海洋生物毒素的分類(lèi)、毒害作用機(jī)制及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

陳巧莉，楊 兵，洪晴悅，魏鱘鈺，方楚楚，闞建全

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），中國(guó)匈牙利食品科學(xué)合作研究中心，重慶 400715）

海洋生物毒素是目前關(guān)注度頗高的一類(lèi)有害物質(zhì)，其可在貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等海洋生物體內(nèi)積累，再通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，當(dāng)毒素?cái)z入量累積到一定量時(shí)，極易引起人體中毒。據(jù)了解，每年全球約有6 000多起中毒事件與貝類(lèi)毒素有關(guān)，致死率達(dá)1.5%[1]。其中由麻痹性貝類(lèi)毒素（paralytic shellfish poison，PSP）引起的中毒事件比率占到87%，該毒素是全球分布最廣、事故發(fā)生率最高、危害程度最大的一類(lèi)毒素；其次是腹瀉性貝類(lèi)毒素（diarrhetic shellfish poison，DSP），約占5%[2-3]。中國(guó)食品科技網(wǎng)（http://www.tech-food.com/news/series/1300/）的報(bào)道顯示，每年夏秋季，在我國(guó)沿海城市發(fā)生的食物中毒事件中，有40%是由DSP引起的。2008年，由大連出口日本的油炸牡蠣被檢出DSP達(dá)到0.1 MU/g[4]；2011年5月寧波市爆發(fā)了由DSP引起的“淡菜”中毒事件，導(dǎo)致上百人中毒[5]；2017年6月，福建漳州164 人由于食入被PSP污染的貽貝、牡蠣等貝類(lèi)導(dǎo)致食物中毒，出現(xiàn)頭暈、嘔吐、四肢癱瘓等癥狀[6]。近年來(lái)，全球由海洋毒素引起的食物中毒事件數(shù)量仍在逐年增加，僅美國(guó)每年就有7 600萬(wàn) 人發(fā)生海洋生物毒素中毒，其中5 000 人死亡[7]。海洋生物毒素對(duì)于人類(lèi)的影響不只是短期內(nèi)的急性中毒，其在體內(nèi)長(zhǎng)期積累還會(huì)引發(fā)腫瘤和癌癥，對(duì)人類(lèi)健康造成了潛在危害。因此，深入了解海洋生物毒素的分類(lèi)、毒害作用機(jī)制以及相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)人類(lèi)的生命安全具有重要意義。

1 海洋生物毒素的概述

海洋生物毒素是一類(lèi)存在于海洋生物體內(nèi)的小分子化合物，大多由藻類(lèi)、浮游植物或微生物產(chǎn)生，主要有以下特點(diǎn)[8]：1）化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特且多樣：結(jié)構(gòu)類(lèi)型異于其他毒素，部分結(jié)構(gòu)為自身特有；2）生物活性高：可高度選擇并親和受體分子；3）毒性強(qiáng)：一般有劇毒，極易引起人類(lèi)中毒；4）作用機(jī)理特殊：主要通過(guò)特異性作用于神經(jīng)受體或離子通道，調(diào)控相關(guān)細(xì)胞活動(dòng)產(chǎn)生作用。目前已發(fā)現(xiàn)1 000余種海洋生物毒素，已知結(jié)構(gòu)的約有幾十種，其可在魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)等濾食性海洋生物體內(nèi)累積且不對(duì)此生物體產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)由于毒素?zé)岱€(wěn)定性好，不能被加熱或常規(guī)烹飪方式所破壞，因此其經(jīng)過(guò)食物鏈被人類(lèi)食用后極易引起人類(lèi)中毒，嚴(yán)重時(shí)可致死，相關(guān)毒素傳遞過(guò)程見(jiàn)圖1。海洋生物毒素來(lái)源多、分布廣，根據(jù)不同的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，可被分為不同種類(lèi)，具體分類(lèi)及部分典型海洋生物毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式分別見(jiàn)表1、2。

圖 1 海洋生物毒素傳遞過(guò)程Fig. 1 Transfer of marine biotoxins through the food chain

表 1 主要海洋生物毒素的分類(lèi)Table 1 Classification of major marine biotoxins

表 2 部分典型海洋生物毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Table 2 Chemical structures of typical marine biotoxins

續(xù)表2

2 海洋生物毒素的毒害作用機(jī)制

海洋生物毒素主要通過(guò)特異性作用于靶受體，改變相關(guān)離子通道功能，阻礙其電信號(hào)傳遞，紊亂生物體的生理功能，從而產(chǎn)生毒理作用。離子通道本質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)微孔道，其作為細(xì)胞和外界環(huán)境進(jìn)行信息傳遞的媒介，對(duì)維持正常生命活動(dòng)起著重要作用。其中海洋生物毒素的作用離子通道主要有兩種[11]：一是電壓門(mén)控離子通道（如Na+、K+、Ca2+通道）；二是配體門(mén)控離子通道（如乙酰膽堿受體通道和谷氨酸受體通道），其靶標(biāo)示意圖見(jiàn)圖2。

圖 2 海洋生物毒素主要靶標(biāo)示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the major targets of marine biotoxins

圖 3 海洋生物毒素的Na＋通道結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)Fig. 3 Sodium channel architecture and binding sites of marine biotoxins

