負責調(diào)控機體的骨吸收。破骨細胞還通過分泌可溶性因子(包括S1P、CTHRC1和C3)影響成骨細胞的形成和分化。成骨細胞/破骨細胞軸功能異常在OP的發(fā)展中起關鍵作用，只有成骨和破骨達到一種穩(wěn)態(tài)，才能使機體骨量維持正常，否則，就容易發(fā)生OP、骨硬化癥等骨病。

1 Wnt信號通路的組成及細胞內(nèi)調(diào)控機制

自1982年努斯(R Nusse)和瓦爾莫斯(HE Varmus)首次發(fā)表涉及Wnt家族的第一篇文章以來，對Wnt信號的探索逐漸深入，涉及細胞的分化、維持、免疫、應激、癌變和凋亡，機體的生長、發(fā)育、疾病、衰老與死亡等多個方面。Wnt是一大類糖蛋白的統(tǒng)稱，它們多位于細胞外，以結(jié)構(gòu)中存在大量的半胱氨酸為特征。

Wnt信號轉(zhuǎn)導包括經(jīng)典的β-catenin途徑、平面細胞極性途徑和Wnt/Ca2+途徑等。本文重點關注依賴β-catenin的經(jīng)典通路。研究[3]發(fā)現(xiàn)組成經(jīng)典Wnt信號通路的傳導分子包括Wnt分泌蛋白、跨膜受體卷曲蛋白、松散蛋白、β-連環(huán)蛋白、糖原合成激酶3β、軸蛋白、T細胞因子/淋巴增強因子、酪蛋白激酶1、低密度脂蛋白受體依賴性蛋白5/6等。β-連環(huán)蛋白是重要的功能蛋白之一，早期發(fā)現(xiàn)其具有粘附分子的作用，維持細胞膜的穩(wěn)定，還涉及重要的細胞活動-信號轉(zhuǎn)導，它是介導成骨細胞生長和分化的關鍵因子。其中β-catenin的細胞核內(nèi)含量的變化是信號轉(zhuǎn)導的關鍵步驟。

Wnt配體是一類分泌型糖蛋白[4]，含有19個胞外配體的大家族，可以同時激活Wnt經(jīng)典和非經(jīng)典途徑，從而誘導復雜信號網(wǎng)絡的形成。首先，Wnt蛋白先粘附到細胞表面，與Frz和LRP5 /6受體復合物相結(jié)合，再繼續(xù)活化細胞膜內(nèi)的Dsh蛋白，Dsh蛋白活化后可抑制GSK3β，使β-catenin可以和鈣粘附蛋白E組成復合體，然后β-catenin不斷地積聚，向細胞核定向移動，主動的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF，形成基因轉(zhuǎn)錄的復合體，最后在相關輔助因子的作用下啟動轉(zhuǎn)錄過程，調(diào)控靶基因的表達，產(chǎn)生生物學效應。這樣，信號就由Wnt蛋白這一個位點開始轉(zhuǎn)導到整個通路上，然后對整個機體產(chǎn)生網(wǎng)狀的效應。

2 對成骨細胞的調(diào)控作用

成骨細胞的功能主要是分泌膠原纖維和蛋白多糖，在骨形成階段發(fā)揮作用。在骨骼受到損傷時，機體首先反應是成骨細胞增殖、成熟，形成新生的骨組織，這個過程受到各種因素的調(diào)控，如果成骨受到影響就可能導致骨質(zhì)疏松。

研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)Wnt3a可以激活β-catenin，在體外Wnt3a等蛋白可以抑制成骨細胞的凋亡。彭楊茜子等[5]發(fā)現(xiàn)Wnt3a可以促進小鼠成肌細胞(C2C12)的增殖、提高ALP的活性和加強骨保護素的表達，最終促進成骨。基因研究[6]發(fā)現(xiàn)KLF14在BMSC中高表達，抑制KLF14表達可促進BMSC的成骨分化，Wnt3a啟動子與KLF14相互作用，導致Wnt3a和Wnt信號通路中下游成骨相關靶基因的表達下降。也有研究[7]認為Wnt3a與骨形態(tài)發(fā)生蛋白9具有協(xié)同作用，共同加強堿性磷酸酶在間充質(zhì)干細胞中的表達。Wnt3a也可以調(diào)控雌激素受體的表達，雌激素正向調(diào)節(jié)BMSC向成骨方向分化。

