楊夢恬, 袁菊懋

1.暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 廣州 510000;2.珠海中科先進(jìn)技術(shù)研究院, 廣東 珠海 519000

結(jié)腸癌是發(fā)生于結(jié)腸部位的消化道惡性腫瘤，據(jù)2018年的全球癌癥統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示，全球新增結(jié)腸癌病例約為180萬，結(jié)直腸癌的新增病例約占患癌新增病例的12.1%[1]。全球約有88萬例結(jié)腸癌的死亡病例，死亡率大概占全球癌癥死亡率的9.2%[2-3]。有研究表明，我國約54%的人口存在腸道問題[4]。結(jié)腸癌的發(fā)生有飲食因素和遺傳因素，其中遺傳因素對于結(jié)腸癌的發(fā)生尤為重要。導(dǎo)致未滿25歲的青少年患結(jié)腸癌的首要誘發(fā)條件便是遺傳性的結(jié)腸疾病[4]?，F(xiàn)階段關(guān)于結(jié)直腸癌的基因治療包括原癌基因沉默治療、抑癌基因治療、免疫基因治療和抑制腫瘤血管生成基因治療等[5]。然而，由于基因的多態(tài)性，靶向基因治療仍有風(fēng)險(xiǎn)，所以目前仍需進(jìn)一步研究有效治療結(jié)腸癌的策略。因此，尋找與新的結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)的基因顯得尤為迫切。同時(shí)，這也為揭示結(jié)腸癌病理、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)以及提高臨床預(yù)后提供了理論和依據(jù)。

RTN4基因(reticulon 4)屬于網(wǎng)紋網(wǎng)基因編碼家族，此家族與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)，參與神經(jīng)分泌或者神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的膜運(yùn)輸。RTN4與促生存以及細(xì)胞骨架相關(guān)過程有關(guān)，其下調(diào)降低了鞘磷脂的合成，能夠干擾AKT的質(zhì)膜定位以及影響微管蛋白的穩(wěn)定性[6]，這提示其可能參與調(diào)控細(xì)胞自噬。除此之外，RTN4基因在人類的多種癌癥細(xì)胞中發(fā)生突變[6]。

有研究表明，在正常組織中可以通過自噬介導(dǎo)的損傷緩解來抑制腫瘤細(xì)胞。因此，正常細(xì)胞激活自噬可以抑制腫瘤的發(fā)生，在腫瘤治療中，激活自噬可能有助于腫瘤治療[7]。自噬小體中存在的LC3-I和LC3-II是細(xì)胞發(fā)生自噬的分子標(biāo)志。在自噬發(fā)生的過程中，LC3先通過切除C端的氨基酸轉(zhuǎn)化為產(chǎn)生胞漿定位的LC3-I、LC3-I，再通過結(jié)合磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)產(chǎn)生LC3-II[8]。LC3-II的含量和發(fā)生自噬的程度成正比，LC3-II/I比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低。

由此，本文對與結(jié)腸癌細(xì)胞相關(guān)的RTN4基因進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析，通過設(shè)計(jì)構(gòu)建敲低的RTN4基因質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116，觀察被轉(zhuǎn)染了敲低RTN4基因的質(zhì)粒的結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力以及檢測自噬相關(guān)蛋白標(biāo)志物，以期探索RTN4基因與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為結(jié)腸癌的防治研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 本次研究所用到的細(xì)胞系主要有：HCT116、HEK293T。其中培養(yǎng)HCT116細(xì)胞的培養(yǎng)基為GIBCO 1640完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)HEK293T的培養(yǎng)基為GIBCO DMEM完全培養(yǎng)基。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO公司；DMSO購自美國Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Lipofectamine 3000、無血清培養(yǎng)基Opti-MEM ?、細(xì)胞增殖檢測Cell TraceTMCFSE Cell Proliferation Kit購自美國Invitrogen公司；質(zhì)粒DNA小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒購自天根生化公司。

1.1.3主要儀器設(shè)備 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購自香港Heal Force公司；熒光定量PCR儀、凝膠成像分析儀、PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1通過生物信息學(xué)網(wǎng)站分析基因功能 通過The Human Protein Atlas(https://www.proteinatlas.org/)查詢RTN4基因的生存曲線，查看RTN4基因的表達(dá)水平與患者生存率的聯(lián)系。

