劉奇燕 丁顯萍 張萍

摘 要：該研究優(yōu)化了SDS的DNA提取方法，采用SSR分子標記技術建立了一種準確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)?；碾s交水稻種子純度檢測流程，為大規(guī)模雜交水稻種子純度檢測提供了高效簡便的方法。

關鍵詞：純度鑒定;水稻品種;SSR分子標記

中圖分類號 S511? ? 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2021）05-0009-02

種子質(zhì)量不僅是決定農(nóng)作物收成的關鍵，也是種業(yè)企業(yè)在競爭中處于不敗之地的重要因素，是種業(yè)企業(yè)生存的根本。雜交種子純度是種子質(zhì)量檢測的重要指標之一，加強種子純度檢測對于水稻生產(chǎn)銷售至關重要。種子純度檢測主要有海南鑒定、正季種植鑒定以及SSR分子標記鑒定方法。海南鑒定具有相對準確、時間相對提前的優(yōu)點，但海南冬季屬短日照低溫條件，感光類型及兩系不育系均表現(xiàn)為正常結(jié)實，對雜交水稻尤其是兩系雜交水稻種子純度的鑒定結(jié)果往往失真。正季鑒定結(jié)果與大田生產(chǎn)實際吻合度高的優(yōu)點，但時間明顯滯后。從歷年發(fā)生的重大種子純度事故來看，絕大多數(shù)是在得知種子純度不合格之前，種子已經(jīng)銷售到千家萬戶無法召回，從而釀成了無法挽回的損失。SSR分子標記是從DNA水平上檢測生物個體差異，具有多態(tài)性高、譜帶擴增穩(wěn)定、技術成熟、檢測時間短、不受環(huán)境影響等特點，在雜交水稻種子純度鑒定中得到了越來越廣泛的應用。為此，本研究建立了一種準確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)模化檢測的流程，為大量檢測雜交水稻種子純度提供高效簡便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 48對引物，Taq DNA聚合酶，DNTP，十二烷基磺酸鈉，10%SDS，2MTris-HCI，250mMEDTA，乙酸銨，40%聚丙烯酰胺凝膠，5*TBE，過硫酸銨，四甲基乙二胺，甲醛，冰醋酸，無水乙醇，氫氧化鈉，硝酸銀，瓊脂糖，溴酚藍等化學試劑。

1.1.2 主要儀器 研磨儀，高速冷凍離心機，水浴鍋，PCR擴增儀，電泳儀，電泳槽，搖床，膠片觀察燈，通風櫥，超低溫冰箱，微波爐，電子天平等儀器。

1.2 方法

1.2.1 種子發(fā)芽 每個樣品隨機取300粒種子，均勻置于發(fā)芽床上，放在30℃的發(fā)芽箱6d左右。

1.2.2 DNA提?。ㄒ环N優(yōu)化的SDS提取法） 隨機選取水稻幼苗用鑷子放入96孔深孔板中，每個單株在1～5cm，將磁珠放入每個孔中，蓋上軟蓋，做好標記，放入超低溫冰箱冷凍1h左右。冷凍結(jié)束放在研磨儀研磨1min30s，用高速冷凍離心機離心2min。每個孔中加入280μL的65℃提取液，再用研磨儀研磨30s，離心機離心2min。加入150μL的乙酸銨溶液，充分搖勻，4000r、4℃冷凍離心機離心15min。將上清液200μL轉(zhuǎn)入另一深孔板中，加入400μL的無水乙醇。4000r、4℃冷凍離心機離心15min，棄上清，自然條件下干燥或用吹風機吹干，加入100μL的雙蒸水，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物篩選 采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T1433—2014《水稻品種鑒定技術規(guī)程SSR標記法》附錄C中推薦的48對SSR引物，對雜交種進行多態(tài)性篩選。選用在雜交種中具有較好多態(tài)性的SSR引物。

1.2.4 PCR擴增檢測 從篩選得到的引物中隨機挑選2對引物進行PCR擴增，采用11μL的PCR反應體系，即在PCR反應管中分別加入樣品DNA提取液（2.0μL）、10×Buffer（1.0μL）、2.5mMNTP（0.8μL）、25mMMgcl2（0.6μL）正向引物（1μL），反向引物（1μL）、ddH2O（4.35μL）和TaqDNA聚合酶（0.25μL）。PCR反應程序為：先94℃預變性2min;再94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán);72℃延伸8min。反應完成后，加入溴酚藍，置4°C環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測 擴增產(chǎn)物采用3%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，使用104孔密型點樣梳一次性點樣96孔PCR板上的96個樣品;在350V、400mA條件下，電泳40min，染色、顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 判別方法 每個品種用2對引物擴增，分別做96粒，點樣時一一對應。如果2對引物都在同一個位置上檢測到雜株，則判斷為1個雜株;如果2對引物分別在不同位置檢測到雜株，檢測到幾個雜株則判斷為幾個個雜株。如果其中1對引物在某個位置上檢測到親本帶，而另一對引物在這個位置上沒有檢測到親本帶，則判斷為雜株;如果2對引物都在這個位置上檢測到親本帶且都是母本帶或者都是父本帶，則判斷為雜母本或者父本。

2.2 純度判定 圖1為品種A在標記RM336和標記RM208第6位置上是都是母本帶，則判斷品種A雜1粒母本帶，純度為99.0%。2為品種B在標記RM71上第21位置上是母本帶;在標記RM339上12位置上是母本帶，27位置上是母本帶，43位置上是雜株，則判斷品種B有4個雜株，純度為95.8%。

3 討論

在常規(guī)的SSR分子標記檢測程序中，DNA提取通常采用的是CTAB法、沒有優(yōu)化的SDS法、快提法和磁珠法。CTAB法和普通的SDS法需要加氯仿和異戊醇，氣味很難聞，對人體有害、不安全，快提法DNA的質(zhì)量不高，且保存時間很短，對PCR擴增產(chǎn)物檢測電泳有限制，如毛細管電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測效果不好。磁珠法提取成本高，試劑盒比較貴。本研究優(yōu)化的SDS法，無需加氯仿和異戊醇，比較安全，提取的DNA質(zhì)量高，保存時間很長，適合任何電泳，成本低，經(jīng)濟適用。并且用深孔板提取，能夠高通量提取，特別是需要大量提取水稻DNA時，優(yōu)勢明顯。

引物選擇上原則是選擇雜合率高，在其雙親中具有共顯性的多態(tài)性，區(qū)分異品種能力強，多態(tài)性好，擴增效果好，即可用于雜交種子的純度檢測。但不同SSR引物的雜株辨別率的差距較大，單對SSR引物檢測雜株類型構(gòu)成復雜的樣品時可靠性較低。所以應盡可能了解受檢樣品的生產(chǎn)背景和雜株類型，最好與田間鑒定相結(jié)合，選出具有針對性的2對或多對引物供檢測。

參考文獻

[1]周桂林，劉奇燕，范家萌，等.SSR分子標記高效選擇抗稻瘟病雙基因Pi-1、Pi-2的技術體系[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2017（7）：123-125.

[2]李婧婧，付求來，戴繼俠，等.一種快速鑒定雜交水稻種子純度的方法[J].種子，2018（4）：125-126，131.

（責編：張宏民）