李謙畢愛(ài)玲王興榮?畢宏生?

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250002; 2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院,濟(jì)南 250002;3. 山東省中西醫(yī)結(jié)合眼病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250002; 4. 山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所,濟(jì)南 250002)

鈣(Ca2+)是調(diào)節(jié)真核細(xì)胞重要活動(dòng)的第二信使,介導(dǎo)去極化信號(hào)的傳導(dǎo),并參與突觸活動(dòng)的調(diào)控及生物體內(nèi)多種功能的調(diào)節(jié),它對(duì)神經(jīng)元的功能至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到外界各種刺激時(shí),細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流或細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的鈣離子釋放,調(diào)控鈣離子在神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)外的濃度變化,轉(zhuǎn)化為細(xì)胞反應(yīng)的信號(hào),引起一系列生理反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子的測(cè)定是研究神經(jīng)元鈣信號(hào)的基礎(chǔ)。然而在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度比較低,而且變化迅速,加上Mg2+、Na+、K+等其他離子的濃度較高,通常要比它高出104～106倍,很容易造成較大的干擾,因此,測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度比較困難,需要發(fā)展靈敏度高、特異性高的鈣離子檢測(cè)技術(shù)。

在早期的大腦皮層神經(jīng)元的相關(guān)研究中,大多數(shù)使用了電生理技術(shù)來(lái)研究神經(jīng)元的活動(dòng),這項(xiàng)技術(shù)尚存在許多缺點(diǎn),尤其在長(zhǎng)時(shí)程記錄神經(jīng)元活動(dòng)方面,特別不穩(wěn)定,細(xì)胞記錄的位置會(huì)隨著時(shí)間改變[1],這可能導(dǎo)致每天記錄細(xì)胞的不同,極大地影響了信號(hào)的穩(wěn)定性。鈣成像是一項(xiàng)相對(duì)較新的技術(shù),它可以更好地解決電生理記錄的主要弱點(diǎn)。顯微成像技術(shù)的不斷發(fā)展,以及新型鈣指示劑的應(yīng)用,使得鈣信號(hào)檢測(cè)技術(shù)更加成熟[2]。神經(jīng)系統(tǒng)鈣成像技術(shù)的發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程,這包括合適的鈣指示劑的選擇,不同的染色加載技術(shù)的應(yīng)用,以及用于體內(nèi)和體外最先進(jìn)的鈣成像設(shè)備的發(fā)現(xiàn)。

目前研究發(fā)現(xiàn),雙光子鈣成像技術(shù)已經(jīng)徹底改變了鈣成像領(lǐng)域的研究[3-4],得到了很大的普及與應(yīng)用;隨著微光學(xué)的梯度折射率(GRIN)透鏡系統(tǒng)的出現(xiàn),深腦顯微鈣成像技術(shù)促進(jìn)了對(duì)大腦深層神經(jīng)活動(dòng)的可視化,從而大大增加了大腦中可以被觀察和監(jiān)控的神經(jīng)元的數(shù)量[5];近幾年,一種光纖鈣信號(hào)記錄方法也得到了快速發(fā)展和應(yīng)用。本文就模型動(dòng)物視皮層鈣信號(hào)檢測(cè)的方法及其應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 雙光子鈣成像技術(shù)