Bennett等[8]培育人骨鈣素啟動子過表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)股骨骨密度、骨體積分數(shù)和骨小梁數(shù)較野生型小鼠顯著增高，而成骨細胞凋亡或破骨細胞數(shù)量和活性無明顯變化，得出Wnt10b主要通過刺激成骨細胞的生成來增加骨量。Wnt16被認為是皮質(zhì)骨的重要調(diào)節(jié)蛋白，可以增加體內(nèi)皮質(zhì)骨骨小梁的質(zhì)量和強度。魏雙雙等[9]研究發(fā)現(xiàn)將Wistar雌性大鼠切除雙側(cè)卵巢后，雌激素分泌減少，導致骨質(zhì)疏松，補充外源性雌激素4個月后，檢測Wntl6mRNA表達升高，說明雌激素也可能通過Wnt16進一步調(diào)節(jié)成骨。Wnt5a是Wnt家族的非典型成員，既往研究僅涉及非經(jīng)典Wnt途徑。實驗中，構(gòu)建Wnt5a-/-基因小鼠，發(fā)育成熟后小鼠表現(xiàn)出低骨密度，骨礦化減少[10]。Wnt5a還可以抑制β-catenin信號，降低特異性周期蛋白-D1的水平進而抑制Wnt3a。新的一項研究[11]表明它也可以影響ROCK的活性來促進ALP活性升高，提高RUNX2和骨鈣素基因的表達，下調(diào)成脂標志物等，可能影響經(jīng)典Wnt通路。同時，Wnt信號在成骨超過正常時，自身的促進成骨作用減弱以維持機體的骨平衡[12]。

3 對破骨細胞的調(diào)控作用

破骨細胞是一種非傳統(tǒng)意義的多核巨噬細胞，通過單核前體細胞融合形成，與骨吸收、骨重建密切相關。破骨細胞分化成熟的過程受到多種細胞因子的調(diào)控，Wnt信號轉(zhuǎn)導通路激活后，可以調(diào)控破骨細胞的表達。細胞研究[13]表明β-catenin和TCF蛋白一樣，都可以調(diào)節(jié)存在于成骨細胞中具有抑制破骨細胞分化作用的骨保護素的表達。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型，將β-catenin基因敲除后，發(fā)現(xiàn)破骨細胞表達增加，小鼠表現(xiàn)重度骨質(zhì)疏松，提示W(wǎng)nt信號可能是負向調(diào)控破骨細胞的分化來維持骨穩(wěn)態(tài)。

Wnt3a間接調(diào)控破骨細胞。研究[14]證實Wnt3a可以通過成骨細胞調(diào)控RANKL的表達，來抑制破骨細胞生成。RANKL/OPG/RANK信號途徑是破骨細胞形成和活化的主要調(diào)控系統(tǒng)。RANKL是破骨細胞分化和骨吸收的關鍵介質(zhì)[15]。成骨細胞譜系細胞(包括成骨細胞和骨細胞)表達RANKL，RANKL受多種不同因素的調(diào)節(jié)，包括激素，細胞因子和機械力等。RANK的化學本質(zhì)是一種跨膜蛋白，在單核/巨噬細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)。OPG是一種腫瘤壞死因子受體(TNFR)，一種糖蛋白，存在形式有分子質(zhì)量為60 ku的單體和分子質(zhì)量為120 ku的同源二聚體。OPG的作用是直接抑制RANK/RANKL復合體的活性，也可通過與RANK競爭性結(jié)合RANKL，間接抑制骨吸收。Kondo等[16]發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素通過下調(diào)OPG的表達，抑制Wnt信號通路從而造成骨量下降。人工敲除小鼠OPG基因，小鼠會發(fā)生骨質(zhì)疏松癥，如果該基因過度表達，將可能導致石骨癥。目前人工重組OPG、RANKL單克隆抗體已應用于臨床[17]。

