朱惠麗，劉利敏，王臣榮，張素梅，張龍現(xiàn)，王榮軍

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微小隱孢子蟲在HCT-8細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)

朱惠麗1,2，劉利敏1，王臣榮1，張素梅1，張龍現(xiàn)1，王榮軍1

目的 將人回盲腸癌(HCT-8)細(xì)胞作為微小隱孢子蟲IId亞型體外感染對象，觀察蟲體在細(xì)胞中的生長發(fā)育過程。方法 將純化的隱孢子蟲IId亞型感染HCT-8細(xì)胞，通過Giemsa染色法觀察微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞中發(fā)育過程，運(yùn)用PCR方法對不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品DNA進(jìn)行檢測。結(jié)果 在感染后72 h內(nèi)，隱孢子蟲出現(xiàn)連續(xù)發(fā)育階段，包括脫囊、子孢子、滋養(yǎng)體、裂殖體、配子體、合子和卵囊；PCR的檢測結(jié)果顯示，在感染細(xì)胞96 h仍能檢測到蟲體DNA。結(jié)論 通過HCT-8細(xì)胞，觀察到微小隱孢子蟲IId亞型的完整的生長發(fā)育過程，為抗隱孢子蟲藥物的篩選提供理論基礎(chǔ)，亦可成為微小隱孢子蟲IId亞型卵囊體外擴(kuò)增的方法。

微小隱孢子蟲；感染模型；HCT-8細(xì)胞；培養(yǎng)

Invitroculture ofCryptosporidiumparvumin HCT-8

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一種引起人獸共患病的機(jī)會(huì)性原蟲，其嚴(yán)重威脅免疫功能低下及免疫功能缺陷者的生命安全，特別是艾滋病患者[1]。隱孢子蟲可以感染包括人和其他哺乳動(dòng)物、鳥類、爬行類、兩棲類和魚類的240多種動(dòng)物[2]，造成重大經(jīng)濟(jì)影響和社會(huì)影響。同時(shí)，隱孢子蟲病也是一種重要的食源/水源性疾病, 從2004年至2010年12月，全球有記錄的水源性隱孢子蟲病暴發(fā)共120起，與飲用水和娛樂水相關(guān)的暴發(fā)占46%和54%[3]。在我國的水體系統(tǒng)中，隱孢子蟲的分布也極其廣泛，在河水、水庫和飲用原水中均檢測到有隱孢子蟲。隱孢子蟲已被我國列為城市用水和飲用水的監(jiān)測指標(biāo)之一。

盡管相關(guān)的隱孢子蟲的研究報(bào)道有很多，但對該病的致病機(jī)制仍不明晰，亦無有效的藥物或疫苗治療這種原蟲病[1]。近年來，體外培養(yǎng)作為研究隱孢子蟲生活史、感染機(jī)制和藥物篩選的手段已取得了一定的進(jìn)展[4-10]。但是這些研究方法通常需要借助免疫熒光、激光共聚焦和電鏡等技術(shù)，這些方法試驗(yàn)周期長，時(shí)常存在假陽性等缺陷。因此，建立一種簡便快捷和易于觀察的隱孢子蟲體外培養(yǎng)方法勢在必行。

微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)作為人類隱孢子蟲病的重要病原種類，具有感染譜廣，致病性嚴(yán)重，具有重要的公共衛(wèi)生意義。HCT-8細(xì)胞可作為多種隱孢子蟲體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞，可觀察到其各個(gè)發(fā)育階段形態(tài)特征[11-13]。另外，HCT-8細(xì)胞比其他的宿主細(xì)胞更有利于C.parvum的培養(yǎng)，因?yàn)镠CT-8細(xì)胞可容許數(shù)量較多的C.parvum感染發(fā)育，增加感染細(xì)胞的數(shù)量而有利于觀察蟲體在細(xì)胞的發(fā)育過程[14]。