雙光子鈣成像技術(shù)已經(jīng)成為一種在亞細(xì)胞水平上探索神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的有效方法。其應(yīng)用范圍從亞細(xì)胞成像,如樹突、軸突,到神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的功能分析。雙光子顯微鏡可以對(duì)活體動(dòng)物的神經(jīng)回路進(jìn)行系統(tǒng)的成像,可以同時(shí)記錄多個(gè)神經(jīng)元,允許在小鼠皮層上以單細(xì)胞分辨率對(duì)神經(jīng)元群進(jìn)行活體功能成像[6]。雙光子顯微鏡的光源是一種飛秒激光,它可以發(fā)出具有高峰值功率的周期性脈沖序列的紅外波段。由于紅外光對(duì)組織的穿透性較深,因此雙光子顯微鏡非常適合于組織成像。在典型的雙光子顯微鏡中,一束飛秒激光被聚焦到一個(gè)有限衍射點(diǎn)上,然后掃描整個(gè)目標(biāo)皮層,皮層被激發(fā)后,可以發(fā)射出被光電倍增管(PMT)收集的熒光,最終由探測(cè)系統(tǒng)收集形成一個(gè)圖像。由于樣品是被激發(fā)的,信號(hào)是逐點(diǎn)收集的,這種方法克服了散射組織的寬場(chǎng)成像中出現(xiàn)的像素干擾。此外,較長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)相比于單光子激發(fā)更能抵抗組織的散射。由于雙光子顯微鏡具有較高的光采集效率、穿透深度和較低的光毒性,因此它通常是共聚焦顯微鏡在神經(jīng)元功能成像方面較好的替代物。它使一系列關(guān)于嚙齒類動(dòng)物的神經(jīng)科學(xué)的研究成為可能,如分析皮層之間的功能連接、皮層對(duì)各種感覺(jué)刺激的反應(yīng)、行為過(guò)程中的神經(jīng)活動(dòng)、神經(jīng)血管耦合以及脊柱結(jié)構(gòu)和功能等諸多研究[7]。

雙光子成像允許深入組織觀察,能夠監(jiān)測(cè)神經(jīng)元的Ca2+變化。使用雙光子顯微鏡在模型動(dòng)物的研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展。Tran 等[8]運(yùn)用雙光子在體成像技術(shù)對(duì)小鼠皮層進(jìn)行鈣成像,檢測(cè)到了活躍小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中頻繁的Ca2+瞬變。Muir 等[9]使用漂移光柵和格子模式的刺激來(lái)研究小鼠初級(jí)視覺(jué)皮層(V1 區(qū))對(duì)感覺(jué)特征的局部整合,同時(shí)用雙光子鈣成像記錄麻醉小鼠V1 區(qū)Ⅱ/Ⅲ層視覺(jué)誘發(fā)的神經(jīng)元活動(dòng)。該成像系統(tǒng)是由Ti:藍(lán)寶石激光發(fā)射系統(tǒng)提供波長(zhǎng)為830 nm 或870 nm 的100 fs 激光脈沖來(lái)測(cè)量熒光變化,揭示了小鼠V1 區(qū)神經(jīng)元群在移動(dòng)光柵和格子模式的視覺(jué)刺激階段的視覺(jué)特征的整合水平。McClure 等[10]利用雙光子鈣成像技術(shù)成功地在清醒的小鼠上進(jìn)行測(cè)量了V1 層數(shù)千個(gè)Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元,比較了V1 區(qū)Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元在單模態(tài)(僅視覺(jué))或多模態(tài)(視、聽(tīng))條件下的取向和漂移光柵的方向表征,最終發(fā)現(xiàn)了聲音通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的方向、方向調(diào)節(jié)特性以及響應(yīng)振幅來(lái)改善Ⅱ/Ⅲ層神經(jīng)元中視覺(jué)刺激的方向和方向表征。

雙光子鈣成像在體檢測(cè)技術(shù)在阿爾茨海默病(AD)小鼠模型的研究中也得到了巨大的應(yīng)用,推動(dòng)了對(duì)疾病發(fā)病的認(rèn)識(shí)和治療機(jī)制的研究。近年來(lái),尤其海馬在體雙光子鈣成像檢測(cè)技術(shù)是可以一種直接評(píng)估阿爾茨海默病病理情況的有效方法。海馬體,位于丘腦和內(nèi)側(cè)顳葉之間,具有記憶存儲(chǔ)、空間定位、以及情緒調(diào)節(jié)等功能,同時(shí)也是阿爾茨海默病最先產(chǎn)生病變的地方。Busche[11]通過(guò)雙光子顯微鏡和熒光鈣指示劑對(duì)小鼠海馬體成像,發(fā)現(xiàn)小鼠皮質(zhì)和海馬體神經(jīng)元的淀粉樣蛋白依賴性異?？哼M(jìn)是原發(fā)性神經(jīng)元損傷的結(jié)果,這是以前的體外分析很難做到的。該方法為研究AD 的發(fā)病機(jī)制及治療策略提供了一種理想的體內(nèi)功能測(cè)定方法[12]。