表 3 幾種重要海洋生物毒素的毒害作用機(jī)制Table 3 Toxic mechanisms of several important marine biotoxins

對(duì)于大部分海洋生物毒素而言，其主要通過(guò)VDSC產(chǎn)生毒害作用。該離子通道由α、β1和β2 3 個(gè)亞基組成，α與β1非共價(jià)結(jié)合，α與β2共價(jià)結(jié)合[10]。由圖3可知，α亞基包括4 個(gè)同源域（I～I(xiàn)V），每個(gè)同源域包含6 個(gè)跨膜片段（S1～S6）和一個(gè)連接內(nèi)外部的多肽環(huán)[9]，其中帶正電的S4段和連接同源域III和IV的親水性片段可分別激活和抑制VDSC。同時(shí)在VDSC上至少存在6 個(gè)不同的毒素靶受體結(jié)合位點(diǎn)，不同毒素與不同位點(diǎn)作用時(shí)，會(huì)產(chǎn)生不同的毒害作用，主要包括鈉通道阻滯劑、鈉通道激活劑和鈉通道抑制劑[20]。

其中鈉通道阻滯劑是一類(lèi)與Na+通道位點(diǎn)1特異性結(jié)合的毒素，主要包括PSP和TTX等。PSP通常與神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)合，造成細(xì)胞膜電壓門(mén)控的Na+通道高親和力障礙，影響或阻止Na+內(nèi)流，從而使正常的動(dòng)作電位無(wú)法形成，特異性干擾神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)過(guò)程，使隨意肌松弛麻痹，進(jìn)而導(dǎo)致一系列中毒癥狀[21]。Sapse等[22]研究表明，Na+通道被STX抑制的原因是通道外膜胍基和羧基相互作用而不能結(jié)合Na+。此外，STX除了作用于Na+通道外，也能結(jié)合Ca2+、K+通道，是一種多受體靶位的海洋生物毒素。TTX的作用機(jī)制與PSP相似，為細(xì)胞膜Na+通道的選擇性快速阻斷劑，其活性基團(tuán)是1、2、3位的胍胺基和C4、C9、C10位的羥基[23]，受體位于可興奮細(xì)胞膜外側(cè)、Na+通道外口附近，TTX與鈉通道受體部位1結(jié)合后，阻止Na+接近通道的外口，使Na+不能通過(guò)通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。NSP則是通過(guò)作用于Na+通道位點(diǎn)5而產(chǎn)生毒害作用，它與PSP阻斷Na+內(nèi)流相反，NSP的活性成分PbTX可以誘導(dǎo)Na+內(nèi)流，從而導(dǎo)致肌肉和神經(jīng)細(xì)胞去極化，但其效果能被作用于Na+通道位點(diǎn)1的毒素（如STX和TTX）完全消除。對(duì)于鈉通道失活劑，主要是作用于Na+通道位點(diǎn)6的δ-CNTX。CNTX一般由10～31 個(gè)氨基酸殘基組成，含有2 對(duì)或3 對(duì)二硫鍵，目前已鑒定出了50多種CNTX。根據(jù)其作用受體的不同，將其分為δ-CNTX、μ-CNTX、α-CNTX以及ω-CNTX等多種類(lèi)型，其中δ-CNTX特異性作用于神經(jīng)元電壓依賴(lài)性Na+通道，延緩Na+失活，延長(zhǎng)動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間；而μ-CNTX的作用機(jī)制與PSP和TTX相似，能與Na+通道位點(diǎn)1特異性結(jié)合，阻斷Na+內(nèi)流，抑制動(dòng)作電位的產(chǎn)生；α-CNTX特異性阻斷突觸后膜乙酰膽堿受體；ω-CNTX特異性阻斷神經(jīng)元電壓敏感性鈣離子通道，從而產(chǎn)生作用[24]。幾種重要海洋生物毒素的相關(guān)特性見(jiàn)表3、4。

表 4 不同類(lèi)別CNTX的毒害作用機(jī)制Table 4 Toxic mechanisms of different conotoxins

3 海洋生物毒素檢測(cè)技術(shù)

3.1 生物分析法

3.1.1 小鼠生物分析法

小鼠生物分析（mouse bioassay，MBA）法是檢測(cè)海洋生物毒素毒性大小的常見(jiàn)技術(shù)之一。采用MBA法分析DSP時(shí)，樣品提取步驟繁瑣且提取液易受其他基質(zhì)干擾，導(dǎo)致檢測(cè)誤差較大。故為更好地完善MBA法在DSP檢測(cè)上的應(yīng)用，Lee等[32]將提取溶劑丙酮換成二乙基醚，消除了PSP干擾，但該法易損失低極性的DSP；而后改用添加己烷沖洗脂防酸的方法提取，檢測(cè)靈敏度提高，OA檢出限為0.8 μg/g。當(dāng)加拿大首次爆發(fā)ASP中毒事件后，MBA法開(kāi)始被用于檢測(cè)ASP。向小鼠腹腔注射DA后，其出現(xiàn)身體失衡、走動(dòng)蹣跚及痙攣等癥狀，檢出限為40 μg/g；其中當(dāng)毒素含量較高時(shí)（＞100 μg/g），中毒癥狀與劑量之間有良好的相關(guān)性。

