感音神經(jīng)性耳聾分子機(jī)制的研究進(jìn)展*

陳海軍 孫宗潤 郭 巖 郝佳琦 高國慧 張 瀟 王子行 尹海燕△（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院， 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，濟(jì)寧 7067）

耳聾是人類最普遍、最常見的致殘性疾病之一，多數(shù)為感音神經(jīng)性耳聾，主要表現(xiàn)為耳蝸毛細(xì)胞和（或）螺旋神經(jīng)元損傷引起的聲音感受、傳導(dǎo)障礙引起的聽力損失，包括先天性耳聾和后天獲得性耳聾[1]。先天性耳聾是由基因突變引起的耳蝸某些組件的功能障礙導(dǎo)致，最常見的獲得性耳聾包括藥物性耳聾、噪音性耳聾以及老年性耳聾。嚴(yán)重的聽力損失影響患者的生活質(zhì)量，尤其是幼年患者的語言、社交能力發(fā)展，帶來沉重的社會負(fù)擔(dān)。由于毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元不可再生，其損傷引起的聽力損失尚無有效治療方法，分子機(jī)制尚不確切。目前，在多種因素引起的感音神經(jīng)性耳聾的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激損傷、免疫炎癥、代謝障礙、某些基因突變參與獲得性耳聾內(nèi)耳感覺神經(jīng)組織細(xì)胞損傷，促進(jìn)了如各種抗氧化劑、抗炎藥物等保護(hù)劑的發(fā)展。深入理解感音神經(jīng)性耳聾背后的分子事件及其關(guān)鍵目標(biāo)將有助于制定新的預(yù)防、治療耳聾的策略。

1 聽覺感受器結(jié)構(gòu)與功能

內(nèi)耳Corti器為聽覺感受器，是耳蝸基底膜上感受聲波振動的高度分化結(jié)構(gòu)，由支持細(xì)胞和毛細(xì)胞組成。毛細(xì)胞是感受聲音刺激的上皮細(xì)胞，包含1排內(nèi)毛細(xì)胞和3～4排外毛細(xì)胞，外毛細(xì)胞比內(nèi)毛細(xì)胞對損傷更敏感。毛細(xì)胞游離面有靜纖毛，外毛細(xì)胞的靜纖毛插入到蓋膜膠質(zhì)中，毛細(xì)胞底部細(xì)胞質(zhì)有含神經(jīng)遞質(zhì)的突觸小泡，與來自螺旋神經(jīng)節(jié)的螺旋神經(jīng)元樹突末端形成突觸連接。當(dāng)聲波從耳蝸的根部傳播到耳蝸的頂點時，耳蝸的基底膜振動，引起毛細(xì)胞興奮，內(nèi)毛細(xì)胞釋放神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，編碼突觸后有效神經(jīng)元的聲信號，通過螺旋神經(jīng)元把聲音信號傳到大腦，產(chǎn)生聽覺。耳蝸毛細(xì)胞或螺旋神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及功能受損是感音神經(jīng)性耳聾的病理基礎(chǔ)。

