王紅霞 徐廣賢 （寧夏醫(yī)科大學，銀川750004）

CAR-T 細胞免疫療法是以T 細胞為來源，進行體外基因修飾后回輸治療的一種過繼性細胞療法，其在識別腫瘤細胞時由于不受MHC限制，可有效避免腫瘤逃逸［1］。但長期腫瘤抗原及其他免疫抑制信號刺激導致CAR-T 細胞功能逐漸衰減，無法有效殺傷腫瘤細胞。因此，闡明Tex 形成的具體分子機制有利于尋找逆轉CAR-T 細胞功能的最佳策略，此外，聯(lián)合其他腫瘤免疫治療方法有望進一步延伸CAR-T細胞療法在腫瘤治療中的應用。

1 T細胞耗竭

T 細胞耗竭（T cell exhaustion，Tex）最初用于描述慢性病毒感染時T細胞在持續(xù)抗原刺激下的一種功能異常狀態(tài)，最近報道，參與腫瘤免疫的T細胞也存在相似現(xiàn)象［2-3］。T 細胞發(fā)生耗竭時，其生物學功能主要表現(xiàn)為：抑制性受體PD-1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3等表達持續(xù)增加或同時共表達多個抑制性受體；效應功能漸進性降低：包括細胞因子釋放情況（IFN-γ、IL-2）與穿孔素、顆粒酶產生情況；增殖能力及自我更新能力（依賴于IL-7、IL-15）降低；代謝改變，耗竭性T 細胞線粒體活性降低，糖酵解受限，代謝儲備能力降低。

研究表明，耗竭性T 細胞不同于效應性T 細胞（T effector，Teff）KLRG1+CD127?及記憶性 T 細胞（T memory，Tmem）KLRG1-CD127+等，而是具有獨特分子表型的一群異質性細胞［4-5］。TCF-1+PD-1intTIM-3?為 Tex 祖細胞表型，TCF-1?PD-1hiTIM-3hi為終末 Tex表型，此外，CXCR5也可能作為祖細胞標志之一［6-7］。HUDSON 團 隊［8］最 新 發(fā) 現(xiàn) ，TCF-1?PD-1+TIM-3+CX3CR1+可能為耗竭性T 細胞中間態(tài)細胞群，這種中間態(tài)的CX3CR1+細胞發(fā)揮效應的程度近似Teff。阻斷 PD-1 后 TCF-1?PD-1+TIM-3+CX3CR1+細胞群增加，暗示該中間態(tài)可能是PD-1營救后主要發(fā)揮抗腫瘤效應的細胞群體。目前，Tex 來源尚未統(tǒng)一，可能為初始 T 細胞（na?ve T cell，Tn）接受活化信號后先分化為耗竭性T 細胞前體，前體細胞進一步分化為中間態(tài)，最終發(fā)育為TCF-1?PD-1hi末端狀態(tài)［9］。

2 Tex分子機制

急性感染時，Tn 經(jīng)抗原活化增殖發(fā)揮殺傷效應，約5%T 細胞轉化為記憶性細胞，以非抗原依賴方式進行自我更新，當再次接觸相同抗原時，立即進行免疫應答。但當感染持續(xù)存在時，T 細胞接受慢性持久刺激，活化與分化發(fā)生異常改變。導致T細胞處于耗竭狀態(tài)的潛在分子機制主要為：①DNA甲基化或組蛋白乙酰化的改變，如編碼抑制性受體PD-1，以及與記憶、效應分子等相關基因發(fā)生DNA甲基化或組蛋白乙?；?，從而影響基因表達［10-11］。GHONEIM 等［10］發(fā) 現(xiàn) DNA 甲 基 化 酶 3a（De novo methyltransferase 3a，DNMT3a）介導的 DNA 從頭甲基化促進耗竭性T 細胞前體形成，給予去甲基化藥物decitabine 治療后，CD8+T 細胞耗竭得到改善，聯(lián)合PD-1 單抗治療時，小鼠腫瘤負荷降低，轉錄因子表達改變。CHEN 等［4］采用淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（LCMV）Arm 與C113分別制備急性及慢性小鼠感染模型，采用單細胞測序技術結合模擬分化時間預測發(fā)現(xiàn)，T 細胞在發(fā)展為Tex 的早期階段，TCF-1起決定性作用，其潛在機制可能是通過拮抗促進T細胞向Teff 分化的轉錄因子，而正向調節(jié)Emoes、CMyb 等與記憶及存活相關的轉錄因子，從而促進T細胞向Tex 方向發(fā)育。此外該研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 表達有助于耗竭性T 細胞前體形成，保護其因過度活化而凋亡。除TCF-1 作為促進Tex 發(fā)展的轉錄因子外，2019年《Nature》3篇文章報道TOX同樣促進Tex祖 細 胞 形 成［5，12-13］。 此 外 NR4A 家 族 、BLIMP-1、NFAT、Emoes、T-bet 等均參與耗竭 T 細胞生成［14-17］；②腫瘤微環(huán)境因素，包括調節(jié)性T 細胞（regulatory cells，Tregs）、骨髓來源抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）、M2 型巨噬細胞等抑制性免疫細胞，IL-10、IL-6、TGF-β等抑制性細胞因子，以及腫瘤細胞周圍纖維母細胞等均促進CD8+T細胞耗竭形成［18-20］；③小分子 RNA 參與，如 miRNA-155、miR-143、miR-146a 等通過多種方式調節(jié)T 細胞記憶、效應功能及代謝等相關基因表達［21-23］。

