榆干離褶傘溶栓酶對脂多糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護作用

耿 超，衛(wèi) 瑩，沈明花

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院，吉林 延吉 133002）

榆干離褶傘屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，又名大榆蘑。研究報道，榆干離褶傘發(fā)酵液具有抗氧化[1]、溶栓、降血脂[2]、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞[3]等作用。本實驗室前期研究表明，榆干離褶傘菌絲體中分離純化的溶栓酶[4]（Lyophyllum ulmariumfibrinolytic enzyme，LUFE）具有抑制血小板的活化[5]、保護氧化應(yīng)激損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞[6-7]等生物活性。但到目前為止，LUFE對炎癥的影響及作用機制的研究報道甚少。

血管內(nèi)皮細(xì)胞作為血管內(nèi)膜的結(jié)構(gòu)成分，直接與循環(huán)血液接觸，是血管壁與血液之間的天然屏障。血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種功能，能夠保持機體局部內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，具有抗炎、抗血小板聚集、抗栓、抗凝促纖溶等多種功能[8-9]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一類分泌細(xì)胞，通過釋放多種血管生物活性物質(zhì)，影響血管結(jié)構(gòu)和功能，調(diào)節(jié)血管的張力[10]。在物理、化學(xué)、生物因素等誘因的作用下，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的完整性遭到破壞時繼發(fā)諸多疾病，如血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷是血栓栓塞性疾病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的病理基礎(chǔ)[11-12]。因此，保護血管內(nèi)皮細(xì)胞免受炎性損傷在預(yù)防或治療心血管疾病過程中具有重要的意義。本實驗以脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作為誘導(dǎo)劑，建立血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷模型，旨在探討LUFE對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性損傷的保護作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LUFE由延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室純化獲得[4]；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系（human acute monocytic leukemia cell line-1，THP-1）購自上海佛雷堡生物科技發(fā)展有限公司。

LPS、噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）、β-actin抗體、羊抗鼠免疫球蛋白（immunoglobulin G，IgG）-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、羊抗兔IgG-HRP美國Sigma公司；髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）抗體、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65抗體、phospho-NF-κB抗體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/κ2絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抗體、phospho-ERK1/2 MAPK抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體、p38 MAPK抗體、p-p38 MAPK抗體美國Cell Signaling公司；JNK抗體美國Abcam公司；核纖層蛋白B抗體 博士德生物生物工程有限公司；Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）多克隆抗體美國Thermo Fisher公司；別藻藍(lán)蛋白（allophycocyanin，APC）標(biāo)記的鼠抗人CD54（細(xì)胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1）抗體、APC標(biāo)記的同型對照IgG美國BD公司；Hoechst 33342染料北京索萊寶生物科技有限公司；白介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、E-選擇素、單核細(xì)胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）試劑盒上海研謹(jǐn)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀、細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)美國Bio-Tek公司；凝膠成像分析儀美國UVP公司；流式細(xì)胞分析儀美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC和THP-1分別培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM和含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測LPS對HUVEC存活率的影響

將HUVEC接種到96 孔板，分為空白對照組和LPS組?？瞻讓φ战M加無血清DMEM培養(yǎng)液，LPS組分為7 個組，向DMEM培養(yǎng)液中加入LPS，使其終質(zhì)量濃度分別為0.01、0.1、1、10、100、200、400 μg/mL，每組設(shè)8 個復(fù)孔，作用24 h。每孔加入20 μL的MTT，4 h后棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩300 s，靜置30 s，測定492 nm波長處的OD值，按式（1）計算細(xì)胞存活率。

1.3.3 細(xì)胞上清液LDH活力測定

細(xì)胞分組及處理同1.3.2節(jié)。LPS作用24 h后，收集各組細(xì)胞上清液，按酶聯(lián)免疫吸附測試（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒說明書檢測LDH活力。經(jīng)不同質(zhì)量濃度LPS作用后，檢測其細(xì)胞上清液LDH活力，以確定后續(xù)實驗中LPS的作用質(zhì)量濃度。

1.3.4 MTT法檢測LUFE對HUVEC存活率的影響

將HUVEC接種到96 孔板，分為空白對照組和LUFE組?？瞻讓φ战M加無血清DMEM培養(yǎng)液，LUFE組分為7 個組，向DMEM培養(yǎng)液中加入LPS，使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1、2、4、8、16、32 μg/mL，每組設(shè)8 個復(fù)孔，作用24 h。每孔加入20 μL的MTT，4 h后棄上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩300 s，靜置30 s，測定492 nm波長處的OD值，按式（2）計算細(xì)胞存活率。