2 感音神經(jīng)性耳聾分子機(jī)制

2.1 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在遭遇應(yīng)激時所能遵循的死亡途徑之一，是一種活躍的、需要能量并由細(xì)胞內(nèi)特定的途徑啟動的過程。正常情況下，健康細(xì)胞在促凋亡因子和抗凋亡因子之間保持微妙的平衡，使其生存或增殖。研究顯示，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致多種獲得性耳聾，如老年性耳聾的關(guān)鍵因素[2-4]。諸如氨基糖苷類抗生素和順鉑之類的治療藥物引起毛細(xì)胞凋亡導(dǎo)致 “耳毒性”而引起聽力損失[5-6]。長時間暴露于噪音觸發(fā)毛細(xì)胞的凋亡引起噪聲性耳聾[7]。噪聲暴露后豚鼠、龍貓和大鼠耳蝸細(xì)胞內(nèi)均出現(xiàn)核凝聚現(xiàn)象，進(jìn)一步研究顯示受噪聲影響的耳蝸外毛細(xì)胞中凋亡標(biāo)記物caspase級聯(lián)反應(yīng)被激活，同時誘導(dǎo)凋亡基因家族成員在受到噪聲刺激損傷后的幾小時內(nèi)被激活[7]。聲音的強(qiáng)度、噪聲暴露和形態(tài)分析之間的時間間隔2個因素決定了強(qiáng)烈的噪聲暴露后的細(xì)胞死亡途徑。聲音強(qiáng)度＞120 dB時，細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且外毛細(xì)胞在聽覺損傷期間即開始死亡，并至少持續(xù)30 d[8]。動物實驗研究顯示，caspase-3的表達(dá)存在年齡相關(guān)性，抑制其激活對治療老年性耳聾有重要意義[9]。葛珊珊等[9]在老齡組小鼠注射神經(jīng)生長因子，能有效降低老年小鼠caspase-3的表達(dá)，從而有效保護(hù)毛細(xì)胞。細(xì)胞色素C（cytochrome C，Cyt-C）是線粒體途徑啟動凋亡的關(guān)鍵節(jié)點之一，在細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核有不同程度固縮且Cyt-C可能存在核內(nèi)轉(zhuǎn)移。楊衛(wèi)平等[10]用SD大鼠探究Cyt-C在不同階段壞死毛細(xì)胞中的表達(dá)，認(rèn)為Cyt-C可能在細(xì)胞凋亡前期就先于細(xì)胞核形態(tài)的改變，可以作為老年耳蝸早期進(jìn)行性病變毛細(xì)胞的標(biāo)志物之一。丁大連等[11]應(yīng)用Superarray技術(shù)觀察順鉑處理的培養(yǎng)耳蝸組織，顯示p53和caspases等凋亡相關(guān)的9個基因明顯表達(dá)增加，利用外源性Pifithrinα（一種p53抑制劑）阻斷p53凋亡途徑能抑制caspase-1、caspase-3的表達(dá)，顯示p53凋亡途徑和Caspase激活密切相關(guān)。羅凌惠等[12]用人重組Bcl-2腺病毒在螺旋神經(jīng)元中表達(dá)，顯示其有明顯的神經(jīng)元保護(hù)作用。

2.2 氧化應(yīng)激損傷

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是細(xì)胞有氧呼吸時在呼吸鏈上產(chǎn)生的極不穩(wěn)定的物質(zhì)，過量ROS對蛋白、脂肪、裸露DNA有極強(qiáng)的破壞性，引起氧化應(yīng)激損傷。正常組織含超氧化物歧化酶和還原性維生素等抗氧化劑以及時清除自由基。ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷與耳蝸毛細(xì)胞損傷病理機(jī)制密切相關(guān)。多種致聾因素引起耳蝸內(nèi)促 ROS產(chǎn)生的酶活性增高而清除 ROS的酶水平降低，導(dǎo)致過量的ROS聚集于耳蝸組織內(nèi)，消耗耳蝸內(nèi)大量抗氧化分子如谷胱甘肽和抗氧化酶，引起丙二醛和4-羥基壬烯醛（4-HNE）等有毒過氧化物增加，使脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致必需的細(xì)胞酶和膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白失活，并破壞離子通道功能，最終導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡或壞死。ROS可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑并促進(jìn)Cyt-C從線粒體釋放，進(jìn)而導(dǎo)致caspase激活的細(xì)胞凋亡[13]。耳毒性藥物使內(nèi)耳新陳代謝加速產(chǎn)生氧化應(yīng)激，過量ROS聚集于耳蝸組織內(nèi)與DNA結(jié)合，降低耳蝸內(nèi)蛋白和酶的活性，引起耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，降低了超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽還原酶（GSH-R）活性，引起耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡[14]。多項研究顯示，順鉑激活ROS/ JNK信號通路介導(dǎo)毛細(xì)胞凋亡[15]。部分耳毒性藥物可與含巰基的蛋白質(zhì)作用，使內(nèi)耳抗氧化酶含量及活性降低引起內(nèi)耳氧化應(yīng)激損傷。鼓室注射地塞米松，抑制順鉑引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，降低丙二醛含量、增加SOD活性，對毛細(xì)胞有保護(hù)作用[16]。隨年齡增加，耳蝸組織細(xì)胞功能下降、耳蝸血流量減少，使自由基不能及時清除，尤其對線粒體中DNA、呼吸鏈蛋白等造成損傷，使得自由基進(jìn)一步積累，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致老年性耳聾。噪聲性耳聾患者的毛細(xì)胞產(chǎn)生的大量ROS和活性氮族（reactive nitrogen species，RNS），對DNA、蛋白質(zhì)和血迷路屏障造成損傷，逐漸造成細(xì)胞凋亡和炎癥[17]。內(nèi)耳在噪聲暴露后，其毛細(xì)血管形態(tài)發(fā)生改變，RNS破壞血迷路屏障和對血管的收縮效應(yīng)形成惡性循環(huán)。RNS標(biāo)志物3-硝基絡(luò)氨酸（3-NT）在外側(cè)壁血管紋中Marginal細(xì)胞骨架連接處明顯增高，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）MMP-9主要分布在血管紋，MMP-2主要分布在毛細(xì)胞胞質(zhì)，兩者均在噪聲暴露后產(chǎn)生明顯差異，表明暴露噪聲后內(nèi)耳RNS進(jìn)一步激活了耳蝸MMPs，對聽功能產(chǎn)生影響[18]。小鼠實驗表明，ROS堆積在4～6 d后呈現(xiàn)動態(tài)雙峰，第2個峰值可能與繼發(fā)性損傷有關(guān)?？寡趸瘎┛深A(yù)防順鉑、年齡、噪音引起的感音性聽力損失。2017年的一項多中心、隨機(jī)對照、開放標(biāo)簽的Ⅲ期臨床試驗研究顯示，抗氧化劑硫代硫酸鈉（STS）可預(yù)防兒童由順鉑引起的聽力損失[19]。盧燕等[20]研究顯示，飽和氫生理鹽水在噪音性耳聾中作用可能與增強(qiáng)血漿總SOD等抗ROS的酶活性相關(guān)。