3 CAR-T細胞免疫療法

CAR-T 細胞療法是指通過體外對T 細胞進行基因修飾，賦予其靶向殺傷腫瘤細胞特性，經(jīng)擴增培養(yǎng)后回輸患者的一種細胞免疫療法。目前該免疫療法主要用于血液系統(tǒng)腫瘤治療，靶點為CD19，此外，CD20、CD22 等多靶點聯(lián)合治療也顯現(xiàn)出較好效果［24-26］。實體瘤治療方面，由于腫瘤特異性抗原缺乏及腫瘤微環(huán)境等因素，其應用受阻。在研靶點包括 HER-2、GD2、Mesothelin、CEA、PSCA 等，主要針對乳腺癌、肝癌、肺癌、結直腸癌等，針對CAR-T 細胞在實體瘤治療方面的應用，主要應對策略包括：①采用基因編輯技術（ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9）改造 CAR-T 細胞。HU 等［27］與 GUO 等［28］研究發(fā)現(xiàn)，敲除PD-1 后，CAR-T 細胞對肝癌細胞及Mesothelin陽性的三陰性乳腺癌細胞殺傷力明顯增強。此外，EYQUEM 等［29］利用 CRISPR/Cas9 技術將 CAR 基因“精準”遞送至 T 細胞受體（T-cell receptor α con?stant，TRAC）基因座，避免常規(guī)慢病毒載體或其他遞送方式將CAR 基因隨機插入T 細胞基因組而引發(fā)潛在細胞癌變，這種編輯方式制備的CAR-T 細胞在小鼠白血病模型中相比常規(guī)CAR-T 細胞顯現(xiàn)出更強的殺傷力；②設計多靶標CAR。BIELAMOWICZ等［30］將HER2、IL13Rα2、EphA構建到同一CAR框中研究其對惡性膠質瘤的殺傷作用，結果表明其殺傷效應優(yōu)于單獨或雙靶點；③聯(lián)合其他免疫療法。MA等［31］開發(fā)一種可使CAR-T 細胞在淋巴結提前進入激活狀態(tài)的疫苗，結果顯示，該聯(lián)合治療在膠質母細胞瘤、乳腺癌及黑色素瘤等多種小鼠腫瘤模型中均產生較好效果；④組成性表達IL-23、IL-7/CCL-19等細胞因子［32-33］；⑤胞內共刺激分子選擇、制備通用CAR-T 細胞、優(yōu)化CAR-T 細胞體外培養(yǎng)體系、制備TSCM、TCM 表型 CAR-T 細胞、改善 CAR-T 細胞耗竭等對CAR-T 細胞殺傷實體瘤均有一定促進作用［34-41］。

