白 鑫，孫安然，楊光友*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川成都 611130；2.四川省自貢市大安區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川自貢 643010)

兔球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲寄生于兔的腸道或膽管上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種寄生蟲病。隨著規(guī)?；B(yǎng)兔的發(fā)展，兔球蟲病的危害在近些年逐步顯現(xiàn)，對我國養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展造成很大影響。在目前公認(rèn)的感染兔的11種艾美耳球蟲中，斯氏艾美耳球蟲(E.stiedai)致病性較強(qiáng)、危害較大，且是唯一寄生在兔肝膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的兔球蟲。

1 病原形態(tài)特征

斯氏艾美耳球蟲卵囊一般為長卵圓形或近似橢圓形，卵囊大小為36.4 μm(31.3 μm～38.7 μm)×22.8 μm(19.1 μm～27.8 μm)，卵囊指數(shù)為1.59，不同地區(qū)分離株大小有一定差異[1]。卵囊一般呈淡黃或橘黃色，在較小一端往往呈削平狀或凹陷，卵囊壁非常薄、整體上光滑均厚，成熟卵囊內(nèi)沒有外殘?bào)w，有些卵囊存在散在顆粒狀外殘?bào)w，但因?yàn)殒咦幽业恼趽醵茈y被看到。孢子囊為長卵圓形，一端有斯氏體，內(nèi)殘?bào)w明顯。子孢子的寬端有一折光體位于核后，呈球形，約占子孢子縱長的1/3～2/5。

2 生活史

斯氏艾美耳球蟲是少數(shù)幾種寄生在肝臟膽管上皮細(xì)胞內(nèi)的球蟲之一，它的發(fā)育過程可分為裂殖生殖、配子生殖和孢子生殖3個(gè)階段。家兔食入孢子化卵囊后，經(jīng)過腸道中膽汁和胰酶的作用，子孢子從卵囊中逸出，進(jìn)入腸固有層淋巴管、腸系膜淋巴結(jié)，然后通過乳糜池進(jìn)入血液循環(huán)，隨著肝動脈流入膽管周圍毛細(xì)血管叢并由此處侵入膽管上皮細(xì)胞。

子孢子鉆入上皮細(xì)胞后，很快擴(kuò)大變成裂殖體，經(jīng)過多次分裂后形成許多裂殖子。這些裂殖子從死亡的上皮細(xì)胞中溢出，繼續(xù)侵襲新的上皮細(xì)胞。在裂殖生殖階段，Pellerdy L P等曾提出有5代或6代，裂殖體可分為A、B兩型或三型。國內(nèi)一般將裂殖生殖劃分為4代，并首次提出肝球蟲裂殖生殖具有多態(tài)現(xiàn)象，即裂殖體以多態(tài)方式產(chǎn)生下代裂殖子，包括子孢子型裂殖體、雙核或多核的裂殖子型裂殖體、單核裂殖子型裂殖體和經(jīng)典型裂殖體。經(jīng)過多次無性繁殖，裂殖子會分裂發(fā)育成兩性配子。兩性的大小配子發(fā)育成熟后，小配子進(jìn)入大配子結(jié)合為合子，合子外面迅速包上被膜后形成卵囊并隨糞便排出體外。

剛從糞便中排出的卵囊還未孢子化，不能感染家兔。經(jīng)過適宜的溫度、濕度和氧氣濃度的誘導(dǎo)，可發(fā)育成為具有感染力的孢子化卵囊。孢子化的完成意味著卵囊已具備感染力，過去曾經(jīng)認(rèn)為斯氏體的出現(xiàn)是孢子化完成的標(biāo)志，但后來通過鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)，在子孢子發(fā)育早期即出現(xiàn)斯氏體，因此將子孢子的可分辨度及折光體的出現(xiàn)作為孢子化完成的標(biāo)志比較合理。

3 流行病學(xué)

各種品種和不同年齡的兔都可感染斯氏艾美耳球蟲，但以1月齡～3月齡的兔最易感而且病情嚴(yán)重，死亡率高。該病一年四季均可發(fā)生，陰雨季節(jié)多發(fā)，均呈地方性流行。斯氏艾美耳球蟲病在我國分布范圍很廣，重慶、甘肅、海南、河北、河南、青海、江蘇、山東、陜西、浙江、新疆等地均有報(bào)道。