本研究利用HCT-8細(xì)胞體外培養(yǎng)C.parvumIId亞型，運(yùn)用Giemsar染色法觀察C.parvumIId亞型在HCT-8細(xì)胞中的不同發(fā)育階段特征，對不同感染時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品DNA進(jìn)行PCR檢測，以期為隱孢子蟲的藥物篩選和致病機(jī)制的研究打基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蟲株和細(xì)胞株 通過飽和蔗糖溶液漂浮法從鄭州某奶牛場奶牛糞便收集到C.parvumIId亞型卵囊，采用Xiao等方法[15]的方法進(jìn)行GP60基因擴(kuò)增測序鑒定為C.parvumIId亞型，用2.5%重鉻酸鉀4 ℃保存。

HCT-8細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37 ℃，5% CO2溫箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至單細(xì)胞層后以胰酶消化，計(jì)數(shù)，分裝6孔板，并觀察96 h內(nèi)HCT-8細(xì)胞的生長情況，為蟲體感染做準(zhǔn)備。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI 1640液體培養(yǎng)液購自Giboco公司(4 ℃，避光保存)，胎牛血清購自杭州四季青公司，Giemsa染料試劑盒，牛黃膽酸鹽和HEPES購自Sigma公司，基因組DNA提取試劑盒和PCR檢測試劑盒購自TOYOBO公司，CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司，低溫高速離心機(jī)Sigma公司，倒置顯微鏡購自LEICA公司。

細(xì)胞接種C.parvumIId亞型卵囊后，應(yīng)更換為維持培養(yǎng)液，其成分為每100 mL培養(yǎng)基中含0.03 g/L L-谷氨酰胺、0.3 g/L碳酸氫鈉、0.02 g/L牛黃膽酸鹽、0.1 g葡萄糖、25 μg葉酸，100 μg對氨基苯甲酸、50 μg泛酸鈣、875 μg葉酸、2%FCS、15-20 mmol/L HEPES緩沖液、100單位/mL青霉素和0.01 g/mL鏈霉素，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1C.pavumⅡd亞型卵囊大量收集與純化 從鄭州某奶牛場奶牛糞便收集到C.parvumIId亞型卵囊，通過未食初乳的4日齡犢牛進(jìn)行卵囊的傳代擴(kuò)增，收集排卵囊期間的犢牛糞便溶于蒸餾水，經(jīng)80目銅篩過濾，濾液3 500 r/min離心10 min，棄上清，加入等體積的乙醚去除糞便中的脂肪，3 500 r/min離心10 min用清水洗3遍，去上清，沉淀加入飽和蔗糖溶液，充分混勻，3 500 r/min離心10 min，用金屬吊環(huán)收取上層卵囊，加入10倍稀釋的蒸餾水混勻，3 500 r/min離心10 min，棄上清，用適量蒸餾水混勻。

卵囊純化：取50 mL離心管，加入25 mL 1∶1蔗糖溶液30 mL，在蔗糖溶液上層小心加入上述收取卵囊液5 mL，3 600 r/min離心15 min，吸取卵囊?guī)в跓?；每次吸取的卵囊?guī)в靡欢康恼麴s水稀釋并充分混勻之后，離心留沉淀，用適量蒸餾水均勻；根據(jù)Arrowood等[16]方法，配制氯化銫(CsCl)工作液，采用離心的方法收取卵囊?guī)コs質(zhì)對卵囊作進(jìn)一步的純化；然后純化的卵囊用5%次氯酸鈉4 ℃作用10 min進(jìn)行無菌化處理，蒸餾水清洗5次，去除殘留的次氯酸鈉。最后卵囊沉淀用含2% FCS的RPMI 1640維持培養(yǎng)液重懸，用于感染細(xì)胞。1.3.2C.pavumIId亞型在細(xì)胞中的發(fā)育過程觀察 將無菌化處理的20 mm蓋玻片置6孔板中，在每個(gè)蓋玻片上中加入10%FCS的RP MI1640培養(yǎng)液，內(nèi)含有1×105個(gè)HCT-8細(xì)胞，置37 ℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長融合至85%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液, 以無菌PBS洗滌2次，每個(gè)玻片上接種2×105個(gè)處理后的卵囊培養(yǎng)液。2.5 h后棄去未結(jié)合細(xì)胞的卵囊，換上維持培養(yǎng)液(2% FCS)。分別取感染后2 h、5 h、12 h、18 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、108 h玻片樣品，以無菌PBS緩沖液洗滌2次，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)共6份玻片樣品，取其中3份樣品用微分干涉顯微鏡觀察蟲體形態(tài)，另外3份樣品用甲醇固定后，用Giemsa染色試劑盒進(jìn)行染色，觀察蟲體發(fā)育情況并照相。同時(shí)設(shè)空白對照。