2.3 免疫炎癥

巨細(xì)胞病毒感染小鼠可引起內(nèi)耳的免疫/炎癥反應(yīng)，內(nèi)耳中caspase-1 和 IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α等炎癥因子表達(dá)增加，是導(dǎo)致聽力損傷的重要原因[21]。全身多系統(tǒng)特異性自身免疫病可能損害內(nèi)耳，NLRP3基因突變以及過量的白細(xì)胞介素IL-1釋放引起的系統(tǒng)性和器官特異性炎癥，導(dǎo)致繼發(fā)性的感音神經(jīng)性耳聾[22]。另有研究顯示，突聾患者血清中MMP-9濃度顯著低于健康人群，可能與其參與了內(nèi)耳免疫損傷而大量消耗有關(guān)[23]。噪聲損傷可以引發(fā)炎性分子的產(chǎn)生，運(yùn)用高通量測序 RNA-seq 技術(shù)對噪聲暴露后的大鼠和小鼠的內(nèi)耳感覺神經(jīng)上皮組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序顯示，噪聲損傷后2種動物內(nèi)耳發(fā)生差異性表達(dá)基因基本相似，主要集中在免疫、炎癥、損傷、防御相關(guān)的因子[24]，另一研究證明噪聲刺激后大鼠耳蝸神經(jīng)上皮中的Toll樣受體4（Toll-like recept 4，TLR-4）表達(dá)增加[25]。在年齡性聽力損失人群，60歲以下發(fā)生聽力下降的人群血清 TNF-α和 C反應(yīng)蛋白濃度顯著高于聽力正常人群。動物實驗證實，老年小鼠耳蝸ROS增多，IL-1β、IL-18 和 TNF-α水平顯著升高，NLRP3-炎癥小體激活[26]。最近研究證實，炎癥相關(guān)信號通路及其調(diào)控的炎癥因子在順鉑引起的耳蝸毛細(xì)胞凋亡中起重要作用[27]。在HEI-OC1聽細(xì)胞系和小鼠耳蝸研究證實，順鉑激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、核轉(zhuǎn)錄因-κB（NFκB）信號促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子釋放，導(dǎo)致細(xì)胞損傷[28]。

2.4 代謝因素

活體噪聲暴露后毛細(xì)血管血流量減少及形態(tài)學(xué)改變會導(dǎo)致微循環(huán)障礙，內(nèi)耳組織供血供氧不足導(dǎo)致代謝紊亂。外源性硫化氫對耳蝸噪聲性損害有一定保護(hù)作用，而該作用可能是由于其直接作用于血管的平滑肌細(xì)胞繼而擴(kuò)張血管，進(jìn)一步增加內(nèi)耳血流，最終緩解噪聲刺激后的內(nèi)耳供血不足[29]。嚴(yán)重長時間缺血缺氧除了細(xì)胞損傷、酶代謝紊亂，尚可導(dǎo)致缺血再灌注損傷形成更多自由基的惡性循環(huán)，紅細(xì)胞血小板聚集加劇血栓的形成，內(nèi)皮細(xì)胞損傷使離子濃度改變。耳蝸內(nèi)某些離子如Mg2+等成分的改變對噪聲性耳聾發(fā)展有一定影響，日常生活中攝入鎂、足量的抗氧化維生素可以有效防范噪聲性耳聾得到實驗證實[30]。內(nèi)耳組織吸收耳毒性藥物將直接導(dǎo)致細(xì)胞毒性，影響內(nèi)耳代謝。有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（organic cation transporter，OCT）是一種分布廣泛的膜蛋白，可與鉑類藥物特異性作用，研究顯示OCT2在小鼠毛細(xì)胞、血管紋中表達(dá)，可使內(nèi)耳膜電位和細(xì)胞內(nèi)離子強(qiáng)度造成紊亂[31-32]。鼓室注射銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1底物硫酸銅可有效保護(hù)順鉑對正常聽力的損傷[33]。