3.1.2 其他生物體分析法

生物分析法的檢測(cè)對(duì)象除了小鼠外，還可選取家蠅、蝗蟲(chóng)、水蚤等生物進(jìn)行毒素檢測(cè)。采用家蠅生物分析法檢測(cè)PSP，主要是將PSP的酸性提取液注入家蠅體內(nèi)，然后觀察記錄家蠅的活動(dòng)特征和死亡時(shí)間。該法與MBA法十分相似，用其檢測(cè)貝樣中STX，檢出限為0.2 μg/g[33]。Hess等[34]采用水蚤生物分析法檢測(cè)OA和DTX，檢出限僅約為MBA法的1/10。在CFP的生物測(cè)試中，研究人員嘗試采用多種生物進(jìn)行測(cè)試，其中受試動(dòng)物主要有小雞、貓、鹵蟲(chóng)、蚊子和雙翅目幼蟲(chóng)等，其中小雞、貓、雙翅目幼蟲(chóng)用有毒魚(yú)肉直接喂養(yǎng)，鹵蟲(chóng)利用毒素提取溶液培養(yǎng)，蚊子采用毒素提取溶液注射，最后通過(guò)觀察受試動(dòng)物中毒情況來(lái)判斷毒性，但這些方法均存在倫理道德問(wèn)題的困擾且受自身弊端所限，無(wú)法推廣使用。

3.1.3 細(xì)胞毒性分析法

細(xì)胞毒性分析法也稱(chēng)組織培養(yǎng)分析法，其毒性分析途徑主要有3 個(gè)：1）采用顯微觀察受試細(xì)胞（如神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞、鼠干細(xì)胞等）的形態(tài)變化[35-36]；2）四甲基偶氮唑鹽顯色反應(yīng)[37]；3）采用熒光比色法測(cè)定F-actin蛋白的表達(dá)水平[38]。采用細(xì)胞毒性分析法檢測(cè)PSP時(shí)，其原理基于箭毒和藜蘆定對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Na+通道具有協(xié)同開(kāi)放作用，可促進(jìn)Na+內(nèi)流，改變細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，最終使細(xì)胞形態(tài)腫脹甚至裂解死亡[39]；而PSP作為Na+通道阻斷劑對(duì)這種細(xì)胞腫脹起拮抗作用，且拮抗程度與毒素的劑量密切相關(guān)。Yamamori等[40]應(yīng)用該原理，以小鼠神經(jīng)細(xì)胞作為受試細(xì)胞，對(duì)PSP的關(guān)鍵組分STX進(jìn)行細(xì)胞毒性測(cè)定。結(jié)果表明，STX檢出限為0.4 μg/g，同時(shí)該團(tuán)隊(duì)采用神經(jīng)細(xì)胞生物分析裝置分析貝類(lèi)中STX，檢出限為0.02 μg/g，靈敏度遠(yuǎn)高于MBA法。

3.1.4 免疫分析法

Garthwaite等[41]建立一個(gè)可對(duì)PSP、DSP、ASP和NSP進(jìn)行分析的酶聯(lián)免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）篩選系統(tǒng)，其靈敏度高，同時(shí)使用乙醇提取可得到較高回收率。Kawatsu等[42]開(kāi)發(fā)了一種基于單克隆抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)貝類(lèi)中DA，檢出限為0.04 μg/g，加標(biāo)平均回收率為103%；Wang Li等[43]對(duì)該法進(jìn)行優(yōu)化并用其檢測(cè)海鮮中的OA，檢出限為0.45 ng/mL，與高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）-熒光法結(jié)果的相關(guān)性為0.934 7，且有效避免了貝類(lèi)基質(zhì)的干擾。Zhou Yu等[44]基于單克隆抗體的膠體金免疫色譜條法檢測(cè)河豚魚(yú)組織中TTX，檢出限為40 ng/mL。Liu Binghui等[45]采取同樣的方法檢測(cè)OA，10 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，檢出限為5 ng/mL；同時(shí)該作者結(jié)合ELISA分別對(duì)20 個(gè)海鮮樣品中OA進(jìn)行檢測(cè)，兩種方法數(shù)據(jù)吻合度高，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，可用于快速篩查貝類(lèi)樣品中OA。隨著技術(shù)發(fā)展及檢測(cè)需要，大量簡(jiǎn)便快捷的商業(yè)化試劑盒應(yīng)運(yùn)而生。Harrison等[46]采用4 種商業(yè)化試劑盒（1 種ELISA試劑盒、1 種蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2A，PP2A）試劑盒及2 種側(cè)流免疫測(cè)定試劑盒）檢測(cè)貝類(lèi)DSP。研究表明，4 種試劑盒的檢測(cè)結(jié)果與HPLC所測(cè)結(jié)果都具有較好的相關(guān)性，除PP2A試劑盒外，另外3 種試劑盒結(jié)果均存在假陰性。

