天冬酰胺內肽酶與創(chuàng)傷性腦損傷相關的阿爾茨海默病*

劉 易， 丁 怡， 劉 蓉， 王建枝，3， 柯 丹△， 王小川，3

（1華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理生理學系，湖北武漢430030；2濰坊醫(yī)學院基礎醫(yī)學院病理生理學系，山東濰坊261053；3南通大學神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南通226001）

1 創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的概況

TBI 在全球意外傷害的死亡和傷殘原因中居首位，帶來了諸多經(jīng)濟、醫(yī)療等社會問題。實際上，全世界每年有1 000 萬人死亡和就醫(yī)直接歸因于TBI，大約有5 700 萬人患有腦損傷相關疾病[1]。TBI 的幸存者會出現(xiàn)有多種病理現(xiàn)象，例如神經(jīng)功能缺損，短期和長期腦損傷，認知、行為和情感障礙，所有這些都取決于損傷的嚴重程度。從功能成像研究中可以明顯看出，認知方面的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷是由于海馬萎縮和白質束受損所致[2]。TBI 可根據(jù)其嚴重程度和作用機制進行分類[3]。在動物模型中，通過復制輕、中、重度不同程度的TBI，觀察導致其結果惡化的臨床因素對于疾病病理和治療的理解至關重要。

TBI能導致腦腫脹、軸突損傷和缺氧，破壞血腦屏障功能，增加炎癥反應、氧化應激和神經(jīng)變性，并導致認知障礙[4]。盡管許多患者在最初的傷害中幸存了下來，但TBI 是一種慢性疾病過程，最終可能導致他們幾個月甚至幾年后的死亡[5]。TBI后的細胞死亡是神經(jīng)功能缺損和死亡的主要原因[6]。TBI的發(fā)生是一種初始損傷引起生化和細胞變化的疾病過程，這些變化最終會導致神經(jīng)元的持續(xù)損傷和死亡。這種持續(xù)的損傷被稱為繼發(fā)性損傷，多種凋亡和炎性途徑在這一過程中被激活[7]。腦損傷后的腦環(huán)境狀態(tài)以及由此產(chǎn)生的繼發(fā)性腦損傷決定了患者最終的結果。

頭部創(chuàng)傷導致的腦損傷一般分為兩類：急性腦損傷包括輕度TBI 或腦震蕩，包括其短期后遺癥和可能導致死亡的災難性腦損傷，最常見的原因是硬膜下血腫；慢性腦損傷又稱慢性創(chuàng)傷性腦?。╟hronic traumatic encephalopathy，CTE），是由反復頭部創(chuàng)傷導致的神經(jīng)退行性疾病，多出現(xiàn)在專業(yè)拳擊手和其他接觸性體育運動員身上，經(jīng)常在其運動生涯結束后幾年開始。

2 TBI與阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）

TBI是老年人群中的一個常見現(xiàn)象，因為老年而進一步影響其預后。目前，65 歲以上的TBI 病例增加了21%。眾所周知，老年創(chuàng)傷患者的預后很差，康復情況不容樂觀，死亡率和功能殘疾率是年輕患者的2 倍。多達65%的中度至重度TBI 患者呈現(xiàn)不同程度的認知功能障礙[8]。Luukinen 等[9]的研究提示，嚴重顱腦損傷的發(fā)生增加了認知能力底下的風險，與沒有TBI的老年人相比，TBI老年患者認知功能減退的趨勢明顯加快。因此，TBI 與年齡相關的大腦變化進一步加劇認知功能障礙。

AD 是一種多因素神經(jīng)退行性疾病，涉及多種不同的致病機制，存在多種高風險因素，其病因目前尚未得到充分了解。TBI 可能是AD 誘發(fā)因素[10]，其特征包括多個大腦區(qū)域的神經(jīng)元中存在AD 關鍵發(fā)病分子tau 蛋白異常過度磷酸化[11]。同時，AD 的另一分子標志物β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）亦在部分TBI急性死亡患者中被發(fā)現(xiàn)[12]。因此，TBI與AD之間相互關系及潛在發(fā)生機制亟需闡明。

