王伊寧，徐曉暉,2，金園庭，翟韻萍，邵 罡

(1.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018;2.中國計(jì)量大學(xué)現(xiàn)代科技學(xué)院，浙江杭州 310018)

澤陸蛙Fejervarya limnocharis，屬無尾目Anura，叉舌蛙科Dicroglossidae，陸蛙屬Fejervarya，它是我國南方蛙類優(yōu)勢種之一，廣泛分布于稻田、沼澤、森林等環(huán)境[1]。它又稱稻米蛙，在稻田生態(tài)系統(tǒng)中是優(yōu)勢甚至唯一的蛙類，維持澤陸蛙種群數(shù)量對維護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的健康，以及病蟲害的生物防治有重要意義。然而，由于人類干擾，以及農(nóng)藥的過度使用，澤陸蛙數(shù)量急劇減少，開展?jié)申懲艿倪z傳保護(hù)研究對日后開展其科學(xué)的種群保護(hù)意義重大。舟山澤陸蛙與大陸地區(qū)的澤陸蛙種群形成了線粒體進(jìn)化的兩大分支，且與日本分布的澤陸蛙種群親緣關(guān)系更近，具有遺傳分化研究的重要意義[2]，目前我國對澤陸蛙的研究報(bào)道還很少。

基因組大小(C-值)是指一個(gè)生物的單倍體DNA 含量，它是開展基因組高通量測序研究必須首先要考慮的一個(gè)重要指標(biāo)。在真核生物中，每個(gè)物種的單倍體基因組DNA 總量是高度恒定的，每個(gè)物種各有其特定的基因組大小，C-值可作為每個(gè)物種的一個(gè)特異性參數(shù)[3]。

目前，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)了多種測定基因組大小的方法，如流式細(xì)胞術(shù)、熒光定量分析法、孚爾根染色-顯像密度計(jì)法、孚爾根染色-圖像分析法等，其中流式細(xì)胞術(shù)是一種利用激光束散射與折射原理來對液體中的細(xì)胞或其他微小顆粒狀物體進(jìn)行快速分析與分選的技術(shù)，可以高通量分析上萬個(gè)細(xì)胞，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)[4]，它近年來常被用來測定DNA 的含量[5-8]。而碘化丙啶(propidium iodide,PI)是一種常用的插入性核酸染料，可均勻地嵌入單鏈或雙鏈核酸分子，且沒有明顯的堿基選擇性，常用于核酸定量分析[9]。在激發(fā)光的激發(fā)下，流式細(xì)胞儀可檢測到PI 發(fā)出的熒光，由于PI 在著色過程中的嵌入量與DNA 的量成正比，因而用熒光強(qiáng)度可以表示DNA 的相對含量。通過測定待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的PI 發(fā)射熒光強(qiáng)度，便可得知待測樣品細(xì)胞的DNA 含量和標(biāo)準(zhǔn)樣品細(xì)胞的DNA 含量之間的比例關(guān)系[7]，從而計(jì)算出待測樣品的DNA 含量。

流式細(xì)胞術(shù)測定動物基因組常采用雞Gallus domesticus 紅細(xì)胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)樣品，但流式細(xì)胞儀所用雞紅細(xì)胞通常需采集活雞血液制備獲得，制備步驟繁瑣，儲存時(shí)間短，使用成本高。人Homo sapiens 白血病HL60 細(xì)胞易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，能持續(xù)增殖，很多生物實(shí)驗(yàn)室均有保存，使用成本低，而流式細(xì)胞術(shù)以人的白血病HL60 細(xì)胞為對照標(biāo)準(zhǔn)尚未見報(bào)道，另外澤陸蛙基因組大小也未見報(bào)道。本文采用流式細(xì)胞術(shù)，首次以人白血病HL60 細(xì)胞為對照，測定和分析了澤陸蛙的基因組大小，為該物種基因組學(xué)后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用澤陸蛙樣本于2019 年8 月，采自浙江舟山群島，使用GPS 儀記錄每個(gè)采樣點(diǎn)的經(jīng)緯度信息(表1)。澤陸蛙樣品采集后記錄有明確表型特征的信息，并對采集到的樣品進(jìn)行物種鑒定[10]。澤陸蛙的性別根據(jù)雄性個(gè)體較雌性個(gè)體的第一指婚墊發(fā)達(dá)，雄性個(gè)體具單咽外聲囊，咽喉部為黑色，具有雄性線，而進(jìn)行鑒別。