3.1.5 磷酸酶抑制法

磷酸酶抑制法操作時(shí)需選擇一種合適的物質(zhì)（經(jīng)酶催化后可在特定吸光度下發(fā)生顯色反應(yīng)）作為反應(yīng)底物，最早且最常使用的底物為硝基苯磷酸鹽（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP），當(dāng)待檢毒素中含有衍生物時(shí)，結(jié)果易產(chǎn)生假陰性。Ramstad等[47]優(yōu)化熒光檢測(cè)法，將衍生物進(jìn)行轉(zhuǎn)換，假陰性概率降低，準(zhǔn)確度和靈敏度提高，同時(shí)該學(xué)者也發(fā)現(xiàn)絲氨酸-蘇氨酸PP2A溶液性質(zhì)不穩(wěn)定，最好現(xiàn)配現(xiàn)用。為防止酶溶液活性降低，學(xué)者們利用包埋法和金屬配位化學(xué)法將PP2A與磁性顆粒（magnetic particles，MPs）結(jié)合，以提高酶溶液穩(wěn)定性[48]。2018年，陳佳琦等[49]采用溶膠-凝膠（Sol-gel）技術(shù)對(duì)PP2A進(jìn)行包埋并將其固定于微孔板底部，建立新的貝類(lèi)毒素檢測(cè)法（圖4）。采用該法檢測(cè)OA，檢出限為0.05 μg/g，加標(biāo)回收率為68.8%～119.4%。通過(guò)包埋處理一方面保證了PP2A活性（可于-18 ℃下至少保存4 個(gè)月）；另一方面簡(jiǎn)化了試劑配制步驟，省時(shí)高效。不同生物分析法在海洋生物毒素檢測(cè)應(yīng)用上的比較，簡(jiǎn)單歸納如表5所示。

圖 4 基于Sol-gel包埋的PP2A抑制比色法原理圖[49]Fig. 4 Principle of the colorimetric assay of protein phosphatase 2A inhibition based on immobilization in sol-gel[49]

表 5 生物分析法在海洋生物毒素檢測(cè)中的應(yīng)用Table 5 Application of bioassays in the detection of marine biotoxins

3.2 物理化學(xué)分析法

3.2.1 高效液相色譜法

HPLC法包括HPLC-紫外檢測(cè)法（HPLC-ultraviolet，HPLC-UV）、HPLC-熒光檢測(cè)法（HPLC-fluorescence detector，HPLC-FLD），HPLC-質(zhì)譜檢測(cè)法（HPLC-mass spectrometry，HPLC-MS）等，其中在海洋生物毒素檢測(cè)上最早得以應(yīng)用的是HPLC-UV。

1989年，Lawrence等[50]首次采用HPLC-UV檢測(cè)貽貝組織中的DA。該法采用體積分?jǐn)?shù)50%甲醇溶液提取組織勻漿，并用強(qiáng)陰離子交換固相萃取（strong anion exchange-solid phase extraction，SAX-SPE）進(jìn)行凈化，檢出限約為0.5 μg/g，但因粗提液純度較低且含有色氨酸，結(jié)果極易出現(xiàn)假陽(yáng)性。Donovan等[51]研究提出，采用甲醇-水提取組織樣品后在可進(jìn)行梯度洗脫和UV檢測(cè)的反相C18色譜柱上分離，DA檢出限降低到0.1 μg/g，回收率從89%提高到100%；該法減少了手動(dòng)清潔樣品步驟且有效避免了色氨酸的干擾。后來(lái)，López-Rivera等[52]省略SAX-SPE純化步驟，通過(guò)控制流動(dòng)相pH值實(shí)現(xiàn)從基質(zhì)干擾物和色氨酸中分離出DA及其異構(gòu)體，并對(duì)其進(jìn)行等度色譜分離。當(dāng)pH值為2.5時(shí)，DA平均提取率達(dá)98.5%，檢出限為25 ng/mL。此方法已成功檢測(cè)多種貝類(lèi)毒素，操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)少且靈敏度高。