4 耗竭性CAR-T細胞

CHEN 等［16］和 SEO 等［17］發(fā)現(xiàn)，與 HBV/HCV 感染時出現(xiàn)的Tex 相似，腫瘤浸潤性CAR-T 細胞相較于體外制備的CAR-T 細胞，可高表達NR4A、TOX 等T 細胞耗竭相關轉錄因子。當敲除或沉默TOX、TOX2，Nr4a1、Nr4a2、Nr4a3 基因后，黑色素小鼠腫瘤負荷減小，生存時間延長，同時沉默TOX 與NR4A效果更為顯著。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NR4A、TOX 及NFAT 3 個轉錄因子可能在pdcd-1 啟動子上游約23 kb共同形成轉錄增強子復合體，從而調節(jié)pdcd-1基因表達。WEI 等［42］從細胞代謝角度出發(fā)，靶向代謝相關因子REGNASE-1，CD8+T 細胞發(fā)生重編程，擴增能力、體內存留時間、效應功能等都得到提升，對小鼠白血病與黑色素瘤均顯示較好療效，可能通過影響B(tài)AFT、PTPN2 與SOCS1 等基因表達發(fā)揮作用 。 ZOU 等［43］采 用 CRISPR/cas9 技 術 同 時 敲 除PD-1、TIM-3、LAG3 免疫抑制性受體，表現(xiàn)出更佳腫瘤控制效果，具體分子機制可能為敲除抑制性受體后一方面阻斷腫瘤細胞傳導抑制信號，另一方面CAR-T 細胞表面 CD56 表達上調，促進 CAR-T 細胞存活，改善耗竭狀態(tài)從而增強功能。

除腫瘤微環(huán)境因素導致CAR-T 細胞耗竭外，CAR-T細胞自身區(qū)別于天然T細胞，CAR 結構引入，尤其胞內共刺激分子不同，使制備的CAR-T 細胞因“噪聲信號”引起非抗原依賴T 細胞過度活化，導致Tex發(fā)生。LONG等［34］觀察到胞內刺激分子為4-1BB時，相比CD28 CAR-T 細胞存活時間更久；LYNN等［15］發(fā)現(xiàn)，相較于 CD19-28z CAR T 細胞，HA-28z CAR T 細胞表現(xiàn)出更顯著的Tex，進一步研究表明，AP-1家族轉錄因子c-jun表達降低，過表達c-jun后，CAR-T 細胞增殖能力、效應分子分泌能力提升，而分化程度、抑制性受體表達降低，小鼠腫瘤負荷降低。此外，共表達IL-15、抗PD-1 單鏈抗體，封閉TGF-β信號等方法在一定程度上可改善CAR-T細胞耗竭狀態(tài)，加速腫瘤清除［41-47］。

5 T細胞耗竭與CAR-T細胞免疫療法國內外研究現(xiàn)狀與前景

基于耗竭性T 細胞對抗腫瘤治療效果的影響，國內外研究者開始關注Tex 營救，即免疫檢查點阻斷劑（immune checkpoint inhibitors，ICI）的應用，如阻斷PD-1/PD-L1信號傳遞，該方法一方面阻斷腫瘤細胞誘導的抑制作用，另一方面可逆轉PD-1lo 的Tex 祖細胞并促進其成熟分化，發(fā)揮殺傷功能［48］。目前，臨床常采取的 ICI 靶點包括 PD-1、CTLA-4，主要適應癥為惡性黑色素瘤，此外也用于非霍基金淋巴瘤、非小細胞肺癌等研究［49］。2011 年，CTLA-4 特異性抗體Ipilimumab 獲FDA 上市批準，臨床數(shù)據(jù)分析顯示，5年無復發(fā)生存率為40.8%［50］；2014年，PD-1特異性單克隆抗體Opdivo、Keytruda 獲批上市，最初用于惡性黑色素瘤治療，Keytruda 五年生存率達34%［51］。HUANG 等［52］研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 療效取決于 T細胞活化效應與患者腫瘤負擔。2016 年，PD-L1 單抗Tecentriq 獲批用于治療膀胱癌、非小細胞肺癌治療等；2018 年，我國首個 PD-1 單抗 Toripalimab 獲批上市，其治療黑色素瘤、肺癌、淋巴瘤等腫瘤均取得較好反響［53-54］。隨后 Sintilimab、Tislelizumab、Cam?relizumab 也進入臨床試驗，擬用于非小細胞肺癌、肝癌、胃癌、霍基金淋巴瘤等腫瘤治療。由于耗竭T細胞一般同時表達多個抑制性受體，臨床上采取抑制劑聯(lián)合治療，常見組合為CTLA-4 與PD-1，治療惡性黑色素瘤時五年生存率達52%［55］。PD-1 與其他抑制劑聯(lián)用也在進一步研究中［56-58］。