神經(jīng)元樹突在神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中可以同時(shí)計(jì)算電信號(hào)和化學(xué)信號(hào),并將信號(hào)傳向胞體,這一過(guò)程對(duì)大腦的信息處理和交流至關(guān)重要。分析神經(jīng)元樹突上的信號(hào)最常用的方法之一是成像細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的動(dòng)態(tài)變化[13]。雙光子顯微鏡的快速發(fā)展和熒光Ca2+指標(biāo)的改進(jìn)使我們能夠更好地在體外和體內(nèi)條件下研究樹突信號(hào)。Ding 等[14]利用雙光子鈣成像和細(xì)胞內(nèi)藥理學(xué)操作,在體內(nèi)同時(shí)監(jiān)測(cè)到了絨猴大腦視覺(jué)識(shí)別神經(jīng)元的胞內(nèi)電信號(hào)和來(lái)自樹突的Ca2+化學(xué)信號(hào)。Birkner 等[6]使用雙光子顯微鏡超短激光脈沖進(jìn)行成像,并結(jié)合新型熒光鈣指示劑Cal-590 進(jìn)行深度標(biāo)記的方法,成功在小鼠皮層的神經(jīng)元群進(jìn)行活體功能成像,證明了穩(wěn)定皮層的深層記錄并不局限于麻醉的動(dòng)物,而在清醒的、有行為活動(dòng)的老鼠中也是可行的。該方法是對(duì)傳統(tǒng)雙光子顯微鏡的成像的優(yōu)化,大大地增強(qiáng)了雙光子成像的穿透深度。

雙光子顯微鏡的改進(jìn)及其與鈣成像技術(shù)的結(jié)合,使我們能夠利用人工合成或基因工程編碼的鈣指示劑來(lái)測(cè)量深層神經(jīng)元群的活性,在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛,極大地促進(jìn)了腦科學(xué)的研究和發(fā)展。

2 深腦顯微鈣成像技術(shù)

深腦顯微鈣成像技術(shù)是一種輕量級(jí)的成像系統(tǒng),通過(guò)微型熒光顯微鏡系統(tǒng)觀察自由行為的動(dòng)物大腦深處的神經(jīng)活動(dòng),并可以記錄數(shù)周內(nèi)自由移動(dòng)的動(dòng)物視皮層上的神經(jīng)元鈣信號(hào),這對(duì)于理解認(rèn)知功能背后的神經(jīng)編碼機(jī)制具有重要意義。微型熒光顯微鏡系統(tǒng)由微型顯微鏡主體、數(shù)據(jù)采集控制器和帶換向器的數(shù)據(jù)傳輸電纜組成。該系統(tǒng)允許在小鼠的大腦深部區(qū)域進(jìn)行Ca2+成像,可以在自由移動(dòng)的動(dòng)物視皮層上實(shí)現(xiàn)跨越0 ～0.5 mm2區(qū)域的高速細(xì)胞成像,同時(shí)跟蹤跨越9 個(gè)小腦微區(qū)的大于200 個(gè)浦肯野神經(jīng)元Ca2+的峰值[15]。與臺(tái)式顯微鏡相比,微型顯微鏡的主要優(yōu)點(diǎn)是頭戴式和低成本[16]。Ghosh 等[15]首次發(fā)現(xiàn)了帶有熒光燈光源的微型顯微鏡,該顯微鏡體積小,重量輕,易于安裝在小鼠頭上,用于研究自由運(yùn)動(dòng)動(dòng)物的復(fù)雜行為。