4 致病性

患病的家兔通常表現(xiàn)出精神不振，食欲減退，動作遲緩，伏臥不動等癥狀。繼續(xù)發(fā)展會出現(xiàn)鼻腔、眼部分泌物及唾液分泌增多，并出現(xiàn)貧血、黃疸及腹瀉，虛弱消瘦，生長停滯。嚴(yán)重病例有時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，站立不穩(wěn)，四肢麻痹，病程較短，很快死亡[2]。剖檢發(fā)現(xiàn)感染嚴(yán)重的家兔肝臟高度腫大，肝臟表面及實(shí)質(zhì)內(nèi)有黃豆大小的沿膽小管分布的白色或淡黃色結(jié)節(jié)。對結(jié)節(jié)病灶進(jìn)行鏡檢，可以看到各個(gè)發(fā)育階段的球蟲，肝實(shí)質(zhì)發(fā)生局部壞死。膽管增生變大，管壁明顯增厚，膽管內(nèi)充滿暗綠色膽汁，鏡檢可見到大量卵囊及脫落的上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞浸潤。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)感染斯氏艾美耳球蟲后丙氨酸轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶活性升高，總蛋白、球蛋白、總膽紅素含量升高[3]。也有學(xué)者檢測了斯氏艾美耳球蟲感染兔的血常規(guī)、肝功能和凝血4項(xiàng)等血液指標(biāo)，肝功能指標(biāo)與其他學(xué)者的結(jié)果基本一致，還發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶顯著增高，血清膽堿酯酶顯著降低[4]。對人工感染斯氏艾美耳球蟲后不同時(shí)間段血清中丙二醛含量及超氧化物歧化酶活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)感染初期丙二醛含量明顯升高，超氧化物歧化酶活性有明顯下降，但后期可逐漸恢復(fù)至正常水平，表明感染所致的病理氧化應(yīng)激可通過肝臟代償維持[5]。

肝球蟲的感染造成肝細(xì)胞的損傷和壞死，影響肝臟的分解、合成、生物轉(zhuǎn)化及排泄功能，使得機(jī)體的代謝功能出現(xiàn)異常，最終導(dǎo)致家兔死亡。在一定的數(shù)量范圍內(nèi)，家兔吞食的卵囊數(shù)越多，表現(xiàn)出的病理變化越明顯[6]。

5 診斷方法

5.1 卵囊漂浮檢測

改進(jìn)的飽和食鹽水漂浮法，只取1粒糞便，加飽和食鹽水?dāng)嚢韬筮^濾進(jìn)青霉素瓶中，用吸管從液面前后左右中5個(gè)方向吸取表面糞液滴加于帶凹槽的載玻片上鏡檢。檢測出了包含斯氏艾美耳球蟲在內(nèi)的7種球蟲，可節(jié)省取樣時(shí)間，操作簡便[7]。

5.2 組織病理學(xué)檢測

病理變化主要發(fā)生在肝臟，肝臟腫大并有結(jié)節(jié)病灶，鏡檢可觀察到肝臟組織變性壞死，肝膽管上皮增生，可見大量不同發(fā)育階段的蟲體[8]。

5.3 血清學(xué)檢測

Rose M E 采用補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)檢測感染斯氏艾美耳球蟲病家兔血清中的抗體，最早可在感染后3 d～7 d檢測到補(bǔ)體結(jié)合滴度的增加。Abu-El-Ezz N M T等[9]采用卵囊計(jì)數(shù)、組織病理學(xué)和ELISA進(jìn)行診斷，發(fā)現(xiàn)使用卵囊抗原檢測抗體的ELISA可在感染后1周檢測到抗體，是早期診斷肝球蟲病的最佳方法。

魏聞芮等[10]建立了一種以斯氏艾美耳球蟲MIC-1和MIC-3重組蛋白為抗原診斷肝球蟲病的間接ELISA方法，敏感性和特異性都非常高，感染后第6、8、10天均能檢測到相應(yīng)的抗體。

5.4 分子生物學(xué)檢測

Oliveir U C等[11]建立了一種基于ITS1序列作為靶標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增來鑒別診斷11種兔球蟲病的方法，種間無交叉反應(yīng)，敏感性可達(dá)0.8個(gè)～1.7個(gè)孢子化卵囊。