1.3.5 MTT法檢測LUFE預(yù)處理對LPS作用后HUVEC存活率的影響

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1×104個/mL的密度接種于96 孔板中，分為空白對照組、模型組和LUFE低（1 μg/mL）、中（4 μg/mL）、高（16 μg/mL）劑量組。經(jīng)不同劑量的LUFE干預(yù)24 h后，除空白對照組外，其余各組均加入LPS，使其終質(zhì)量濃度為1 μg/mL，作用24 h。同1.3.2節(jié)方法檢測492 nm波長處的OD值，按式（3）計算細(xì)胞存活率。

1.3.6 細(xì)胞上清液LDH、IL-6、TNF-α、E-選擇素和MCP-1水平測定

細(xì)胞分組同1.3.4節(jié)。收集各組細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測相應(yīng)指標(biāo)水平。

1.3.7 Hoechst染色觀察THP-1與HUVEC的黏附作用

將HUVEC以6×104個/mL的密度接種于6 孔板，細(xì)胞分組同1.3.4節(jié)。將常規(guī)培養(yǎng)的THP-1用Hoechst 33342染料進行活細(xì)胞核染色15 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗去多余染料，用無血清培養(yǎng)基重懸。將重懸的THP-1以5×105個/mL密度加入各組HUVEC中，共培養(yǎng)6 h，PBS洗去未黏附的THP-1。用細(xì)胞成像微孔板檢測系統(tǒng)觀察與HUVEC發(fā)生黏附的THP-1，用ImageJ圖像處理軟件計算各組相對黏附數(shù)量。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測HUVEC的ICAM-1表達水平

HUVEC分組同1.3.4節(jié)。常規(guī)消化、離心，各組用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL。每組各取100 μL細(xì)胞懸液放入EP管中，加入APC標(biāo)記的CD54（ICAM-1）抗體2 μL，同型對照組加入APC標(biāo)記的IgG抗體2 μL，避光孵育20 min，加入PBS 1 mL，以300×g離心5 min，棄除上清液。每組再加入500 μL PBS，重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀測定ICAM-1的表達水平。

1.3.9 蛋白免疫印跡法檢測HUVEC的TLR4、MyD88、TAK1、MAPK（p38和JNK）及細(xì)胞核NF-κB蛋白表達水平

細(xì)胞分組同1.3.4節(jié)。分別收集各組細(xì)胞，加入裂解液，在冰浴上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心20 min。取上清液（細(xì)胞全蛋白）作為檢測TLR4、MyD88、轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1）、MAPK（p38和JNK）的蛋白樣品。用核蛋白抽提試劑提取核蛋白，用于檢測NF-κB表達水平。

將上述兩種蛋白樣品分別進行定量。取30 μg蛋白樣品分別進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。將轉(zhuǎn)膜后的聚偏氟乙烯膜放在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%脫脂奶粉封閉液中封閉1 h后分別加入相應(yīng)的一抗，在4 ℃孵育過夜。經(jīng)洗滌、二抗室溫孵育2 h，用凝膠成像儀進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 LPS對HUVEC存活率及LDH活力的影響

如圖1A所示，與空白對照組比較，LPS在0～400 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對H U V E C 的存活率無顯著影響（P＞0.05）。但其質(zhì)量濃度在1～400 μg/mL時，極顯著提高細(xì)胞上清液LDH水平（P＜0.01）（圖1B），表明當(dāng)LPS質(zhì)量濃度大于1 μg/mL時對細(xì)胞起損傷作用。因此，在后續(xù)實驗中選擇1 μg/mL作為建立HUVEC損傷模型的LPS質(zhì)量濃度。

圖 1 LPS對HUVEC存活率及細(xì)胞上清液LDH活力的影響Fig. 1 Effect of LPS on the survival rate and LDH activity of HUVEC

2.2 LUFE對HUVEC存活率的影響

圖 2 LUFE對HUVEC存活率的影響Fig. 2 Effect of LUFE on survival rate in HUVEC

如圖2所示，與空白對照組比較，LUFE組對HUVEC存活率無顯著變化，說明LUFE在0～32 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對細(xì)胞無毒性作用。

2.3 LUFE對LPS刺激后HUVEC存活率及LDH活力的影響

圖 3 LUFE對LPS刺激后HUVEC存活率及LDH活力的影響Fig. 3 Effect of LUFE on survival rate and LDH levels in HUVEC induced by LPS