1.2.2構(gòu)建RTN4敲低質(zhì)粒 利用Thermo Fisher公司RNAi網(wǎng)站設(shè)計(jì)出針對RTN4基因特異性敲減的片段，然后通過對pLKO.1載體進(jìn)行雙酶切，膠回收純化后，經(jīng)T4連接酶將雙酶切線性化載體與設(shè)計(jì)的目的片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化和質(zhì)粒提取，采用雙酶切和測序的方法對重組質(zhì)粒進(jìn)行序列鑒定。

1.2.3RTN4敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞 通過胰酶消化收集細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基平鋪HCT116細(xì)胞于35 mm 培養(yǎng)皿上，當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2 h換液(用1.5 mL 完全培養(yǎng)基置換舊的培養(yǎng)基)。收集病毒上清。將細(xì)胞平鋪于6孔板，最佳密度為30%～70%。加入病毒上清和8 g·mL-1polybrene, 充分搖勻后置于37 ℃溫箱孵育。12～24 h 后換液，長滿后傳代。經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定株，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的敲減效率進(jìn)行驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)為：RTN4：F：5’-TCTTCCTGCTGCATCTGAGCCT-3’，R:5’-GCAGTTTCAAGCAGGACAGATGG-3’; ACTIN：F:5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，R:5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。

1.2.4WST-1檢測細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 96孔板每孔加入5 000個(gè)細(xì)胞。分別于培養(yǎng)48和72 h檢測細(xì)胞活性。每孔加入10 μL WST-1溶液。用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和WST-1溶液但沒有加入細(xì)胞的孔作為空白對照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5～4 h，把96孔板置于130 r·min-1搖床上1 min，以充分混勻待檢測體系，在450 nm測定吸光度。

1.2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 配置分離膠為12% SDS-PAGE凝膠，接著加入適量的電泳緩沖液在電泳槽中。取出蛋白樣品，用移液器移入凝膠孔中上樣。蓋上電泳槽，設(shè)置電泳參數(shù)進(jìn)行電泳。剪出與凝膠相同尺寸的PVDF膜，將凝膠放在濾紙中間且浸在都是緩沖液的轉(zhuǎn)移槽中貼膜，接著合上轉(zhuǎn)移槽，通電，在裝滿冰的盆中放入轉(zhuǎn)移槽，恒壓90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h。將轉(zhuǎn)移好的膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下封閉1 h。將一抗稀釋至適當(dāng)濃度，4 ℃孵育過夜。從一抗中取出膜，用TBST洗滌共3次，每次5 min。將膜放置于裝有二抗的平皿中室溫孵育1 h。1 h后，從二抗中取出膜，用TBST洗滌共3次，每次5 min。顯影液的配置：放入等體積的發(fā)光試劑A液和B液混勻于EP管中。最后用濾紙吸干膜上殘留水分，顯影盤上擺放膜，加入適量顯影液后，用圖像處理軟件Image J，進(jìn)行顯影、拍照，并分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)腸癌相關(guān)基因與結(jié)腸癌患者生存率分析

為了更好地了解RTN4與結(jié)腸癌的關(guān)系，根據(jù)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析，查詢RTN4基因與結(jié)腸癌患者生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)RTN4基因表達(dá)水平高的結(jié)腸癌患者的生存率高于RTN4基因表達(dá)水平低的結(jié)腸癌患者(圖1)。這說明，RTN4基因有可能是潛在的抑癌基因。

圖1 RTN4基因與結(jié)腸癌患者的生存率分析Fig.1 Survival analysis of colon cancer patients with RTN4 gene

與此同時(shí)，本研究根據(jù)The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)69%的病人在5年內(nèi)生存情況下RTN4基因表達(dá)水平較中位數(shù)高，45%的病人在5年內(nèi)生存情況下RTN4基因表達(dá)水平較中位數(shù)低。

2.2 RTN4基因表達(dá)在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況

為了系統(tǒng)地觀察RTN4基因是否對于結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有作用，本研究通過比較正常人與結(jié)腸癌病人的結(jié)腸組織(圖2)，利用The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫，分析表達(dá)譜數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)RTN4基因在結(jié)腸癌患者組織中表達(dá)水平偏低。