對(duì)于部分海洋生物毒素來(lái)說(shuō)，其自身對(duì)紫外的吸收較弱且無(wú)法產(chǎn)生熒光，但在堿性條件下先氧化再酸化可產(chǎn)生熒光物質(zhì)，對(duì)此常用HPLC柱后衍生法進(jìn)行檢測(cè)分析。柱后熒光檢測(cè)常用的衍生物主要有9-蒽基重氮甲烷（9-anthryldiazomethane，ADAM）、1-芘重氮甲烷、1-溴代乙?；藕?-溴甲基-7-甲基香豆素等[53]。其中使用頻率最高的是ADAM，與其他試劑相比，其可在溫和條件下進(jìn)行快速定量反應(yīng)，具有較高的選擇性和靈敏度；但該試劑易分解，從而導(dǎo)致不完全衍生化并干擾分析，故其必須在低溫下保存。為提高試劑穩(wěn)定性，Nogueiras等[54]對(duì)ADAM合成方法進(jìn)行改進(jìn)并在流動(dòng)相中添加終體積分?jǐn)?shù)為15%的甲醇溶液，采用優(yōu)化后的HPLC-FLD對(duì)OA進(jìn)行檢測(cè)，色譜分離度提高，檢出限由1.0 ng/g降低到0.714 ng/g；但由于該法洗脫耗時(shí)長(zhǎng)、儀器設(shè)備昂貴且對(duì)技術(shù)人員專(zhuān)業(yè)要求高，故其應(yīng)用受到一定限制?；诖?，江天久等[55]將兩次等度洗脫合并為一次梯度洗脫，實(shí)現(xiàn)了一次進(jìn)樣即可同時(shí)定性定量待測(cè)樣品中GTX和STX組分，極大縮短樣品分析時(shí)間，其中dcGTX3的最低檢出限為7 pg/g，GTX5的最高檢出限為52 pg/g。Vale[56]采用同樣的方法測(cè)定貽貝中OA及DTX-1，檢出限分別為0.8 pg/g和1.3 pg/g。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的高速發(fā)展，HPLC-MS逐漸成為毒素分析的一種主流技術(shù)。該技術(shù)克服傳統(tǒng)HPLC的缺點(diǎn)，允許在沒(méi)有毒素標(biāo)品及衍生物的情況下，對(duì)毒素進(jìn)行定性定量分析，具有靈敏度高、耗時(shí)短、檢出限低、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。Stobo等[57]利用HPLC-MS檢測(cè)OA、DTX-1、DTX-2、YTX、PTX-1、PTX-2、AZA-1、AZA-2和AZA-3。該法采用無(wú)水甲醇-水（80∶20，V/V）提取貝類(lèi)中毒素，再利用C8反相柱對(duì)毒素進(jìn)行梯度洗脫分離。結(jié)果顯示，OA、PTX-2和AZA-1的檢測(cè)范圍為0.013～0.250 μg/g，YTX的檢測(cè)范圍為0.1～0.4 μg/g。Bra?a-Magdalena等[58]優(yōu)化樣品前處理?xiàng)l件，建立超高效液相色譜-MS/MS檢測(cè)方法。該法可在酸性條件下通過(guò)快速極性切換鑒定出14 種親脂性海洋毒素。在快速極性切換中，動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)優(yōu)于靜態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，顯現(xiàn)出檢出限更低、重現(xiàn)性更好且樣品通量更大等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)結(jié)合與基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)貽貝提取液中毒素進(jìn)行準(zhǔn)確定量，分析時(shí)間少于3 d，其中DTX1、DTX2、YTX和AZA1的回收率均為80%～120%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤8%。de la Iglesia等[59]利用快速液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜（rapid resolution liquid chromatography-mass spectrometry，RRLC-MS/MS）的方法快速分離貝類(lèi)中ASP。該法可直接分析粗提物，無(wú)需進(jìn)一步純化，整個(gè)過(guò)程不到3 min即可完全分離出DA及其異構(gòu)體，檢出限為0.05 μg/g；與LC-UV檢測(cè)結(jié)果一致（R2＝0.975 1），可用于基質(zhì)較復(fù)雜的毒素檢測(cè)。

3.2.2 薄層色譜法

薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）是食品分析領(lǐng)域中廣泛使用的技術(shù)，過(guò)去常用其篩查農(nóng)業(yè)產(chǎn)品中是否存在霉菌毒素[60]，如今，TLC逐步應(yīng)用到海洋毒素的檢測(cè)分析中。Quilliam等[61]開(kāi)發(fā)了一種結(jié)合SPE純化的TLC用于半定量分析貝類(lèi)組織中DA，使用手持式短波紫外線(xiàn)燈檢測(cè)發(fā)現(xiàn)DA含量低至10 μg/g，同時(shí)采用茚三酮噴涂硅膠TLC板發(fā)現(xiàn)茚三酮與DA的仲胺反應(yīng)生成鮮明的黃色產(chǎn)物。該TLC簡(jiǎn)單快速，且不需要使用昂貴的設(shè)備，故適合未配備LC系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行貝類(lèi)組織的常規(guī)篩查。Indrasena等[62]聯(lián)合火焰熱離子檢測(cè)器（flame thermionic detector，F(xiàn)TID）建立針對(duì)PSP檢測(cè)的TLC。結(jié)果顯示，F(xiàn)TID響應(yīng)隨著檢測(cè)器電流和掃描時(shí)間的延長(zhǎng)增加，當(dāng)檢測(cè)器電流提高到3.3 A時(shí)，F(xiàn)TID響應(yīng)比FID高出130 倍；采用該法檢測(cè)GTX 2/3、STX、neo-STX，其檢出限分別為0.4、2.1 μg/g和0.8 μg/g。

3.2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法（capillary electrophoresis，CE）常用檢測(cè)器有紫外檢測(cè)器、激光誘導(dǎo)熒光（laser induced fluorescence，LIF）檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器，其中最早得以應(yīng)用的是UV檢測(cè)器。Bouaicha等[63]首先用配有UV檢測(cè)器的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法鑒定貽貝中OA與DTX-2，但因緩沖液選擇不佳，致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想。Kinoshita等[64]優(yōu)化傳統(tǒng)UV法后測(cè)定貝類(lèi)中OA和DTX-1，兩者檢出限均為3.25 μg/mL，而后又通過(guò)控制緩沖液pH值，開(kāi)發(fā)了準(zhǔn)靜態(tài)掃描富集分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)增大進(jìn)樣量的同時(shí)將STX和DA的檢測(cè)靈敏度分別提高了950 倍和810 倍。Gago-Martínez等[65]建立一種用于分析DA的毛細(xì)管電泳色譜法（capillary electrochromatography，CEC）。研究發(fā)現(xiàn)，電流流過(guò)色譜柱時(shí)由于產(chǎn)熱易出現(xiàn)氣泡，產(chǎn)生基線(xiàn)噪音，從而難以獲得穩(wěn)定的流動(dòng)相條件；此外，采用電動(dòng)注射，樣品基質(zhì)易受電導(dǎo)率影響，穩(wěn)定性和可重復(fù)性低。為更好地完善CEC，Wu Weimin等[66]結(jié)合CEC的高效性和HPLC的高選擇性提出了加壓毛細(xì)管電泳色譜法（pressurized capillary electrochromatography，pCEC），其HPLC泵連接到毛細(xì)管的入口端，用溶劑向毛細(xì)管柱提供輔助壓力從而抑制氣泡形成，并采用螺旋式進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)定量進(jìn)樣。在最佳條件下，該法6 min即可分離出DA，檢出限為2 mg/g。因毛細(xì)管柱的光路長(zhǎng)度較短，故其檢測(cè)靈敏度較低。為此，Cheng Yongqiang等[67]開(kāi)發(fā)了一種低試劑消耗且穩(wěn)定靈敏的pCEC-LIF技術(shù)，60 s內(nèi)即可完全分離DA，檢出限可達(dá)15 ng/g，靈敏度高于pCEC-UV且流動(dòng)相消耗僅為常規(guī)HPLC的1/800。