如圖3所示，與空白對照組相比，模型組的細(xì)胞存活率無顯著變化，但LDH活力明顯升高，表明1 μg/mL LPS雖不影響細(xì)胞存活率，但對細(xì)胞具有損傷作用。經(jīng)不同劑量的LUFE預(yù)處理后，極顯著降低細(xì)胞上清液LDH活力，這就說明LUFE對損傷細(xì)胞有保護作用。

2.4 LUFE對炎癥因子質(zhì)量濃度的影響

表 1 LUFE對LPS刺激后細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6質(zhì)量濃度的影響Table 1 Effect of LUFE on the levels of TNF-αand IL-6 in HUVEC induced by LPS

如表1所示，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6水平極顯著升高（P＜0.01），說明LPS作用后引起細(xì)胞的炎性損傷。與模型組比較，LUFE各劑量組TNF-α、IL-6水平極顯著降低（P＜0.01），提示LUFE具有一定的抗炎作用。

2.5 LUFE對MCP-1和E-選擇素質(zhì)量濃度的影響

表 2 LUFE對LPS刺激后細(xì)胞上清液MCP-1和E-選擇素質(zhì)量濃度的影響Table 2 Effect of LUFE on the levels of MCP-1 and E-selectin in HUVEC induced by LPS

如表2所示，與空白對照組比較，模型組MCP-1和E-選擇素水平極顯著升高（P＜0.01），而與模型組比較，中、高劑量LUFE組MCP-1和E-選擇素水平極顯著降低（P＜0.01），提示LUFE抑制LPS所致的趨化因子及黏附分子水平的升高。

2.6 LUFE對THP-1與HUVEC黏附作用的影響

圖 4 LUFE對THP-1與HUVEC黏附的影響（200×）Fig. 4 Effect of LUFE on the adhesion of THP-1 to HUVEC (200 ×)

如圖4所示，與空白對照組比較，模型組THP-1與HUVEC的相對黏附數(shù)量極顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)LUFE干預(yù)后THP-1與HUVEC的相對黏附數(shù)量極顯著降低（P＜0.01），說明LUFE能夠抑制這兩種細(xì)胞之間的黏附作用。

2.7 LUFE對細(xì)胞ICAM-1表達水平的影響

圖 5 LUFE對HUVEC的ICAM-1表達水平的影響Fig. 5 Effect of LUFE on the expression level of ICAM-1 in HUVEC induced by LPS

如圖5所示，空白對照組ICAM-1表達量平均值為83.6，模型組平均值為137.8，與空白對照組相比，模型組ICAM-1表達水平升高64.8%。LUFE低、中、高劑量組的ICAM-1表達量平均值分別為124.2、110.6和98.4。與模型組比較，LUFE低、中、高劑量組的ICAM-1表達水平分別降低9.9%、19.7%和28.6%，說明LUFE能降低HUVEC的ICAM-1表達水平。

2.8 LUFE對HUVEC的TLR4信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

圖 6 LUFE對HUVEC的TLR4、MyD88、TAK1蛋白表達水平的影響Fig. 6 Effect of LUFE on the expression of TLR4, MyD88 and TAK1in HUVEC

如圖6A、C所示，與空白對照組比較，模型組TLR4和p-TAK1/TAK1水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，LUFE干預(yù)后其水平極顯著降低（P＜0.01）。如圖6B所示，與空白對照組比較，模型組MyD88水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，經(jīng)LUFE干預(yù)后顯著逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達水平，提示LUFE能夠下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TLR4信號通路相關(guān)蛋白的表達水平。

2.9 LUFE對HUVEC的MAPK通路相關(guān)蛋白表達的影響

圖 7 LUFE對HUVEC的JNK和p38蛋白表達的影響Fig. 7 Effect of LUFE on the expression of JNK and p38 in HUVEC

如圖7所示，與空白對照組比較，模型組JNK、p38蛋白的磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，LUFE各劑量組JNK、p38蛋白磷酸化水平極顯著降低（P＜0.01）。

2.10 LUFE對HUVEC細(xì)胞核NF-кB蛋白表達的影響

圖 8 LUFE對HUVEC細(xì)胞核NF-κB蛋白表達的影響Fig. 8 Effect of LUFE on the expression of NF-κB in HUVEC