2.3 RTN4基因的敲低對結(jié)腸癌的影響

2.3.1獲得低表達(dá)RTN4的細(xì)胞株 為了進(jìn)一步驗(yàn)證RTN4基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞增殖能力的影響，本研究構(gòu)建了低表達(dá)RTN4的細(xì)胞系。通過qPCR檢測RTN4基因mRNA水平的表達(dá)量，結(jié)果顯示RTN4在細(xì)胞中的表達(dá)量顯著下調(diào)(圖3)，證明成功構(gòu)建了低表達(dá)RTN4的HCT116細(xì)胞系。

2.3.2RTN4基因的敲低對細(xì)胞增殖能力的影響

為了驗(yàn)證敲低RTN4基因是否對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響，通過WST-1細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果(圖4)顯示，敲低RTN4基因促進(jìn)了HCT116細(xì)胞增殖，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3.3敲低RTN4基因后對自噬蛋白表達(dá)情況的影響 通過對比對照組(圖5)，發(fā)現(xiàn)RTN4基因敲低組的LC3-II/LC3-I蛋白的轉(zhuǎn)化量增多，p62蛋白減少。本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力變強(qiáng)，驗(yàn)證了敲低RTN4基因會顯著增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力，并且可能通過激活LC3/p62蛋白自噬來誘導(dǎo)自噬。

A:女性，62歲，正常結(jié)腸組織；B:男性，14歲，正常結(jié)腸組織；C:男性，73歲，正常結(jié)腸組織；D:女性，61歲，正常結(jié)腸組織；E:男性，87歲，結(jié)腸癌組織；F:男性，55歲，結(jié)腸癌組織；G:男性，82歲，結(jié)腸癌組織；H:女性，86歲，結(jié)腸癌組織圖2 正常結(jié)腸組織與結(jié)腸癌組織Fig.2 Normal colon tissue and colon cancer tissue

注：SH-RTN4—RTN4低表達(dá)細(xì)胞系。圖3 插入RTN4敲低質(zhì)粒后細(xì)胞內(nèi)RTN4基因mRNA的表達(dá)情況Fig.3 Expression of RTN4 mRNA in cells after insertion of RTN4 knock-down plasmid

3 討論

將生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)分析應(yīng)用于腫瘤相關(guān)的研究是近年來炙手可熱的手段之一。有研究團(tuán)隊(duì)利用生物信息學(xué)分析對甲狀腺癌癥患者的病理組織與正常人進(jìn)行對比，通過高通量測序分析，發(fā)現(xiàn)甲狀腺癌癥患者1 133位氨基酸處的Nebulin gene(NEB)突變頻率高于正常人[9]。也有研究利用生物信息學(xué)分析了與免疫相關(guān)的長鏈非編碼RNA，通過評估其預(yù)后，發(fā)現(xiàn)它在免疫治療效果方面具有潛力[10]。本團(tuán)隊(duì)通過文獻(xiàn)查閱以及使用大數(shù)據(jù)分析平臺The Human Protein Atlas在線數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)分析，發(fā)現(xiàn)PRKCB、SLC9A3R1、CYB5A以及RTN4基因與結(jié)腸癌患者生存率具有顯著的相關(guān)性，是潛在的抑癌基因,CYB5A和SLC9A3R1目前研究較多。有關(guān)胰腺癌的研究通過實(shí)驗(yàn)與分析發(fā)現(xiàn)CYB5A可誘導(dǎo)自噬，且同時(shí)抑制胰腺癌腫瘤細(xì)胞的生長與轉(zhuǎn)移來提高生存率[11]；有研究表明，在惡性卵巢癌腫瘤中的SLC9A3R1基因剪接識別位點(diǎn)的突變會影響癌細(xì)胞行為[12]。這與我們通過數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果一致。本研究通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RTN4基因的病人的生存率高于低表達(dá)RTN4的病人的生存率，因而選取RTN4基因研究其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的功能。后續(xù)實(shí)驗(yàn)仍有待進(jìn)一步研究PRKCB、SLC9A3R1和CYB5A在結(jié)腸癌中的作用。

注：SH-RTN4—RTN4低表達(dá)細(xì)胞系。*—同一時(shí)間處理內(nèi)與對照相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。圖4 RTN4敲低后結(jié)腸腫瘤細(xì)胞在不同時(shí)間的增殖情況Fig.4 Proliferation of colon tumor cells at different time after RTN4 knock-down