表1 澤陸蛙樣本采集信息Tab.1 Samples collection information of F.limnocharis

標(biāo)準(zhǔn)樣品人白血病HL60 細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存；EDTA 抗凝管(美國BD 公司)；碘化丙錠(美國Sigma 公司)；RNase(大連TAKARA 公司)；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)(上海生工公司)；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。PBS 緩沖液(137 mmol·L-1NaCl，2.7 mmol·L-1KCl，10 mmol·L-1Na2HPO4，2 mmol·L-1KH2PO4，pH 7.4)，碘化丙錠PI 染液(100 mL 染液含PI 5 mg，RNase 2 mg，Triton-X-100 1 mL，檸檬酸鈉100 mg，PBS緩沖液定容，pH 7.2～7.4)。

1.2 主要儀器

ACEA NovoCyte 流式細(xì)胞儀(美國安捷倫公司)；5804R 臺式離心機(jī)(德國Eppendorf 公司)。

1.3 分析軟件

NovoExpress v1.3.3 軟件(美國安捷倫公司)；Excel 2010(美國微軟公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 蛙紅細(xì)胞懸液的制備

選取健康雌性澤陸蛙個(gè)體，用注射器取新鮮蛙血0.2～0.5 mL 注入含乙二酸四乙酸二鈉(EDTA-Na2)的抗凝管中，加入1 mL PBS 緩沖液沖打數(shù)次，用400 目篩網(wǎng)過濾后以500 r·min-1離心5 min，分離出紅細(xì)胞，棄上層液體，加PBS 緩沖液懸浮后以相同速度離心5 min，棄上清，加入0.3 mL PBS 緩沖液重懸浮細(xì)胞。

1.4.2 細(xì)胞固定和染色

取蛙紅細(xì)胞懸液和HL60 細(xì)胞樣品，與冰乙醇以1:3 的比例混合，使乙醇終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75%，在4 ℃冰箱固定保存1 h。染色前，將固定好的細(xì)胞以1 000 r·min-1離心15 min，沉淀用PBS 緩沖液洗滌后以1 000 r·min-1離心，重復(fù)3 次。蛙紅細(xì)胞樣品和HL60 細(xì)胞樣品分別加入0.6 mL 和0.8 mL 碘化丙錠PI 染液，在37 ℃下避光染色20 min。

1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測

將染色后的蛙紅細(xì)胞懸液和HL60 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)品以1:1 的比例混合(紅細(xì)胞和HL60 細(xì)胞各取0.2 mL 混合)，并保留單獨(dú)的HL60 細(xì)胞和蛙紅細(xì)胞樣品各一份作為對照(對照組均為0.4 mL)，用400 目篩網(wǎng)過濾除去懸浮物。用流式細(xì)胞儀檢測DNA 含量，先用488 nm 的藍(lán)光激發(fā)，然后以625±10 nm 的發(fā)射波長檢測PI的發(fā)射熒光。實(shí)驗(yàn)采用同批的白血病細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品和相同的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，每組樣品至少收集10 000 個(gè)細(xì)胞，最大限度保證實(shí)驗(yàn)中各個(gè)樣品的均衡性。

1.4.4 圖像制作與數(shù)據(jù)分析

測量所得的圖像和數(shù)據(jù)用儀器自帶軟件NovoExpress v1.3.3 進(jìn)行顯示和分析。在儀器采集和測定樣品后，在軟件內(nèi)創(chuàng)建散點(diǎn)圖，在得到的散點(diǎn)圖上設(shè)置門限(setgate)E1 使其只顯示該門內(nèi)的事件，排除破碎的細(xì)胞對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾；再在門內(nèi)事件的基礎(chǔ)上創(chuàng)建對應(yīng)的密度圖和散點(diǎn)圖以反映所選取細(xì)胞的熒光情況，對密度圖中設(shè)置門限P3，以排除粘連的細(xì)胞；最后在門限P3 范圍內(nèi)做出反映澤陸蛙紅細(xì)胞樣品與人白血病細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品熒光強(qiáng)度對比的柱狀圖，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4.5 基因組大小計(jì)算

本研究通過比較白血病細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣與澤陸蛙紅細(xì)胞樣品熒光強(qiáng)度的倍數(shù)關(guān)系,計(jì)算澤陸蛙的基因組大小。依據(jù)如下公式計(jì)算：

澤陸蛙的基因組大小=HL60 細(xì)胞基因組大小×蛙紅細(xì)胞PI 熒光強(qiáng)度/HL60 細(xì)胞熒光PI 強(qiáng)度(HL60 細(xì)胞基因組大小為2.92 Gb)。