如圖8所示，與空白對照組比較，模型組細(xì)胞核NF-κB（p65）磷酸化水平極顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，LUFE各劑量組p-p65水平極顯著降低（P＜0.01），說明LUFE可能抑制p65的激活或p-p65的核移位過程。

3 討 論

LPS作為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，常被應(yīng)用于細(xì)胞炎癥模型的研究[13-15]。LPS通過細(xì)胞相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，表達并產(chǎn)生大量促炎因子[16-18]、黏附分子[19-20]及趨化因子[21]，引起細(xì)胞的炎性損傷。本實驗以LPS作為誘導(dǎo)劑，建立HUVEC炎性損傷模型，觀察了LUFE對血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。

內(nèi)皮細(xì)胞作為脈管系統(tǒng)的重要組成部分，在炎癥及單核細(xì)胞的黏附和滾動過程中起重要的調(diào)節(jié)作用[22]。炎癥部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅是炎癥反應(yīng)的參與者，也是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)者。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)LPS刺激后，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致模型組TNF-α和IL-6等促炎因子水平升高，同時E-選擇素和MCP-1等細(xì)胞黏附分子及趨化因子水平也升高，提示LPS在本實驗劑量范圍內(nèi)雖不影響細(xì)胞存活率，但引起細(xì)胞的炎性損傷，產(chǎn)生大量黏附分子及趨化因子，而這些因子又進一步激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進炎癥反應(yīng)。流式檢測結(jié)果表明，模型組的ICAM-1表達水平高于空白對照組，這與LPS和LPS所致高水平的TNF-α等炎癥因子作用下發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞的激活有關(guān)。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族中的成員，介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并在多種心血管疾病過程中起重要作用[23]。血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達的ICAM-1促進白細(xì)胞激活，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞的黏附。熒光微孔板檢測結(jié)果表明，模型組中HUVEC和THP-1的黏附數(shù)量明顯高于空白對照組（P＜0.01），這與血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達的ICAM-1和E-選擇素以及MCP-1水平有關(guān)。LUFE預(yù)處理能夠顯著抑制由LPS誘發(fā)的TNF-α、IL-6、E-選擇素、MCP-1和ICAM-1水平的升高，并降低THP-1和HUVEC的黏附作用，提示LUFE具有一定的抗炎作用。前期研究結(jié)果表明，LUFE在LPS誘導(dǎo)的大鼠炎性肝損傷模型中通過降低血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平，減輕肝臟的炎性損傷[24]，從而保護肝組織，進一步證實了LUFE的抗炎作用。

TLR4是識別LPS的關(guān)鍵受體，參與LPS介導(dǎo)的炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)炎癥因子的表達[25-26]。LPS在CD14的協(xié)助下激活并結(jié)合細(xì)胞表面的TLR4，啟動TLR4信號傳導(dǎo)通路[27]，影響其下游的MyD88、TAK1等信號分子[28]，激活MAPK、NF-κB等信號通路促進炎癥因子的表達[29-30]。為了闡明LUFE的抗炎機制，觀察LUFE對TLR4/MyD88/TAK1/MAPK信號通路相關(guān)蛋白和NF-κB的表達和活化水平。結(jié)果表明，模型組的TLR4、其下游分子MyD88和TAK1的磷酸化水平明顯高于空白對照組。TAK1的磷酸化進一步激活MAPK家族（ERK、p38和JNK）和NF-κB信號通路，通過其下游的激活蛋白-1家族轉(zhuǎn)錄因子和核轉(zhuǎn)錄因子（p-NF-κB），促進炎癥相關(guān)基因的表達[31-32]。因此，在本實驗中經(jīng)LPS刺激后p-p38、p-JNK和細(xì)胞核p-NF-κB（p65）水平顯著升高，促進炎癥相關(guān)因子的表達，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α、IL-6、E-選擇素、MCP-1和ICAM-1水平的升高。與模型組相比，經(jīng)LUFE干預(yù)后TLR4和MyD88表達量減少，其下游分子TAK1、p38、JNK蛋白的磷酸化水平下降，細(xì)胞核p-NF-κB（p65）水平降低，提示LUFF可能通過TLR4分子，抑制其下游信號分子（MyD88、TAK1、p38、JNK和NF-κB）的激活，減少炎癥相關(guān)因子的表達，即通過抗炎作用保護血管內(nèi)皮細(xì)胞。

綜上所述，LUFE可能通過下調(diào)TLR4/MyD88/TAK1/NF-κB信號通路及MAPK通路，減輕LPS誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性損傷，從而保護血管內(nèi)皮細(xì)胞。