圖5 RTN4基因敲低后自噬蛋白的表達(dá)情況Fig.5 Expression of autophagy proteins after RTN4 knock-down

在與鼻咽癌相關(guān)研究中，RTN4基因中的rs292081多態(tài)性與鼻咽癌易感性的增加有顯著關(guān)聯(lián)[13]。在相關(guān)的前列腺癌研究中，通過實(shí)驗(yàn)表明，慢病毒介導(dǎo)的RTN4過表達(dá)可以顯著抑制前列腺癌細(xì)胞(DU145以及LNCaP)，RTN4過表達(dá)前列腺癌細(xì)胞在細(xì)胞周期阻滯G2/M期明顯衰老，這些結(jié)果表明RTN4基因以某種方式參與了前列腺癌腫瘤的進(jìn)展[14]。在胃癌、肺癌、腎癌、乳腺癌等相關(guān)研究中，RTN4的基因表達(dá)會影響病人的存活率，RTN4基因高表達(dá)會顯著提升病人的存活率。由此可見，RTN4在腫瘤形成中參與了重要的作用[6]。

本研究成功構(gòu)建了RTN4干擾質(zhì)粒，通過慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建了敲低RTN4的直結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116，發(fā)現(xiàn)了敲低RTN4基因的表達(dá)后，會促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的增殖。這些結(jié)果提示RTN4基因在結(jié)腸癌中的低表達(dá)與結(jié)腸癌腫瘤的發(fā)生和增殖有著密切的關(guān)系，同時(shí)說明了RTN4基因?qū)Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的生長具有抑制作用，揭示了該基因是潛在的治療結(jié)腸癌的基因靶點(diǎn)。

自噬分子通路也與惡性腫瘤密切相關(guān)。目前有3種自噬測量方法：電鏡觀察、Western blot蛋白免疫印跡技術(shù)以及LC3免疫熒光顯微鏡技術(shù)。其中，主要通過在不同條件下觀察LC3蛋白(微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3，microtubule-associated protein1 light chain3)的濃度變化來研究。在自噬發(fā)生過程中，LC3蛋白合成后立即在其羧基端被Atg4所剪切，Atg7和Atg3在內(nèi)的泛素樣本體系會修飾和加工產(chǎn)生細(xì)胞漿定位的LC3-I，產(chǎn)生分子量為14 kD的LC3-II，并定位到自噬小體中。LC3的表達(dá)以及LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化程度已在檢測自噬水平中成為重要標(biāo)志[15]。自噬可以保護(hù)休眠的腫瘤細(xì)胞，在乳腺癌相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)自噬水平表達(dá)，可以抑制TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，TNF-related apoptosis-inducing ligand)，而TRAIL可以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。在缺氧、營養(yǎng)缺失的腫瘤微環(huán)境下，激活自噬有助于肝腫瘤干細(xì)胞CD133+的存活[17]。因此，研究自噬表達(dá)水平對觀察腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有著重要作用。研究表明，RTN4基因的下調(diào)會影響鞘磷脂的合成以及削弱AKT的質(zhì)膜定位，同時(shí)也會在體外抑制癌細(xì)胞的增殖。本研究中敲低RTN4基因后，p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)化程度提高，表明敲低RTN4促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116發(fā)生自噬，可能是潛在的抑制腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，然而其具體的關(guān)鍵效應(yīng)分子仍待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究對結(jié)腸癌相關(guān)基因RTN4進(jìn)行生物信息學(xué)大數(shù)據(jù)分析，查詢了RTN4基因的功能信息，然后構(gòu)建了敲低RTN4基因的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染進(jìn)腸癌HCT116細(xì)胞，觀察腫瘤細(xì)胞的生長速度。研究發(fā)現(xiàn)RTN4基因與結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞有密切聯(lián)系，敲低RTN4基因轉(zhuǎn)染進(jìn)腸癌細(xì)胞會促進(jìn)其生長，同時(shí)激活了自噬通路。因此，本研究為進(jìn)一步探索RTN4基因?qū)τ诮Y(jié)腸癌細(xì)胞的影響機(jī)制提供了研究方向和理論基礎(chǔ)。