澤陸蛙的基因組重量(2C)=澤陸蛙基因組大小/0.978(1 pg 基因組相當(dāng)于0.978 Gb)

本研究共測定5 組樣品，并用Excel 2010 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品測定

通過測定得到了圖像和數(shù)據(jù)(圖1)，以第一組樣品為例。圖1A 顯示澤陸蛙的紅細(xì)胞樣品與人白血病HL60 細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品各自對應(yīng)的粒子團(tuán)有少部分重疊，但仍可有效分開，說明用HL60 細(xì)胞作內(nèi)標(biāo)計(jì)算蛙紅細(xì)胞基因組大小是可行的；圖1B 是在A 圖E1 門限范圍內(nèi)(占A 圖中所有粒子總數(shù)的69.40%)所測出的蛙紅細(xì)胞與HL60 細(xì)胞樣品熒光情況，其中P3 門限范圍內(nèi)(占B 圖中所有粒子總數(shù)的68.36%)的為分散細(xì)胞發(fā)出的熒光，熒光集中且強(qiáng)度高，可用于下一步測定計(jì)算，P3 正上方的是因細(xì)胞粘連而呈現(xiàn)的多個(gè)熒光團(tuán)，不可用于測定計(jì)算；C 圖也是在E1 范圍內(nèi)選出的澤陸蛙紅細(xì)胞樣品與人白血病細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光散點(diǎn)圖，結(jié)果顯示已排除破碎的細(xì)胞對之后熒光強(qiáng)度測定的干擾；D 圖是P3 范圍內(nèi)的樣品熒光信號強(qiáng)度柱狀圖，結(jié)果顯示蛙紅細(xì)胞峰狀圖與HL60 雖相距較近但也能有效分開，靠右的HL60 細(xì)胞因有部分正在進(jìn)行分裂而呈現(xiàn)2 個(gè)峰，但只取第一個(gè)峰的數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，所以并不會影響測定效果。

圖1 蛙紅細(xì)胞樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品HL60 混合后的流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果Fig.1 Flow cytometry measurement result of red blood cell and standard sample HL60 mixed

2.2 澤陸蛙基因組大小分析

以人白血病細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)參照，用流式細(xì)胞儀測定澤陸蛙的基因組大小，所得的檢測結(jié)果如圖2 所示。AB 圖分別為2 次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，橫坐標(biāo)表示熒光信號，縱坐標(biāo)表示檢測的細(xì)胞數(shù)目，以標(biāo)定相同的細(xì)胞數(shù)來比較2 組的熒光強(qiáng)度。根據(jù)測定的結(jié)果計(jì)算出基因組大小(表2)，澤陸蛙基因組DNA 質(zhì)量為2.21±0.17 pg，基因組大小為2.16±0.16 Gb。

表2 流式細(xì)胞術(shù)測定的澤陸蛙C-值、基因組重量與基因組大小Tab.2 Determination on C-value,genomic DNA quality and genome size of F.limnocharis

圖2 澤陸蛙5 個(gè)雌性樣本紅細(xì)胞基因組大小的流式細(xì)胞術(shù)測定Fig.2 Genome size determination on five female individuals of F.limnocharis using flow cytometry

3 討論

在已有的動物基因組數(shù)據(jù)庫中，測定C-值使用最多的方法是孚爾根染色-顯像密度計(jì)法，其次是流式細(xì)胞儀術(shù)，由于流式細(xì)胞術(shù)不需要制備細(xì)胞核懸液，樣品制備簡單，檢測快速，結(jié)果準(zhǔn)確，使得流式細(xì)胞術(shù)已逐漸成為替代孚爾根染色-顯像密度計(jì)法的測定方法。不同的流式細(xì)胞術(shù)研究使用的對照標(biāo)準(zhǔn)并一致，也沒有規(guī)定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，通常理想的DNA 對照標(biāo)準(zhǔn)品要求是分散系細(xì)胞的均一細(xì)胞群，測定時(shí)具有完美峰型，與待測物種基因組大小相近又能夠相互區(qū)分、遺傳穩(wěn)定、基因組大小數(shù)據(jù)可靠且容易獲得。動物基因組測定經(jīng)常采用雞紅細(xì)胞作為對照標(biāo)準(zhǔn)樣品，也有人采用人淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)樣品[3]，但上述標(biāo)準(zhǔn)品制備難度較大，多依賴購買進(jìn)口成品，使用成本高，而本研究首次采用了人的白血病HL60 細(xì)胞作為對照標(biāo)樣。HL60 細(xì)胞為早幼粒細(xì)胞，是適用于DNA 含量測定的對照標(biāo)準(zhǔn)[11]，也便于使用熒光光譜等技術(shù)，而且取材方便，已有的基因組學(xué)數(shù)據(jù)可靠，易于實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)的流式細(xì)胞術(shù)測定結(jié)果，HL60 細(xì)胞與澤陸蛙紅細(xì)胞基因組大小相近，而DNA 差異較大，粒子團(tuán)重疊較少(圖1A)，證明科研上廣泛使用的白血病腫瘤細(xì)胞HL60 可以作為對照標(biāo)準(zhǔn)樣估算兩棲動物基因組大小。