2.5 基因因素

基因突變是聽力障礙的原因之一[34]，大約每1 000名兒童中就有1名是天生失聰，并且?guī)缀跤幸话胧怯捎谶z傳因素造成的聽力損失[35]。耳聾分子流行病學(xué)研究顯示，mtDNA、12srRNA、beta-縫隙連接蛋白2（GJB2）及鈣黏蛋白23基因（CDH23）等基因突變參與遺傳性耳聾發(fā)生。mtDNA突變有原發(fā)性、繼發(fā)性耳聾的區(qū)分，均改變線粒體tRNA二級結(jié)構(gòu)，致蛋白質(zhì)合成功能障礙，最常見的3個突變位點分別是A1555G突變、C1494T突變、MittRNAhisT12201C突變[36，37]。數(shù)據(jù)顯示氨基糖苷類抗生素促發(fā)12SrRNA A1555G突變，突變位點與轉(zhuǎn)甲基酶mt-TFB1結(jié)合，使12SrRNA甲基化，激發(fā)細(xì)胞凋亡，甲基化程度多與核酸轉(zhuǎn)錄翻譯活性呈負(fù)相關(guān)[38]。GJB2基因是最常見的常染色體隱性遺傳致先天性聾的易感基因，常表現(xiàn)雙耳對稱性聾。GJB2表達(dá)的縫隙連接蛋白26（Cx26）在耳蝸高表達(dá)，Corti器中表達(dá)最高。Cx26主要對K+從興奮毛細(xì)胞進(jìn)入內(nèi)淋巴，維持內(nèi)淋巴高鉀的正電位進(jìn)行調(diào)節(jié)[39]。CDH23對維持細(xì)胞黏連十分重要，是老年性耳聾基因，小鼠攜帶CDH23基因?qū)υ肼暩用舾衃40]。在CDH23純合突變小鼠模型中，噪聲致耳聾程度高于對照組2倍[41]。質(zhì)膜Ca2+-ATP酶2基因（PMCA2）定位于外毛細(xì)胞靜纖毛、螺旋神經(jīng)節(jié)等。Kozel對PMCA2基因3種基因型小鼠暴露噪聲后，聽閾值差異存在統(tǒng)計學(xué)意義[42]。

感音神經(jīng)性耳聾病因復(fù)雜、治療困難，其引起的嚴(yán)重聽力損失對患者的個人和社會生活產(chǎn)生重大的負(fù)面影響，尤其是兒童。目前多數(shù)研究認(rèn)為耳蝸細(xì)胞中過量ROS產(chǎn)生，刺激耳蝸炎癥，激活相關(guān)細(xì)胞信號通路引起耳蝸細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致聽力損失關(guān)鍵，這導(dǎo)致了各種抗氧化劑作為耳保護(hù)劑及抗炎藥治療聽力損失方案的發(fā)展。某些基因的突變能改變耳蝸細(xì)胞對各種刺激因素的易感性拓展了在基因水平對獲得性耳聾機(jī)制的認(rèn)識。雖然大量針對感音神經(jīng)性耳聾分子機(jī)制的藥物、基因已經(jīng)顯示出希望，但這些研究多局限于動物實驗，研究結(jié)果尚需要擴(kuò)展到人類臨床試驗進(jìn)行最終驗證。深入理解感音神經(jīng)性耳聾分子機(jī)制，可以幫助研究人員在不止一種途徑中識別出可以作為分子開關(guān)的關(guān)鍵靶點，并促進(jìn)該領(lǐng)域的持續(xù)研究，進(jìn)而揭示感音神經(jīng)性耳聾新機(jī)制，形成針對性的靶向治療，對預(yù)防、治療聾病具有重要意義。