近年來(lái),新興的自定義設(shè)計(jì)的GRIN 透鏡系統(tǒng),利用其折射率的內(nèi)部變化來(lái)引導(dǎo)光線從記錄點(diǎn)來(lái)回照射。GRIN 透鏡通常與微型頭戴顯微鏡配合使用,GRIN 鏡頭的長(zhǎng)度大小可以定制,具有更大的視野和更寬的焦距。在與GRIN 透鏡相結(jié)合后,微型顯微鏡成像系統(tǒng)可以記錄數(shù)百個(gè)大腦深層區(qū)域的神經(jīng)元的鈣活動(dòng)長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。這些透鏡可以用來(lái)觀察位于大腦深部區(qū)域(如下丘腦)中帶有基因標(biāo)記的神經(jīng)元活動(dòng),從而大大增加了大腦監(jiān)測(cè)的神經(jīng)元的數(shù)量,有助于解碼特定行為背后的神經(jīng)表征。Zhang 等[17]在微型顯微鏡成像的基礎(chǔ)上結(jié)合GRIN透鏡系統(tǒng),成功對(duì)行為動(dòng)物大腦深部神經(jīng)元進(jìn)行鈣成像。該系統(tǒng)從微型顯微鏡的設(shè)計(jì)、GRIN 透鏡植入的手術(shù)過(guò)程、微型顯微鏡在小鼠頭部的安裝以及數(shù)據(jù)采集與分析進(jìn)行改造。其原理是利用表達(dá)鈣離子指示劑(GCaMP6)的病毒來(lái)標(biāo)記靶腦區(qū)域,在目標(biāo)大腦區(qū)域上方植入一個(gè)GRIN 透鏡,在小鼠手術(shù)恢復(fù)后,將微型鏡安裝在小鼠頭部上方,最后將自由活動(dòng)老鼠的神經(jīng)元活動(dòng)記錄下來(lái)。Ziv 等[18]在反復(fù)探索熟悉環(huán)境的自由活動(dòng)小鼠身上,使用集成顯微透鏡系統(tǒng)進(jìn)行鈣成像,在數(shù)周內(nèi)跟蹤了數(shù)千個(gè)CA1 錐體細(xì)胞Ca2+動(dòng)態(tài)變化。Barretto 等[19]利用復(fù)合雙透鏡梯度折射率(GRIN)微透鏡,追蹤了成年小鼠的CA1 海馬錐體神經(jīng)元樹突,發(fā)現(xiàn)這些樹突具有極高的穩(wěn)定性,而且它們的結(jié)構(gòu)改變非常罕見(jiàn)。Rehani 等[20]利用微型內(nèi)窺鏡成像系統(tǒng),將GRIN 透鏡植入大腦深處,成功地對(duì)自由運(yùn)動(dòng)小鼠紋狀體膽堿能間神經(jīng)元鈣活動(dòng)進(jìn)行成像,揭示了膽堿能中間神經(jīng)元神經(jīng)纖維網(wǎng)的活動(dòng)模式。

Sato 等[21]開發(fā)了一種快速的雙光子變焦顯微內(nèi)窺鏡系統(tǒng),該系統(tǒng)具有GRIN 透鏡和顯微內(nèi)窺鏡,能夠以較高的掃描速度對(duì)老鼠體內(nèi)背側(cè)海馬CA1和杏仁核區(qū)域的神經(jīng)元活動(dòng)進(jìn)行鈣成像。通過(guò)在小鼠海馬和杏仁核中呈現(xiàn)不同的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)的多平面模式,證明了它在體內(nèi)成像中的作用。這種多焦點(diǎn)顯微內(nèi)窺鏡系統(tǒng)為目前的單平面深部腦成像方法增加了一個(gè)新的維度。

該系統(tǒng)提供了直接進(jìn)入大腦深部目標(biāo)區(qū)域的途徑。大腦皮層下的區(qū)域,如海馬、丘腦和下丘腦,甚至精細(xì)的結(jié)構(gòu),如CA1 海馬中的樹突棘,都可以成像[22],是目前對(duì)大腦中任何深度的神經(jīng)回路活動(dòng)進(jìn)行可靠的細(xì)胞分辨率成像最有前途的技術(shù)。因此可以用于研究腦內(nèi)的皮層動(dòng)態(tài)變化和信息交流,從而闡明大腦信息編碼的神經(jīng)元機(jī)制。