Wnt5a可以激活經(jīng)典Wnt信號通路，也可以直接作用于破骨細胞[18]，成骨細胞及滑膜細胞分泌的Wnt5a與破骨細胞前體細胞中Ror2結(jié)合，共同激活JNK，進而c-Jun被招募到RANK啟動子Sp1，促進RANK的表達，從而增強破骨細胞生成。Wnt16通過非經(jīng)典途徑抑制T細胞核因子(nuclear factor of activated Tcells 1，NFAT1)激活，實驗中如果將已被特異性敲除Wnt16(Wnt16-/-)的成骨細胞在1α,25-二羥維生素D3誘導條件下與破骨細胞共同培養(yǎng)，可以發(fā)現(xiàn)破骨細胞的分化增強，這進一步證實Wnt16負向調(diào)控破骨細胞的形成[19]。另外，Wnt16也可以激活MC3T3-E1細胞(小鼠前成骨細胞)中的Wnt/β-catenin信號，誘導OPG的表達，進而抑制RANK-RANKL相互作用間接抑制破骨細胞分化。由此，推斷Wnt蛋白在破骨細胞不同階段可能都具有調(diào)控功能。

4 Wnt信號異常對OP發(fā)生發(fā)展的作用

人體骨骼系統(tǒng)持續(xù)不斷的進行著骨吸收與骨重建，這個動態(tài)循環(huán)中，破骨細胞分化成熟后進行骨吸收，成骨細胞負責形成新生的骨質(zhì)。成骨細胞和破骨細胞通過直接的細胞間接觸或分泌蛋白相互溝通，以調(diào)節(jié)細胞行為、存活和分化。成骨細胞發(fā)生退變或破骨細胞過度活躍都會導致骨的微細結(jié)構(gòu)和生物力學的改變，從而導致OP[20]。Wnt/β-catenin信號的兩個抑制劑Dickkopf-1(DKK-1)和SOST在骨穩(wěn)態(tài)中起著關鍵作用，其不僅是藥物調(diào)節(jié)的潛在靶標，還是可溶性的生物標志物。

DKK的研究主要涉及骨代謝和腫瘤等領域。研究最成熟是DKK-1[21]，它是含有2個富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的一種分泌性糖蛋白，通過與Wnt競爭性結(jié)合LRP5/6受體，來阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而抑制骨形成。一項國外大數(shù)據(jù)臨床研究發(fā)現(xiàn)OP患者血清DKK-l顯著高于正常組。Li等[22]發(fā)現(xiàn)用表達BMP9的腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠卵泡干細胞后，給予高濃度的DKK-1可以減少BMP9轉(zhuǎn)導的大鼠卵泡干細胞的成骨分化，而低濃度的DKK-1則促進了BMP9誘導的骨形成，這是通過經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路共同作用的?；蜓芯縖23]表明，小鼠DKK-1基因的表達水平與其本身的的骨量呈負相關，DKK-1水平越高，越使骨組織的微細結(jié)構(gòu)被破壞，骨強度減低，骨量減少，提示我們DKK-1檢測可以用于評估骨質(zhì)疏松的嚴重程度。新的研究[24]揭示骨質(zhì)疏松也與鐵的過載有關，通過小鼠動物模型研究發(fā)現(xiàn)，在正常情況下經(jīng)典Wnt信號通路中的β-catenin與下游TCF/LEF家族中TCF4/TCF7L2分子結(jié)合促進骨形成。在鐵蓄積情況下β-catenin與下游TCF4/TCF7L2分子結(jié)合減少，與FOXO3a結(jié)合增多，因此會抑制經(jīng)典Wnt信號通路，抑制骨形成進而導致骨質(zhì)疏松。所以，在臨床上可以使用鐵螯合劑，例如去鐵胺、乳鐵蛋白等改善骨質(zhì)疏松。