1.3.3 用PCR法檢測不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞樣品DNA的GP60基因

1.3.3.1C.pavumIId亞型的細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)及卵囊感染同1.3.2，孔板中不加蓋玻片。待培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h后收集上清與細(xì)胞后，上清沉淀物保存于-20 ℃用于制備模板DNA，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3次重復(fù)，同時(shí)加空白對照。

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)3次重復(fù)，同時(shí)加空白對照。

1.3.3.2 基于GP60基因的PCR檢測GP60基因是隱孢子蟲基因組中最具多態(tài)性的標(biāo)記基因，是應(yīng)用最廣泛的隱孢子蟲亞型靶基因。根據(jù)GenBank發(fā)表的C.pavumGP60基因序列，應(yīng)用Primer 5.0生物信息軟件設(shè)計(jì)一對巢式PCR引物，擴(kuò)增片段為832 bp。引物序列：gp60-F1，5′-ATA GTC TCC GCT GTA TTC-3′，gp60-R1，5′-GGA AGG AAC GAT GTA TCT-3′，gp60-F2，5′-TCC GCT GTA TTC TCA GCC-3′，gp60-R2，5′-GCA GAG GAA CCA GCA TC-3′，由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

樣品DNA提取方法參照Mag Extractor基因組提取試劑盒說明書進(jìn)行，提取DNA后，-20 ℃保存?zhèn)溆?。以上述制備的DNA為模板，用kold plus酶擴(kuò)增GP60基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，拍攝照片保存。

3 結(jié) 果

3.1 Giemsa染色法觀察細(xì)胞 隱孢子蟲感染HCT-8細(xì)胞，經(jīng)Giemsa染色，見HCT-8細(xì)胞呈紅色或紫紅色，各發(fā)育階段隱孢子蟲呈藍(lán)色或藍(lán)紫色。隱孢子蟲感染細(xì)胞2 h～12 h，大部分的隱孢子蟲脫囊，釋放出子孢子(圖1B，1b)；感染12 h～24 h，子孢子侵入HCT-8細(xì)胞，發(fā)育為滋養(yǎng)體(圖1C，1c)；感染36 h，可見HCT-8細(xì)胞內(nèi)含有6個(gè)裂殖子的裂殖體(圖1D，1d)；感染48 h，HCT-8細(xì)胞內(nèi)見小配子及其殘?jiān)?圖1E，1e)、配子體(圖1F，1f)和合子(圖1G，1g)；感染60 h，HCT-8細(xì)胞內(nèi)見卵囊(圖1H，1h),收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中，除見到大量的游離卵囊，還有大量細(xì)胞碎片。

A-H：微分干涉顯微鏡；a-h：吉姆薩染色；A、a：未感染蟲體的細(xì)胞對照；B、b：隱孢子蟲脫囊階段；C、c：滋養(yǎng)體階段；D、d：裂殖體階段；E、e：大配子階段；F、f：小配子階段；G、g：合子階段；H、h：卵囊階段

A-H: differential interference microscope, a-h: Giemsa staining. A,a: uninfected cell control; B,b: Cryptosporidium excystation; C,c: trophozoites; D,d: schizont; E,e: megagametophyte; F,f: microgametocyte; G,g: zygote; H,h: oocyst