2.1 TBI 與tau 蛋白 tau 蛋白是微管相關蛋白家族的成員，主要功能受到磷酸化的嚴格調控[13]。然而，因相關蛋白激酶激活和（或）蛋白磷酸酯酶活性下調，tau 蛋白異常過度磷酸化，并在幾種神經(jīng)退行性疾病中異常聚集，這些疾病被統(tǒng)稱為tau 蛋白病[14]。最典型的tau 聚集體發(fā)生在AD 中，其中異常過度磷酸化的tau 蛋白聚集形成神經(jīng)原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs），在神經(jīng)元內形成聚集體。作為AD 大腦兩大標志性病變之一的NFTs 也是其它神經(jīng)退行性疾病的特征性病理特征，最近已在CTE 患者的大腦中發(fā)現(xiàn)了NFTs。但是，通常直到受傷后數(shù)月或數(shù)年才在TBI中觀察到由異常過度磷酸化tau蛋白組成的NFTs[15]。引發(fā)CTE 中tau 蛋白病變的神經(jīng)化學變化尚不清楚，但最近的研究表明TBI 誘導異常的軸突內激活和激酶積累，可以促進tau 蛋白磷酸化[16]。Tran 等[17]發(fā)現(xiàn)腦外傷可增強tau 蛋白的免疫反應性和tau 蛋白磷酸化，且這些異常變化與TBI 嚴重程度呈正相關。

tau 蛋白沉積與AD 臨床癥狀的進展亦呈現(xiàn)正相關[18]。Mohamed 等[19]的研究表明，與對照組相比，TBI 受試者大腦皮層中tau 蛋白沉積增多（10%～20%），其可能機制涉及TBI 促進剪切力對軸突細胞骨架造成物理損傷，進而使結合異常的tau 蛋白成核，促進NFTs的形成[20]；另一種可能的機制是TBI引起血腦屏障損傷，促進tau 蛋白積聚，從而誘導NFTs形成，通常在聚集于腦溝深處，特別是在皮質小血管周圍，最終可能導致CTE[21]。

TBI 后tau 蛋白病變發(fā)展的分子機制尚不清楚。由于tau 蛋白的磷酸化狀態(tài)受tau 蛋白激酶和磷酸酶的平衡調節(jié)控制，TBI 后tau 蛋白病變機制的另外一種可能是tau 蛋白激酶和磷酸酶的平衡失調[1]。Mouzon 等[22]在模擬TBI 的嚙齒動物模型中發(fā)現(xiàn)，造成損傷2～3 個月后，總tau 蛋白水平和NFTs 顯著增加，并伴有白質降解和神經(jīng)炎癥增加。因此，TBI 誘發(fā)AD 等一系列神經(jīng)退行性病變的本質使人們相信，tau蛋白異常過度磷酸化是TBI相關AD的關鍵病變。

2.2 TBI 與Aβ Aβ 聚集形成的老年 斑（senile plaque，SP）是AD 的另一大病理特征[23]。Aβ 由淀粉樣前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切而成。

流行病學研究表明，死于TBI 的患者中，有30%的腦中存在Aβ斑塊[24]。免疫組織化學分析顯示，TBI促進受損的軸突中積累Aβ 裂解所需的酶。Chen等[25]在豬彌漫性軸突損傷模型和人TBI 患者的軸突腫脹中都發(fā)現(xiàn)了γ-分泌酶1 和β-分泌酶。這些研究均提示TBI可能引起Aβ毒性。APP具有神經(jīng)營養(yǎng)功能，包括促進軸突發(fā)芽、神經(jīng)突向外生長和突觸發(fā)生，這對軸突損傷后的神經(jīng)元存活非常重要。Thornton等[26]研究發(fā)現(xiàn)，APP因腦損傷而上調，而上調α-分泌酶可競爭性阻止β-分泌酶剪切APP，減少Aβ產(chǎn)生，從而減少動物實驗性TBI 后神經(jīng)元丟失和軸索損傷。對人腦組織樣本的研究表明，在腦損傷后神經(jīng)元和軸突中APP 累積將導致軸突損傷[27]。對患有輕度TBI但死于其他原因的患者的腦組織樣本進行的死后研究表明，這種APP積累可非常迅速地（在幾小時內）發(fā)生，并且能夠存在于輕度創(chuàng)傷的情況下[28]。具有AD樣病變的APP轉基因小鼠在6 月齡時形成淀粉樣斑塊，這些動物TBI后導致Aβ水平顯著升高，尤其是在海馬中。與未受傷的對照組相比，TBI 轉基因小鼠Aβ 的高度聚集使海馬神經(jīng)元損傷嚴重，與腦損傷的野生型小鼠相比，海馬神經(jīng)元的損傷也很嚴重[29]。這些研究提示TBI進一步促進AD的病理變化。