3.2.4 拉曼光譜法

近年來(lái)，表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）憑借高選擇性檢測(cè)樣品中目標(biāo)分子而備受關(guān)注。Yao Yiping等[68]通過(guò)紫外共振拉曼法檢測(cè)DA，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為242 nm和257 nm時(shí)，其檢出限分別為1 μg/mL和2.5 μg/mL。研究表明，基于Ag納米粒子的膠體水溶膠對(duì)STX進(jìn)行SERS快速檢測(cè)，5 s即可完成40 ng/mL STX樣品的光譜收集，其檢出限為3 ng/mL；同時(shí)該作者采用1 min的總積分時(shí)間（每次10 s，6 次累積）收集SERS光譜以提高信噪比，減少了樣品處理和底物制備工作?；诖?，Müller等[69]分別以純Ag納米粒子和氨基化的Ag納米粒子為基質(zhì)，以蒸餾水和海水為溶劑，對(duì)貝類(lèi)中DA進(jìn)行SERS檢測(cè)。結(jié)果顯示，采用氨基化的Ag納米粒子效果優(yōu)于未氨基化的Ag納米粒子，采用海水溶解的檢出限低于蒸餾水溶解的檢出限，分別為0.033 ng/mL和0.33 ng/mL。為進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間，Huai Qiyong等[70]采用SERS結(jié)合激光鑷子拉曼光譜檢測(cè)STX，該法2 s內(nèi)即可獲得拉曼光譜峰，檢出限為2 ng/mL。Traynor等[71]應(yīng)用滴涂沉積拉曼技術(shù)檢測(cè)低濃度樣品中的DA，其拉曼光譜信號(hào)清晰且無(wú)噪音，檢出限為25 ng/mL。

物理化學(xué)法主要依賴(lài)于色譜分離技術(shù)和紫外、熒光、質(zhì)譜定性定量技術(shù)，其在海洋生物毒素檢測(cè)方面的應(yīng)用簡(jiǎn)單歸納如表6所示。

表 6 物理化學(xué)法在海洋生物毒素檢測(cè)中的應(yīng)用Table 6 Applications of physicochemical methods in the detection of marine biotoxins

3.3 電化學(xué)生物傳感器法

3.3.1 免疫傳感器

免疫傳感器的設(shè)計(jì)關(guān)鍵是表面免疫固定技術(shù)的選擇。在多數(shù)情況下，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）或卵清蛋白常被用作毒素固定在電極表面上的載體。Campàs等[72]將競(jìng)爭(zhēng)ELISA與酶標(biāo)記進(jìn)行結(jié)合，開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)貝類(lèi)中OA（圖5）。該法將堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）作為標(biāo)記物進(jìn)行信號(hào)追蹤，采用計(jì)時(shí)電流法對(duì)OA進(jìn)行檢測(cè)，其檢出限分別為1.07 ng/mL和1.98 ng/mL；為進(jìn)一步提高其靈敏度，該作者采用心肌黃酶優(yōu)化ALP標(biāo)記，檢出限降低至0.03 ng/mL。與MBA法相比，該法不僅分析時(shí)間短、檢出限低，而且有效避免了YTXs的干擾，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性。對(duì)于低分子質(zhì)量毒素（如PbTX等），通常只有一個(gè)羥基可用于交聯(lián)，這阻礙了其在免疫傳感器上的固定化。Micheli等[73]對(duì)首次開(kāi)發(fā)的PbTX電化學(xué)免疫傳感器進(jìn)行改造，獲得PbTX-BSA結(jié)合物，并將該結(jié)合物固定在絲網(wǎng)印刷電極（screen-printed carbon electrode，SPCE）表面進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性分析，檢出限為6 ng/mL。Hayat等[74]研究發(fā)現(xiàn)，在電極表面涂覆蛋白質(zhì)載體會(huì)降低傳感器靈敏度及電子傳遞速度。因此，該團(tuán)隊(duì)研究建立了兩種毒素固定方法（基于重氮偶聯(lián)反應(yīng)機(jī)理在SPCE表面直接固定OA；采用鏈霉親和素包被免疫磁珠（immunomagnetic beads，IMBs）固定OA）。結(jié)果顯示，前者檢出限為1.44 pg/mL，低于歐盟指定的檢出限（2.4 ng/mL）[72]；后者檢出限為0.38 ng/mL，毒素回收率為96%，且不受基質(zhì)效應(yīng)的干擾。另外，研究人員用樹(shù)狀大分子固定PbTX-2，同時(shí)結(jié)合金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，三維網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用大大提高免疫固定化率，此外，利用AuNPs提高了傳感器靈敏度，檢出限為0.01 ng/mL，遠(yuǎn)低于僅含AuNPs或樹(shù)狀大分子的免疫傳感器（分別為0.5 ng/mL和0.1 ng/mL）[75]。研究表明，利用多壁碳納米管（multi-walled carbon nanotube，MWCNT）修飾電極，可減少非特異性吸附，降低基質(zhì)效應(yīng)，提高該傳感器的適用性。2015年，Reverté等[76]開(kāi)發(fā)了結(jié)合AuNPs和聚乙烯的電化學(xué)生物傳感器用于檢測(cè)河豚中TTX，檢出限為0.07 μg/g，低于免疫比色法（檢出限0.23 μg/g），同時(shí)基質(zhì)效應(yīng)降低。隨后Leonardo等[77]將IMBs與八電極陣列相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了AZAs的多重電化學(xué)檢測(cè)，檢出限比免疫比色分析降低了2.6 ng/mL。