CAR-T 細胞療法目前主要用于血液系統(tǒng)腫瘤治療。2012 年，EMILY WHITEHEAD 在美國賓夕法尼亞大學醫(yī)院接受腫瘤CAR-T 細胞治療，目前未復發(fā)，成為世界上第一個被CAR-T 細胞療法治愈的兒童，極大程度推進了細胞療法在腫瘤免疫中的應用。2017 年，F(xiàn)DA 先后批準 Kymriah、Yescarta 上市，適應證為復發(fā)或難治性兒童急性淋巴細胞白血病和復發(fā)或難治性大B 細胞淋巴瘤，治療靶點為CD19，Kymriah 3 個月響應率為81%，12 個月生存率76%［59］。Yescarta完全緩解率可達51%［60］。此外，包括以BCMA、CD20、CD33、CD123 為靶點用于多發(fā)性骨髓瘤、急性髓系白血病等研究，同種異體CAR-T細胞申報的臨床試驗也顯示較好療效［61-62］。國內相關研究積極跟進，2018 年3 月，我國第一個CAR-T細胞療法臨床申請獲CFDA 批準，為南京傳奇生物申報，以BCMA為靶點，適應證為復發(fā)性或耐藥性多發(fā)性骨髓瘤，總反應率為88.2%，一年總生存率為82.3%［63］。繼南京傳奇后，上海明聚生物、上海優(yōu)卡迪生物、復星凱特、銀河生物等公司相繼開展臨床試驗。目前，全球登記的CAR-T 細胞治療臨床研究約630項，美國約234項，我國達315項，在研靶點主要以CD19 為主，BCMA 次之。與血液腫瘤相比，CAR-T 細胞療法在實體瘤研究領域面臨更大挑戰(zhàn)，登記的在研項目約30 多項，主要靶點為GD2、MUC1、EGFR、Her2 等，此外也有聯(lián)合 ICI 同時進行治療的研究［62］。近年細胞免疫療法在血液腫瘤與實體瘤治療方面呈明顯上升趨勢，治療效果可觀，CAR-T 細胞療法更為顯著，后續(xù)對CAR-T 細胞治療的整個流程不斷優(yōu)化，有望為腫瘤患者帶來福音。

6 展望

CAR-T 細胞療法作為目前腫瘤治療中最具前景的免疫療法之一，改善其耗竭狀態(tài)將增強CAR-T細胞功能，提升腫瘤免疫治療效果。目前，聯(lián)合治療成為腫瘤治療研究熱點，在一定程度上呈現(xiàn)“協(xié)同效應”，如ICI 與CAR-T，溶瘤病毒（OVs）等兩兩組合，或前期輔助放化療、其他抗腫瘤藥物。SAMSON等［64］發(fā)現(xiàn)，瘤內注射OVs 進行腫瘤微環(huán)境預處理，促進膠質瘤周圍T 細胞浸潤，此外，輔之PD-1 封閉處理，相較于對照組，小鼠腫瘤得到明顯改善；經(jīng)改造后可分泌EGFR 雙特異性抗體的溶瘤病毒（OAd-BiTE），與CAR-T 聯(lián)用促進T 細胞體外活化、增殖及細胞毒性，且在小鼠腫瘤模型中展現(xiàn)較好效果［65］。GULATI 等［66］表明，CAR-T 細胞與 PD-1 抗體聯(lián)合治療可加速腫瘤清除，其在MPM 患者體內存留時間長達21 d。最近，NAKAZAWA 等［67］采用CRISPR/cas9技術敲除CAR-T 細胞表面PD-1，其對惡性膠質瘤細胞具有一定抑制作用，而T 細胞自身表型及抑制性受體表達未受影響，進一步體內實驗尚待研究?？梢?，聯(lián)合治療的確增強了抗腫瘤效應，未來，CAR-T、ICI、溶瘤病毒三者聯(lián)用可能成為腫瘤免疫治療的發(fā)展趨勢［68］。盡管耗竭性T細胞依然可分泌細胞毒性效應分子，在維持長期腫瘤或感染性疾病中發(fā)揮作用，但總的來說其抗腫瘤效應仍是局限的。因此，著力于Tex狀態(tài)改善，更深入研究CAR-T細胞耗竭，以及與其他抗腫瘤療法聯(lián)合治療將進一步拓展CAR-T 細胞療法的臨床應用，尤其在肝癌、肺癌、乳腺癌等實體瘤治療方面。