兩棲類動物的體細(xì)胞染色體數(shù)和DNA 含量基本是恒定不變的，因此C-值可作為兩棲類動物的一個(gè)特性參數(shù)。已有的研究表明，基因組的大小與生物體的許多生理特征有一定的相關(guān)性，如細(xì)胞大小[12]、代謝率和發(fā)育速度[13-14]等，近來有研究者發(fā)現(xiàn)在兩棲動物神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育與基因組大小高度相關(guān)，基因組和細(xì)胞大小的增加會導(dǎo)致神經(jīng)(以及非神經(jīng))組織的發(fā)育速度減慢，從而導(dǎo)致在“幼體發(fā)育”的背景下形態(tài)的二次簡化，并認(rèn)為兩棲動物和肺魚大腦的形態(tài)復(fù)雜性在很大程度上受基因組大小和細(xì)胞大小的影響[15]。同時(shí)基因組大小也可作為種質(zhì)鑒定、系統(tǒng)分類和物種進(jìn)化等研究的參考數(shù)據(jù)。

兩棲動物是一個(gè)古老的動物類群，是脊椎動物從水生到陸生進(jìn)化的過濾類群和重要分支，已經(jīng)演化出復(fù)雜的進(jìn)化支系，展現(xiàn)出形態(tài)的千姿百態(tài)，不同種類個(gè)體大小差異巨大的特征。目前僅完成極少數(shù)兩棲類物種的基因組測序，多數(shù)物種的基因組大小仍是未知，這在一定程度上限制了人們對兩棲動物基因組特性與演化的認(rèn)識。然而個(gè)體大小與基因組大小并沒有直接相關(guān)的關(guān)系，基因組大小不但是重要的基因組特征，也是基因組組裝測序前必須要了解的參數(shù)。在已知的基因組數(shù)據(jù)庫中，不同種類的蛙基因組大小相差較大，如草莓箭毒蛙Oophaga pumilio 個(gè)體很小，但基因組大小為6.76～9.0 Gb[16]，高山倭蛙Nanorana parkeri基因組大小為2.01 Gb，非洲爪蟾Xenopus laevis 的基因組大小為1.50 Gb[17]，非洲牛蛙Pyxicephalus adspersus的基因組大小為1.53 Gb[18]，美國牛蛙Rana (Lithobates) catesbeiana 的基因組大小為6.10 Gb[19]，巨型海蟾蜍Rhinella marina 的基因組大小為2.49 Gb[20]，熱帶非洲爪蟾Xenopus tropicalis 的基因組大小為1.41 Gb[21]，本文測定計(jì)算得出的澤陸蛙基因組略小于高山倭蛙基因組大小。這些蛙近親種之間的基因組大小差異較大，這種差異可能與其所處環(huán)境因子穩(wěn)定性和對環(huán)境的適應(yīng)性有關(guān)。兩棲類的基因組大小可以高出鳥類幾倍甚至是十幾倍，與鳥類和哺乳類相比高度可變，這可能與兩棲動物復(fù)雜的支系與漫長的演化歷史有關(guān)。兩棲動物的基因組大小的演化過程是一個(gè)需深入探究的重要科學(xué)問題。

4 結(jié)論

我們研究表明可以選擇白血病細(xì)胞為對照，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)估算兩棲動物的基因組大小。澤陸蛙的基因組大小約為2.16±0.16 Gb，跟多數(shù)蛙類基因組大小相似，研究結(jié)果豐富了澤陸蛙的細(xì)胞遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為研究其代謝發(fā)育、物種進(jìn)化、物種分類以及養(yǎng)殖育種提供了科學(xué)基礎(chǔ)，也為澤陸蛙的全基因組測定提供重要的技術(shù)參考，為澤陸蛙基因組學(xué)后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。