3 光纖記錄技術(shù)

光纖記錄技術(shù),又稱為光纖光度檢測(cè),是近幾年興起的一種利用光纖記錄鈣信號(hào)的方法?？梢酝ㄟ^(guò)靈活的輕型光纖傳導(dǎo)來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)自由活動(dòng)動(dòng)物大腦深處的神經(jīng)元活性變化。因其操作簡(jiǎn)單、方便且允許檢測(cè)特定細(xì)胞類型的神經(jīng)元活動(dòng)得到了廣泛應(yīng)用[23]。當(dāng)受到外界行為刺激時(shí),神經(jīng)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一系列活動(dòng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣水平的升高,進(jìn)而提高GCaMP 等熒光指示劑的熒光強(qiáng)度。該系統(tǒng)通過(guò)一根細(xì)的多模光纖進(jìn)入大腦,然后通過(guò)同一根光纖收集發(fā)射信號(hào)。熒光通過(guò)埋植在特定腦區(qū)的光纖陶瓷插芯導(dǎo)出,光電倍增管可以靈敏的檢測(cè)其信號(hào),并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)。電信號(hào)放大濾波后,被計(jì)算機(jī)光纖記錄系統(tǒng)采集到,進(jìn)一步分析研究神經(jīng)元活動(dòng)和行為的相關(guān)性。因?yàn)檫@些光纖質(zhì)量很輕,可以彎曲,動(dòng)物可以不受阻礙地移動(dòng),從而將神經(jīng)元活動(dòng)與動(dòng)物的特定行為聯(lián)系起來(lái)。這對(duì)于理解特定神經(jīng)元群在指揮或響應(yīng)某個(gè)動(dòng)作或刺激時(shí)所扮演的角色至關(guān)重要[24]。

光纖記錄可以長(zhǎng)時(shí)程穩(wěn)定檢測(cè)神經(jīng)元活性,Zhang 等[25]成功采用了光纖記錄技術(shù)檢測(cè)小鼠在自由運(yùn)動(dòng)過(guò)程中初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層和初級(jí)視覺(jué)皮層(M1和V1)第5 層的Ca2+信號(hào)。這種方法通過(guò)微量注射攜帶鈣離子濃度指示蛋白的熒光指示劑(常用GCaMP 熒光指示劑)到特定腦區(qū),利用指示劑的熒光強(qiáng)度變化將神經(jīng)元中鈣離子的濃度變化表現(xiàn)出來(lái),通常可以檢測(cè)到腦區(qū)神經(jīng)元鈣活動(dòng)的范圍大約300 ～500 μm。Stroh 等[26]同樣應(yīng)用光纖記錄技術(shù)證明了視覺(jué)誘發(fā)刺激產(chǎn)生的Ca2+波首先發(fā)生在視覺(jué)皮層。Cui 等[27]設(shè)計(jì)了一套光纖系統(tǒng)來(lái)測(cè)量熒光生物傳感器在自由活動(dòng)的小鼠大腦深部結(jié)構(gòu)中表達(dá)的強(qiáng)度、發(fā)射光譜和壽命,當(dāng)與鈣依賴選擇性表達(dá)基因編碼的鈣離子指示劑(GECIs)相結(jié)合時(shí),該系統(tǒng)可用于測(cè)量執(zhí)行復(fù)雜行為任務(wù)的小鼠特定細(xì)胞群的平均神經(jīng)活動(dòng),并記錄了執(zhí)行杠桿壓迫操作任務(wù)的小鼠中與鈣峰值相關(guān)的熒光變化。大腦梨狀皮層是重要的嗅覺(jué)中樞,主要參與嗅覺(jué)信息的學(xué)習(xí)和編碼,并接受強(qiáng)烈的5-羥色胺能(5-HT)神經(jīng)支配,但梨狀皮層如何受5-HT 的調(diào)節(jié)在很大程度上仍是未知的。Wang 等[28]利用鈣光纖光度檢測(cè)技術(shù)和光遺傳學(xué)技術(shù)研究了5-HT 如何影響前梨狀皮層(the anterior piriform cortex,aPC)錐體神經(jīng)元的活性,發(fā)現(xiàn)了5-HT 通過(guò)5-HT2C受體、磷脂酶C 和鈣激活鉀(BK)通道直接降低錐體神經(jīng)元的興奮性。此外,內(nèi)源性血清素能減弱aPC 錐體神經(jīng)元中氣味引起的鈣反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)確定了aPC 的5-羥色胺能的調(diào)節(jié)機(jī)制,并闡明了其潛在作用。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)多巴胺能神經(jīng)元在高度覺(jué)醒的各種依賴行為中起著關(guān)鍵作用,然而,VTA 多巴胺能神經(jīng)元在覺(jué)醒調(diào)節(jié)中的作用尚未被完全了解。Eban 等[29]使用光纖光度檢測(cè)技術(shù)記錄了自由活動(dòng)小鼠的鈣活性,發(fā)現(xiàn)了VTA 多巴胺能神經(jīng)元的不同投射對(duì)覺(jué)醒有不同的調(diào)節(jié)作用,揭示了VTA 多巴胺能回路在維持清醒狀態(tài)和與動(dòng)物行為學(xué)相關(guān)的睡眠相關(guān)行為中的基本作用。