圖1 微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞中各發(fā)育階段蟲體的形態(tài)觀察(×1000)

Fig.1 Observation of various development stage ofCryptosporidiumparvumIId in HCT-8 cells (×1000)

3.2 不同時(shí)間點(diǎn)HCT-8細(xì)胞DNA的PCR檢測

將提取的不同時(shí)間點(diǎn)的上清與細(xì)胞樣品DNA，分別進(jìn)行GP60基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。電泳結(jié)果顯示：細(xì)胞上清DNA樣品在6 h、12 h、24 h、48 h未能擴(kuò)增出832 bp特異型性片段，而在72 h和96 h擴(kuò)增出832 bp的特異性片段，細(xì)胞樣品在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品中均能擴(kuò)增出832 bp的特異性片段。詳見圖2，圖3。

M：DL2000 分子marker；1：空白細(xì)胞對照，2-7：卵囊接種6 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h的細(xì)胞樣品，8：陰性對照(無菌蒸餾水)M: DL 2000 molecular marker; 1: blank cell control, 2-7: cell samples post inoculated hours 6, 12, 24, 48, 72, and 96, 8: negtive control(distilled water)圖2 微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中卵囊DNA檢測Fig.2 Detection of C. parvum IId DNA at different times in HCT-8 cell

M：DL2000 分子marker；1：空白細(xì)胞對照，2-7：卵囊接種6 h，12 h，24 h，48 h，72 h，96 h的細(xì)胞上清樣品，8：陰性對照(無菌蒸餾水)M: DL 2000 molecular marker; 1: blank cell control, 2-7: cell supernatant post inoculated hours 6, 12, 24, 48, 72, and 96, 8: negtive control(distilled water)圖3 微小隱孢子蟲IId亞型在HCT-8細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞上清中卵囊DNA檢測Fig.3 Detection of C. parvum IId DNA at different times in HCT-8 cell supernatant

4 討 論

純化隱孢子蟲卵囊主要用于體外培養(yǎng)、抗原制備和隱孢子蟲DNA提取研究。本實(shí)驗(yàn)采用1∶1的蔗糖溶液純化隱孢子蟲卵囊，收到的卵囊量大而且較為純凈，此時(shí)的卵囊可用于提取隱孢子蟲DNA。由于本文的卵囊的用途是感染細(xì)胞，要求細(xì)胞純凈，無雜質(zhì)，所以要對卵囊作進(jìn)一步的純化。文獻(xiàn)報(bào)道，對于卵囊的純化，一般采用Percoll密度梯度離心和CsCl密度梯度離心和免疫磁性分離法(IMS)等。Hadfield等[17]用IMS和CsCl的密度梯度離心對比試驗(yàn)顯示IMS法適用于小量的卵囊純化，而CsCl密度梯度離心法適用于量大樣品的純化。陳甫等[18]用Percoll密度梯度離心和CsCl密度梯度離心法處理卵囊的對比實(shí)驗(yàn)表明，兩者雖都存在卵囊丟失，但是CsCl密度梯度離心卵囊丟失率低，且純化的卵囊純度明顯高于Percoll密度梯度離心，而且不用做任何滅菌處理，直接可以感染細(xì)胞。由于本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞感染需要大量的卵囊，因此使用CsCl密度梯度離心的方法純化卵囊，而Arrowood[16]的方法簡便，可操作性強(qiáng)，回收率高。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Arrowood等[16]的試驗(yàn)方法進(jìn)行純化卵囊，做了些改動(dòng)，即離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和時(shí)間與文獻(xiàn)報(bào)道不太一致，我們采取的離心機(jī)轉(zhuǎn)速與時(shí)間比文獻(xiàn)報(bào)道要高，否則的話，形成的卵囊?guī)?，容易造成卵囊的大量丟失。