圖 5 基于競(jìng)爭(zhēng)性間接檢測(cè)OA的電化學(xué)免疫傳感器[78]Fig. 5 Electrochemical immunosensor for okadaicacid detection based on a competitive indirect assay[78]

3.3.2 酶?jìng)鞲衅?/p>

迄今為止，只有PP2A和磷酸二酯酶已被確定為特定的海洋毒素生物識(shí)別分子，其中DSP和MC、YTX可對(duì)其活性產(chǎn)生抑制作用。采用酶?jìng)鞲衅鞣z測(cè)DSP的主要挑戰(zhàn)是聚丙烯的不穩(wěn)定性及樣品基質(zhì)對(duì)酶活性的影響。目前，為提高酶穩(wěn)定性，通常將酶包埋后再把聚丙烯固定在微量板上對(duì)毒素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)使用固相萃取分離樣品以降低基質(zhì)效應(yīng)。2007年，Campàs等[78]首次將聚丙烯固定在SPCE上，采用單磷酸淀粉測(cè)定酶活性，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的酶?jìng)鞲衅鳌２捎迷搨鞲衅鲗?duì)OA進(jìn)行檢測(cè)，其檢出限為6.42 ng/mL；同時(shí)對(duì)甲藻提取物進(jìn)行分析，結(jié)果與HPLC-MS法測(cè)定的結(jié)果吻合度高。這種固定方法雖然保證了酶穩(wěn)定性，但同時(shí)酶與底物、毒素之間的特異性識(shí)別受限。為克服這種弊端，可采用氨基酸殘基與金屬親和作用進(jìn)行固定化，將酶固定在Ni改性的IMBs上。Gu Huajie等[79]開(kāi)發(fā)了將MWCNT膜結(jié)合到電極表面的生物傳感器，由于MWCNT側(cè)壁與酶上芳香環(huán)之間的氫鍵和π-π堆積作用，故酶的固定化過(guò)程是穩(wěn)定的。采用該法檢測(cè)貝類(lèi)中OA，檢出限為2.75 μg/g。Ikehara等[80]基于MC對(duì)PP2A的抑制作用，研發(fā)了用于檢測(cè)MC的安培生物傳感器。該法將經(jīng)包埋后的PP2A固定在經(jīng)石墨烯修飾的SPCE上，以單磷酸兒茶酚基酯、磷酸α-萘基磷酸酯及4-甲基傘形基磷酸酯作為磷酸化底物，通過(guò)電化學(xué)方法檢測(cè)PP2A活性，從而判斷毒素活性。采用該法對(duì)水華樣品MC進(jìn)行分析，當(dāng)35%和100% PP2A被抑制時(shí)，其檢出限分別為0.037 μg/mL和1 μg/mL。Smienk等[81]將OA的蛋白磷酸酶抑制與丙酮酸氧化酶的磷酸鹽離子消耗相結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為0.1 ng/mL，僅約為比色免疫法的1/50。

3.3.3 適配體傳感器

適配體傳感器中的適配體作為特異性識(shí)別受體，具有以下特點(diǎn)：1）選擇過(guò)程在體外，避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)且成本低；2）高度穩(wěn)定，可長(zhǎng)期儲(chǔ)存；3）極易被功能基團(tuán)修飾。Eissa等[82]研制無(wú)標(biāo)記阻抗傳感器檢測(cè)OA。該法將適配體固定在金電極上，通過(guò)與毒素結(jié)合的適配體構(gòu)象改變而引起的阻抗信號(hào)變化來(lái)監(jiān)測(cè)海洋毒素，其檢出限為70 pg/mL；在貝類(lèi)樣品分析中，毒素回收率達(dá)92%。2015年，Eissa等[83]首次從大量體外隨機(jī)序列中成功篩選出對(duì)PbTX-2具有高親和力的DNA適配體，對(duì)加標(biāo)貝類(lèi)提取物中的PbTX-2進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為106 pg/mL，回收率達(dá)110%，且未發(fā)現(xiàn)與其他海洋毒素的交叉反應(yīng)，該法將有助于食品樣品中PbTX-2的常規(guī)檢測(cè)。為準(zhǔn)確檢測(cè)較低濃度的PTX，Gao Shunxiang等[84]結(jié)合生物層干涉法引入基于HRP適配體的信號(hào)增強(qiáng)技術(shù)，10 min即可實(shí)現(xiàn)對(duì)海鮮中PTX的實(shí)時(shí)檢測(cè)，檢出限為0.04 pg/mL；該傳感器重現(xiàn)性高、穩(wěn)定性好且可特異性區(qū)分PTX與其他海洋生物毒素。