閆文朝等[12-13]成功克隆了斯氏艾美耳球蟲完整的 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 序列，并以該序列為目的基因，建立了能有效檢測出50個(gè)斯氏艾美耳球蟲卵囊的靈敏性高、特異性強(qiáng)的PCR檢測方法。還以此為基礎(chǔ)建立了用于區(qū)分和鑒定斯氏艾美耳球蟲病、腸艾美耳球蟲病和黃艾美耳球蟲病的多重PCR診斷方法。

汪運(yùn)舟等[14]建立了基于全基因組擴(kuò)增技術(shù)的兔球蟲單卵囊PCR技術(shù)，能夠在單個(gè)卵囊的水平上進(jìn)行蟲種鑒定，從而大大提高PCR反應(yīng)的靈敏度。

Hassan K M等[15]提取了感染家兔糞便、全血樣本、肝組織的DNA，基于ITS1序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)最早可在感染后12 d從肝組織中檢測到PCR陽性。

梁子平等[16]以球蟲ITS1基因?yàn)榉N屬特異性檢測的PCR分子靶標(biāo)，針對兔源11種艾美耳球蟲病建立了多重PCR聯(lián)檢方法,對檢測目標(biāo)表現(xiàn)出了高敏感性和高特異性。該多重PCR聯(lián)檢方法平均最低可檢測到大約0.8個(gè)～1.7個(gè)的孢子化卵囊。

溫福利等[17-18]根據(jù)E.stiedaiITS1區(qū)域的基因保守序列設(shè)計(jì)引物，建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，可檢出含1個(gè)卵囊DNA的樣本，適用于感染初期的定量檢測。還根據(jù)E.stiedai的ITS1-5.8sRNA-ITS2 基因序列設(shè)計(jì)特異引物，建立了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測方法，對待檢樣本進(jìn)行10倍稀釋后，仍能夠檢測到36 copies/mL的DNA樣本，具有特異性和較高的敏感性。

6 免疫學(xué)

用免疫組化鏈霉親和素-生物素復(fù)合物法對斯氏艾美耳球蟲感染后家兔體內(nèi)球蟲抗原的分布進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)肝臟竇狀隙、膽管上皮細(xì)胞、肝門淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)有明顯的棕黃色陽性反應(yīng)區(qū)，說明這些區(qū)域和部位有相應(yīng)的E.stiedai抗原存在，且抗原數(shù)量最多的是肝臟，其次為脾臟，肝門淋巴結(jié)最少[19]。試驗(yàn)證明，斯氏艾美耳球蟲感染家兔后可以激發(fā)體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的特異性抗體能夠作用于卵囊抗原和糞便抗原，抗體水平高低能夠說明保護(hù)性免疫應(yīng)答水平的高低。

6.1 活疫苗

不同劑量的γ射線輻射可以不同程度地降低斯氏艾美耳球蟲的致病性，45 krad的γ射線輻射劑量仍不能使孢子化卵囊致死。雖不能使接種動物發(fā)病，但能使動物感染，刺激機(jī)體產(chǎn)生相當(dāng)程度的免疫保護(hù)力。

有學(xué)者用超聲處理的卵囊免疫家兔，發(fā)現(xiàn)免疫組的卵囊產(chǎn)出要低于未免疫組，而血清抗體水平則高于未免疫組[20]。

6.2 亞單位疫苗

Hanada S等用從感染兔的膽汁中提取的裂殖體抗原免疫無球蟲兔，發(fā)現(xiàn)免疫兔的膽管周圍聚集較多的炎性細(xì)胞，而蟲體較少，排卵量也少于未免疫的兔。Omata Y等用感染15 d后膽汁中的子孢子和裂殖體抗原免疫兔后再攻蟲，免疫組卵囊排出數(shù)量比對照組少。Abdel K N等用糞抗原加弗氏佐劑免疫接種無球蟲兔后，經(jīng)口攻毒孢子化卵囊。結(jié)果顯示，免疫組排出的卵囊數(shù)量減少，體液免疫應(yīng)答水平也比對照組高，可以提供70%的免疫保護(hù)力。