光纖質(zhì)量很輕,高度靈活,不需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行固定,而且直徑相對(duì)較小是收集深層腦組織熒光信號(hào)的極佳選擇。該技術(shù)不僅適用于同一動(dòng)物大腦不同區(qū)域神經(jīng)元活動(dòng)的記錄,也適用于不同模型動(dòng)物的記錄。因此,可以廣泛應(yīng)用于自由運(yùn)動(dòng)的模型動(dòng)物的行為學(xué)研究。

4 鈣離子熒光指示劑的發(fā)展與應(yīng)用

近年來(lái),鈣成像技術(shù)在研究在體神經(jīng)元方面變得越來(lái)越重要,而鈣離子熒光指示劑的發(fā)展與應(yīng)用起到了巨大的推動(dòng)作用。帶有熒光示蹤劑的鈣成像技術(shù)為監(jiān)測(cè)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢惶峁┝艘环N光學(xué)方法。目前普遍作為微電極記錄的補(bǔ)充,來(lái)測(cè)量神經(jīng)元在體內(nèi)的活動(dòng),這種方法為小型模型動(dòng)物大腦神經(jīng)元群活動(dòng)的重建開辟了道路。

最早用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞鈣信號(hào)動(dòng)力學(xué)的鈣指示劑是生物熒光鈣結(jié)合光蛋白。隨著技術(shù)的發(fā)展,更加靈敏和通用的鈣熒光指示劑被發(fā)現(xiàn),鈣離子的結(jié)合引起分子構(gòu)象的變化,從而導(dǎo)致熒光的強(qiáng)度變化。第一代鈣熒光指示劑由Indo-1,Fura-2,Quin-2,和Fluo-3 等組成。其中,Fura-2 是當(dāng)時(shí)比較常用的一種鈣螯合劑與熒光團(tuán)的結(jié)合物,其發(fā)射的熒光強(qiáng)度隨鈣離子濃度的變化而變化,可以達(dá)到較高的空間分辨率[30]。但因其時(shí)間分辨率較低,組織分布不均勻等缺點(diǎn)逐漸被代替?，F(xiàn)在最廣泛使用的熒光指示劑是GCaMP,它是一種新型基因編碼的鈣離子指示劑(GECIs),含有一種綠色熒光蛋白(GFP),可以與鈣調(diào)蛋白和一種來(lái)自平滑肌肌球蛋白輕鏈激酶(RS20)的肽融合。鈣離子誘導(dǎo)鈣調(diào)蛋白與RS20 結(jié)合,增加其結(jié)合的GFP 分子的熒光[31]。由于細(xì)胞內(nèi)的鈣水平會(huì)隨著動(dòng)作電位的激發(fā)而升高,導(dǎo)致鈣自然流入細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有足夠的鈣時(shí),鈣與鈣指示劑結(jié)合不到一秒鐘,就能改變連接兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的GFP 蛋白的構(gòu)象,從而誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)[32]。因此可以作為一種測(cè)量鈣信號(hào)的指標(biāo)。Chen 等[33]利用慢病毒(AAV)將GCaMP 變異基因?qū)胄∈笠曈X(jué)皮層神經(jīng)元,通過(guò)體內(nèi)成像檢測(cè)到了單個(gè)樹突棘神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的鈣瞬變。