研究表明，用于感染細(xì)胞的卵囊必須是新鮮的，一般是3個(gè)月以內(nèi)的卵囊，越早越好。在感染之前要用次氯酸鈉處理以除去卵囊液中的病原微生物，而且采用次氯酸鈉處理可使卵囊壁變薄(特別是新鮮卵囊壁更容易變薄)，有助于子孢子的溢出又可以防止微生物污染[7]。加之細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)含有定量的牛黃膽酸鹽的刺激，更有利于子孢子的溢出。因此本研究中的卵囊在感染前并未進(jìn)行脫囊而直接感染細(xì)胞。

采用PCR方法從分子方面確認(rèn)了C.parvumⅡd亞型在HCT-8細(xì)胞中生長發(fā)育過程以及遺傳穩(wěn)定性。細(xì)胞樣品在不同的感染時(shí)間點(diǎn)均能擴(kuò)增出832 bp的GP60基因片段，測序結(jié)果分析顯示均為C.parvumIId亞型。而細(xì)胞上清樣品在6 h、12 h、24 h、48 h未能檢測出C.parvumIId亞型蟲體DNA，卻在72 h和96 h檢測出C.parvumIId亞型蟲體DNA。說明感染早期，卵囊在細(xì)胞中進(jìn)行生長發(fā)育，在上清中檢測不到蟲體DNA，但在感染后期(72 h后)，隨著細(xì)胞的不斷崩解，導(dǎo)致C.parvumIId亞型卵囊脫離細(xì)胞，游離于上清中，因而細(xì)胞上清中能夠檢測到蟲體DNA。因此，通過HCT-8細(xì)胞體外培養(yǎng)C.parvumIId亞型卵囊時(shí)，我們還需對細(xì)胞的培養(yǎng)條件、特別是細(xì)胞感染后血清濃度、感染蟲體數(shù)量和細(xì)胞數(shù)量的比例以及培養(yǎng)環(huán)境等方面的問題需要進(jìn)一步的摸索，為建立微小隱孢子的體外培養(yǎng)模型奠定基礎(chǔ)。

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ZHU Hui-li1,2, LIU Li-min1, WANG Cheng-rong1, ZHANG Su-mei1,ZHANG Long-xian1,WANG Rong-jun1

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryScience，HenanAgriculturalUniversity，Zhengzhou450002，China;2.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryScience,HenanInstituteofScience

andTechnology,Xinxiang453003,China)

In order to developinvitroinfected model forCryptosporidiumparvumand to observe its developmental stages in the cells, the human ileocecal cancer (HCT-8) cells were selected to culture the parasite. The purified oocysts ofC.parvumIId subtype infected HCT-8 cellsinvitro, the developmental processes ofC.parvumIId subtype in HCT-8 cells were observed using Giemsa staining, and the DNA ofC.parvumIId subtype from different time points of infection were detected by Polymerase Chain Reaction (PCR). Following 72 h co-culture, excystation, sporozoites, trophozoites, meronts, microgametocytes, macrogametocytes, zygote and oocyst appeared orderly. Furthermore, the DNA ofC.parvumIId subtype in cells were still detected at 96 h post-infection. The complete developmental processes ofC.parvumIId subtype can be observed in HCT-8 cells, which provides a theoretical basis for the screening of anti-Cryptosporidiumdrugs and becomes a method forC.parvumIId oocyst amplification byinvitroculture.

Cryptosporidiumparvum; infection model; HCT-8 cell; culture

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(No.31330079)、國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(No.31302079)和河南省高校科技創(chuàng)新人聯(lián)合資助

王榮軍，email：wrj-1978@163.com

1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002；

2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003

10.3969/j.issn.1002-2694.2016.08.005

R382

A

1002-2694(2016)08-0706-05

2016-01-20；

2016-01-20

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31330079) and (Grant No.31302079) and Science and technology innovation talents in Colleges and Universities in Henan Province(No.16HASTIT018)