6.3 疫苗候選基因與基因工程苗

有學(xué)者成功將微線蛋白和肌動蛋白解聚因子基因進(jìn)行克隆并在真核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)，也有學(xué)者原核克隆表達(dá)了菱形體蛋白、熱休克蛋白、天冬氨酸蛋白酶基因并進(jìn)行了Western blot分析[21-26]。

有研究者構(gòu)建了微線蛋白與白介素IL-15共表達(dá)真核載體，并轉(zhuǎn)入減毒鼠傷寒沙門菌，免疫試驗(yàn)結(jié)果表明，該重組菌能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗球蟲細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，抗球蟲指數(shù)達(dá)到160以上，具有中等抗球蟲效力[27]。

7 藥物治療

由于還沒有研究出商品化疫苗，目前斯氏艾美耳球蟲病的防控主要依靠藥物，妥曲珠利、地克珠利、α-二氟甲基鳥氨酸、莫能菌素、鹽霉素、馬杜拉霉素、拉沙洛菌素等都在臨床中有應(yīng)用。

趙愛云等[28]觀察了3種抗球蟲藥對斯氏艾美耳球蟲病的敏感性，結(jié)果表明，球蟲血痢散(主要成分為磺胺喹噁啉)的增重效果較好,但是不能很好地抑制卵囊排出；球蟲血痢清(主要成分為鶴虱、檳榔、雷丸等14種中藥)在增重和抑制卵囊排出這兩方面效果都比較好；試驗(yàn)蟲株已經(jīng)對兔血痢靈(主要成分為鹽酸氯苯胍)產(chǎn)生了一定的耐藥性。

Al-Mathal E M[29]觀察了橄欖科植物沒藥(Commiphoramolmol)對兔肝球蟲病的治療效果，發(fā)現(xiàn)沒藥的商業(yè)化提取物Mirazid和天然產(chǎn)物都可以降低卵囊排出量，最終達(dá)到治愈的效果，但Mirazid更高效。

Baghdadi H B等[30]通過試驗(yàn)證實(shí)黑種草(NigellasativaL.)的種子混懸劑和油乳劑是一種安全有效的治療斯氏艾美耳球蟲病的藥物。

王璽德等[31]通過試驗(yàn)證明灌服石榴皮水提物后，家兔排出的斯氏艾美耳球蟲卵囊的比重顯著減少；飼喂鹽酸氯苯胍的家兔，排出卵囊的比重也減少。

宋宏曉等[32]對比了癸氧喹酯與妥曲珠利對斯氏艾美爾球蟲病的治療效果，發(fā)現(xiàn)在平均增重、卵囊排出量、病變記分方面，兩組差異顯著，妥曲珠利效果優(yōu)于癸氧喹酯。

Indrasanti D等[33]發(fā)現(xiàn)大蒜提取物對斯氏艾美耳球蟲的卵囊形成有一定抑制作用。

蘭家花[34]在一份感染斯氏艾美耳球蟲家兔的診治報(bào)告中，采用氯苯胍按每千克精料加100 mg混合均勻；磺胺六甲氧嘧啶，按每千克精料加1 g混飼1周并配合飼養(yǎng)管理，用藥3 d～5 d后患兔病情開始好轉(zhuǎn)，用藥2個(gè)療程后，未見幼兔死亡，疫情得到有效控制。

Eladl A H等[35]使用商業(yè)化的植物提取物Herba Cox?治療人工感染斯氏艾美耳球蟲病的家兔，感染前7 d到感染后28 d連續(xù)使用，可以減輕臨床癥狀，改善肝臟功能，減少卵囊排出，是一種新型安全高效的治療方法。

從以上研究可以看出，對于抗斯氏艾美耳球蟲病藥物的研究，有從傳統(tǒng)化學(xué)藥物轉(zhuǎn)向天然草本藥物、從治療為主轉(zhuǎn)向預(yù)防為主的趨勢。

8 展望

目前對斯氏艾美耳球蟲病的防控仍是以藥物防治為主，疫苗研究尚未取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，還沒有商業(yè)化疫苗問世。但是，隨著基因組學(xué)的發(fā)展，更多的疫苗候選基因?qū)⒈缓Y選評估，相信不久的將來就可以研制出安全高效的基因工程疫苗，給養(yǎng)兔業(yè)帶來福音。