隨著基因編碼的鈣指示劑(GECIs)光學(xué)技術(shù)的最新進(jìn)展,已經(jīng)有可能將這些熒光指示劑表達(dá)到特定的神經(jīng)元亞群中,并監(jiān)測(cè)這些神經(jīng)元的熒光變化,可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)實(shí)時(shí)監(jiān)控的細(xì)胞和分子活動(dòng)[34]。所以,這是用于研究腦皮層神經(jīng)元的一種非常好的記錄方法。

5 總結(jié)

不同的生物學(xué)問(wèn)題將決定選擇不同的研究方法,各種方法最終將相互補(bǔ)充,共同揭示動(dòng)物行為的神經(jīng)機(jī)制。雙光子鈣成像技術(shù)可以特異性記錄大量神經(jīng)元,但僅限于麻醉或頭部受限的小鼠皮層淺層區(qū)域[35-36],并且在頭部固定下,一定的束縛會(huì)對(duì)研究造成影響?；贕RIN 透鏡系統(tǒng)的微型顯微鏡對(duì)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)的限制比較小,且能在腦區(qū)深部進(jìn)行成像,是一種解決雙光子成像問(wèn)題比較好的方法。但由于成像裝置價(jià)格昂貴,手術(shù)難度較大[15,18],并且植入的GRIN 透鏡直徑較大(通?！? mm),可能會(huì)造成嚴(yán)重的組織損傷,組織損傷預(yù)計(jì)是探頭直徑的二次函數(shù),因此,即使成像探頭的直徑稍微減小,也可能會(huì)導(dǎo)致組織損傷[27]。目前基于光纖的鈣信號(hào)檢測(cè)技術(shù)隨著鈣熒光指示劑的發(fā)展日趨成熟,但由于其空間分辨率效果差,信號(hào)不特異,不能反映單個(gè)神經(jīng)元活性,記錄過(guò)程中形成的光漂白和光毒性比較大等缺點(diǎn),使其應(yīng)用受到一定限制。

6 前景

未來(lái)幾年,另一個(gè)重要的領(lǐng)域很可能會(huì)大力擴(kuò)展,那就是在清醒、行為正常的動(dòng)物身上,對(duì)特定類型的皮層神經(jīng)元進(jìn)行鈣成像。這些研究將不會(huì)局限于大鼠,但很可能會(huì)擴(kuò)展到其他模型,如雪貂,貓,尤其是靈長(zhǎng)類動(dòng)物。一個(gè)影響越來(lái)越大的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)⑹窃诟鞣N神經(jīng)元疾病研究中使用鈣成像技術(shù)來(lái)詳細(xì)分析疾病的生物學(xué)機(jī)制[37]。期待著鈣成像技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,相信未來(lái)3D 成像和用于自由移動(dòng)動(dòng)物的微型化設(shè)備的設(shè)計(jì)將成為可能。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展,鈣信號(hào)檢測(cè)技術(shù)日新月異,極大地促進(jìn)了神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的研究和發(fā)展,在神經(jīng)系統(tǒng)乃至神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域中有更加深入的應(yīng)用。