3 天冬酰胺內肽酶（asparaginyl endopeptidase，AEP）與AD

AEP 也稱為δ-分泌酶或legumain（LGMN）。哺乳動物的AEP 是溶酶體半胱氨酸蛋白酶，可在天冬酰胺殘基后特異性切割其底物。在人類中，AEP 由位于染色體14q32.12上的LGMN基因編碼。與半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶相似，初合成的AEP 為含有C 和N 末端前肽的無活性酶原[30]。晶體結構顯示，C端前結構域覆蓋半胱天冬酶樣AEP 酶核心，并禁止底物接近該酶核心，從而阻止其酶促活性；在酸性條件下，其N 端和C 端片段自我裂解，其酶活性被激活[31-32]。因此，AEP 的酶活性受到pH 值嚴格調節(jié)[33]。癌癥和AD 的環(huán)境往往呈弱酸性，在這樣的病理條件下，AEP 將被激活。此外，AEP 的酶活性也受其他因素調節(jié)。例如，當αVβ3整合素存在時，pH最佳值從5.5 升至6.0[32]。神經(jīng)元中AEP 存在翻譯后修飾，Akt 可磷酸化AEP 的T322 位點，從而抑制APP 自動裂解和酶促反應。在tau P301S 小鼠腦中，過表達模擬磷酸化AEP T322E 突變體可顯著抑制AEP 的活性，減弱tau 蛋白病變，減輕病理和認知缺陷。Akt 激活受腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）/原肌球蛋白受體激酶B（tropomyosin receptor kinase B，TrkB）信號通路調節(jié)，BDNF 的減少會減弱AEP T322 位點的磷酸化，引起AEP 的胞漿滯留和激活[34]。也有研究顯示，用TrkB 激動劑可抑制AEP 的活化以及APP 和tau 蛋白的病理性切割，從而減輕AD病變和行為學異常[35]。

3.1 AEP 與tau 蛋白 有報道顯示，在AD 患者大腦中，AEP 活性上調，且存在AEP 剪切的tau 蛋白片段tau1-368。體內和體外研究結構均表明，AEP 在N368后裂解tau 蛋白，產(chǎn)生tau1-368片段。與全長tau 蛋白相比，該片段更易于磷酸化，并喪失其微管組裝活性[36]。tau1-368片段與BDNF 同源受體TrkB 結合，阻斷神經(jīng)營養(yǎng)信號，從而誘導神經(jīng)元死亡[37]。另外，AEP活性和tau 蛋白裂解呈年齡依賴性增加[36]。因此，AEP可能在AD發(fā)病機理中起關鍵作用。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是tau 磷酸化主要的調節(jié)因子，PP2A 的抑制改變磷酸化和去磷酸化之間的平衡，進而導致tau 蛋白磷酸化增加。SET（SE translocation）是一種多功能蛋白質，能夠通過與PP2A 催化亞基PP2Ac 相互作用而有效地抑制PP2A 活性，因此亦被稱為I2PP2A（inhibitor 2 of PP2A）[38]。在正常狀態(tài)下，SET 蛋白以二聚體的形式聚集于核中。但I2PP2A/SET在其N175處切割成NTF和CTF 末端片段后易位至細胞質。這兩個片段都能夠有效抑制PP2A，從而促進tau 蛋白的過度磷酸化，而SET 的CTF 過度表達可引起AD 病變和認知障礙，表明SET 的切割可以在動物模型中引發(fā)AD[39-40]。在AD大腦中，AEP能通過溶酶體轉移到細胞質或細胞核并切割SET[41]。