硬化蛋白(Sclerostin)是骨骼中的天然激素，一種由骨細胞合成的抗合成蛋白。在骨骼中起分解代謝作用，并通過增加破骨細胞的骨吸收參與骨代謝的調(diào)節(jié)。硬化蛋白水平隨年齡增長而增加，其可用性增加的結(jié)果可能是Wnt信號級聯(lián)的破壞。研究[25]發(fā)現(xiàn)，SOST基因小鼠的皮質(zhì)骨中硬化蛋白的表達比小梁骨中的表達更明顯。用抗RANKL抗體治療C57BL/6小鼠后，小梁骨中硬化蛋白陽性細胞數(shù)量增加，而小梁骨中β-catenin陽性細胞數(shù)量和骨形成減少，說明骨小梁中硬化蛋白的表達受抑制可以促進骨轉(zhuǎn)換。Miyatake等[26]發(fā)現(xiàn)，IL-1β在OA晚期誘導軟骨形成分化，并促進終末鈣化。硬化蛋白在晚期可以恢復IL-1β誘導的β-catenin信號的上調(diào)，在維持關節(jié)穩(wěn)態(tài)中起關鍵作用。Ohsugi等[27]發(fā)現(xiàn)，激光的生物刺激作用抑制了原代成骨細胞中SOST的表達。激光通過抑制硬化蛋白表達而不引起炎癥，可能成為骨質(zhì)疏松癥的一種新治療方法。羅莫珠單抗(Romosozumab)是一種人源化單克隆抗體，可特異性地結(jié)合骨硬化蛋白，拮抗其對骨代謝的負向調(diào)節(jié)作用，保證Wnt/β-catenin信號通路的正常傳導。

5 小結(jié)與展望

骨質(zhì)疏松癥的藥物按原理不同可分為骨吸收抑制劑、骨形成促進劑等[28]。雙膦酸鹽類是傳統(tǒng)的一線用藥，較常見的是阿侖膦酸鈉，用藥后破骨細胞活性受到抑制，骨形成增加，機體骨量升高，但也有研究表明其有導致骨折不愈合的風險。甲狀旁腺素(PTH)[29]是目前較新的骨形成促進劑，PTH給藥后可提高血清鈣水平。實驗發(fā)現(xiàn)，PTH可通過β-catenin信號阻斷糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)對大鼠BMSC的負性成骨作用，顯著增加骨量[30]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，與安慰劑和替代性骨質(zhì)疏松療法相比，使用Romosozumab后，骨礦物質(zhì)增加，新發(fā)椎體骨折顯著減少[31]。Romosozumab使用后短期就有促進骨形成的作用，長期應用還可以減少骨吸收，可能為臨床上治療骨質(zhì)疏松提供新的方向。另外，Denosumab一種新的RANKL中和抗體的出現(xiàn)，表明應用Wnt通路靶點的抑制劑和中和抗體在治療OP方面具有嶄新的前景[32]。動物研究[33]中，構(gòu)建骨質(zhì)疏松性骨折大鼠模型后，發(fā)現(xiàn)BMSC組大鼠骨密度恢復快、力學負荷明顯改善和骨折線愈合良好，表明骨髓間充質(zhì)干細胞的移植也可能治療骨質(zhì)疏松。Li等[34]對比糖尿病骨質(zhì)疏松癥和對照組C57BL/6小鼠高級糖基化終產(chǎn)物的變化，發(fā)現(xiàn)AGEs可以通過激活DNA甲基化并抑制β-catenin途徑來抑制脂肪干細胞的成骨分化能力，證實DNA甲基化可以增強骨修復和促進骨再生。

綜上所述，Wnt/β-catenin信號通路可以調(diào)節(jié)與骨相關的生物信息信號傳遞，還有更多的預防和治療骨質(zhì)疏松的潛在藥物靶標尚未被發(fā)現(xiàn)。