3.3.4 細(xì)胞傳感器

STX、TTX和PSP均可通過(guò)抑制流經(jīng)Na+通道的離子電流而干擾Na+通道功能?；诖?，Wang Qin等[85]利用心肌細(xì)胞建立阻抗生物傳感器檢測(cè)STX和TTX，該生物傳感器可同時(shí)監(jiān)視心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和跳動(dòng)狀態(tài)，對(duì)STX和TTX的檢出限分別為0.087 ng/mL和0.089 ng/mL。同年，該作者聯(lián)合心肌細(xì)胞和微電極陣列快速檢測(cè)STX和PbTX-2。結(jié)果顯示，5 min即可完成檢測(cè)，STX和PbTX-2的檢出限分別為0.35 ng/mL和1.55 ng/mL。Zou Ling等[86]利用神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞設(shè)計(jì)了阻抗生物傳感器（cell impedance biosensor，CIB）檢測(cè)PSP。研究表明，該傳感器靈敏度和特異性高，檢出限低至0.03 ng/mL，低于MBA法檢出限（200 ng/mL）和分析化學(xué)家協(xié)會(huì)HPLC官方方法檢出限（1.2 ng/mL）。此外，該作者還基于人類(lèi)HeLa和HepG2細(xì)胞系分別建立CIB，以動(dòng)態(tài)、實(shí)時(shí)的方式檢測(cè)DSP，其檢出限分別為10.2 μg/L和3.3 μg/L，均低于傳統(tǒng)的細(xì)胞測(cè)定法（HeLa細(xì)胞：21.2 μg/L；HepG2細(xì)胞：9.8 μg/L），且與MBA、LCMS/MS法的測(cè)定結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性[87]。

電化學(xué)生物傳感器主要是利用特定生物分子與海洋毒素間的高親和力，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)海洋毒素的高靈敏檢測(cè)。由于相關(guān)設(shè)備的微型化、便攜化和自動(dòng)化，使得生物傳感器在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和在線(xiàn)監(jiān)控方面具有很好的應(yīng)用前景，其在海洋生物毒素檢測(cè)上的應(yīng)用，簡(jiǎn)單歸納如表7所示。

表 7 電化學(xué)生物傳感器在海洋生物毒素檢測(cè)中的應(yīng)用Table 7 Applications of electrochemical biosensors in the detection of marine biotoxins

4 結(jié) 語(yǔ)

作為海洋生物生產(chǎn)的天然活性產(chǎn)物，海洋生物毒素是自然界已知化合物中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、毒性差別最大的種類(lèi)之一。隨著因赤潮引發(fā)的海產(chǎn)品毒素污染問(wèn)題日益嚴(yán)重及各類(lèi)食物中毒事件的頻繁發(fā)生，人們更加意識(shí)到海洋生物毒素的潛在危害，該類(lèi)毒素毒性強(qiáng)、致死量低，對(duì)人民健康及社會(huì)公共安全構(gòu)成了極大威脅。因此，深入了解海洋生物毒素并及時(shí)監(jiān)測(cè)對(duì)保障人民健康尤為重要。

目前，海洋生物毒素作用機(jī)理方面的研究雖然取得了突破性進(jìn)展，但仍有一些毒素的作用機(jī)理尚不清楚，且尚無(wú)切實(shí)可行的方法去除海產(chǎn)品體內(nèi)的毒素以防止其進(jìn)入人體，所以深入學(xué)習(xí)海洋生物毒素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，強(qiáng)化研究其毒害作用機(jī)制，從而對(duì)海洋生物毒素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是必需的。同時(shí)在海洋生物毒素檢測(cè)上，一方面應(yīng)簡(jiǎn)化樣品前處理方式，提高待測(cè)樣品及試液純度，并開(kāi)發(fā)特異性強(qiáng)的基因芯片和生物傳感器，提高檢測(cè)專(zhuān)一性與靈敏度；另一方面應(yīng)加大商業(yè)化試劑盒、便攜式檢測(cè)工具及自動(dòng)化檢測(cè)儀器的開(kāi)發(fā)，簡(jiǎn)化操作步驟，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)技術(shù)日?；?。此外，為了保護(hù)消費(fèi)者健康，適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和海產(chǎn)品的監(jiān)管控制極為重要，為此，我國(guó)應(yīng)加強(qiáng)相關(guān)法律法規(guī)建設(shè)，健全市場(chǎng)監(jiān)察制度，以更好地保障消費(fèi)者的食品安全。