3.2 AEP 與Aβ Aβ 是由β-和γ-分泌酶對跨膜蛋白APP 進行順序水解切割而產(chǎn)生的。β-分泌酶裂解APP產(chǎn)生C端C99片段，此片段被γ-分泌酶進一步裂解并產(chǎn)生Aβ。另外，APP 可以被Aβ 序列中的α-分泌酶切割，從而阻止了Aβ 的產(chǎn)生[42]。除α-、β-和γ-分泌酶外，研究者還鑒定出其他蛋白酶可裂解APP并調節(jié)其生理及病理功能[43-44]。例如，APP 經(jīng)η-分泌酶加工會產(chǎn)生抑制海馬神經(jīng)元活性的片段[44]。

研究發(fā)現(xiàn)AEP 表達水平以年齡相關的方式升高，并與老年大腦中的APP 片段緊密相關。值得注意的是，與健康對照組相比，AD 患者大腦中APP 裂解顯著增加。在5XFAD 小鼠模型中，AEP 的酶活性升高，且AEP 剪切生成的APP 片段APP586-695 更容易被β-分泌酶切割。因此，通過AEP 去除APP C 端片段可以緩解空間障礙，并通過β-分泌酶促進APP處理，從而加速Aβ 的產(chǎn)生。此外，AEP 剪切生成的APP1-373 片段具有更強的神經(jīng)毒性。AD 患者大腦切片中，具有AEP剪切的APP586-695片段免疫反應性的陽性神經(jīng)元比例比對照組顯著增加；當從5XFAD 小鼠中清除所有AEP 時，Aβ 斑塊面積減少至5XFAD小鼠的約60%[45]。所有這些研究都提示抑制AEP可能減輕AD的進行性神經(jīng)變性。

4 AEP激活與TBI后的AD樣tau蛋白病變

tau 蛋白的磷酸化水平受到蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性平衡所調控，TBI 發(fā)生后，由于組織直接機械變形引起的繼發(fā)性損傷期間tau 蛋白的磷酸化水平可能會改變[1]。Hu 等[46]的研究顯示，TBI 可以導致腦組織中乳酸增加，這可能有助于AEP的激活。進而AEP 切割SET 和tau 蛋白，從而間接導致AD 腦中tau 蛋白的過度磷酸化，引起AD 發(fā)生。該研究使用了重復性輕度腦損傷（r-mTBI）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)3xTg-AD 小鼠腦中tau 蛋白過度磷酸化受到AEP 活化的影響。AEP 活化也與r-mTBI 后的tau 蛋白過度磷酸化有關，可能是通過切割SET 蛋白使其從神經(jīng)元細胞核轉移到細胞質，并進而抑制PP2A 活性，導致tau 蛋白異常過度磷酸化。利用經(jīng)典自由落體實驗成功復制中重度TBI 模型，應用AEP 抑制劑下調AEP 活性，促進SET 蛋白重新回到神經(jīng)元核內，可解除對PP2A 的抑制，從而減輕tau 蛋白磷酸化水平，緩解突觸損傷和認知功能障礙。這些研究結果進一步證實AEP 抑制劑能有效緩解AD 樣神經(jīng)退行性疾病導致的認知功能障礙。

5 結論

盡管AD 研究領域取得了較大的進步，但AD 的診斷主要取決于臨床表現(xiàn)。因此，在臨床實踐中常常錯過或延遲診斷和有效治療。TBI 與神經(jīng)退行性疾病，特別是TBI 誘發(fā)的AD 是一個復雜的過程，需要進行廣泛的研究才能更好地理解。目前TBI 相關AD 的研究主要聚焦在tau 蛋白病變、Aβ 沉積及臨床表征的癡呆發(fā)病機制。

TBI致大腦局部酸化環(huán)境導致AEP激活，激活的AEP 則可介導AD 關鍵分子tau 蛋白、SET 蛋白、APP等的水解過程。例如，通過AEP 截斷SET 蛋白會引起tau 蛋白異常過度磷酸化，而AEP 介導的APP 和tau 蛋白截斷分別促進Aβ 和tau 蛋白的沉積，從而導致Aβ毒性和tau蛋白病變，加重AD 的病變及行為學異常。因此，闡明AEP 在AD 進程中對APP 和tau 蛋白的相互作用關系，以AEP產(chǎn)生的片段作為AD的診斷標志物，或者找到更高效的AEP 抑制劑，將為TBI所引起的AD 樣神經(jīng)退行性病變的早期診斷和干預提供更好的策略。