巴馬長壽特征飲食模式對自然衰老小鼠的抗衰老效果

黃燕婷，梅麗華，潘海博，覃璐琪，饒川艷，聶夢琳，朱雯君，李全陽

（廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西 南寧 530004）

衰老是一個復(fù)雜的分子和細(xì)胞衰退的多因素過程，隨著時間的推移，機(jī)體組織功能會下降，容易生病和死亡[1]。影響衰老的因素有個體遺傳因素和外部環(huán)境因素[2]，其中飲食是外部環(huán)境因素中最重要的部分[3]。

合理飲食與健康長壽的關(guān)系密切，據(jù)文獻(xiàn)報道，堅持地中海飲食可以改善微血管功能[4]，降低糖尿病[5]、心血管疾病、癌癥和退行性疾病的發(fā)生率[6]，還可改善認(rèn)知能力[7]。Takeda等調(diào)查發(fā)現(xiàn)日本百歲老人對肉類、魚類、谷物和脂肪油的攝入量更低[8]。通過飲食干預(yù)延緩衰老是目前研究抗衰老的一項有力手段。對比單一營養(yǎng)素，復(fù)合營養(yǎng)素能更好地起到延緩小鼠衰老的作用[9]。目前對于抗衰老效果的研究，多采用D-半乳糖衰老模型小鼠，而采用自然衰老小鼠驗證抗衰老效果的研究較少，據(jù)報道D-半乳糖衰老模型小鼠與自然衰老小鼠的生化結(jié)果存在一定的差異[10]。目前普遍認(rèn)為自然衰老模型小鼠在神經(jīng)系統(tǒng)、機(jī)體結(jié)構(gòu)及行為上更接近人，其更適合作為研究的對象[11]。

本課題組前期對巴馬長壽區(qū)飲食特征及長壽現(xiàn)象進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，巴馬長壽區(qū)飲食是一種以粥類、粗雜糧類等食物為主的膳食纖維多糖飲食模式[12]，具有低能量、低脂肪、低膽固醇、高膳食纖維、高VA的特征[13]，在此基礎(chǔ)上，宋奇等[14]設(shè)計了能限組、胡豆組、纖維組、元素組和復(fù)合組飲食這5 種飲食模式，用D-半乳糖致衰老小鼠進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)復(fù)合組飲食模式抗衰老效果最為顯著。蘭海靜等[15]進(jìn)一步將巴馬長壽區(qū)飲食特點與特色益生菌合并，設(shè)計了4 種巴馬特色飲食模式，并用D-半乳糖致衰老小鼠進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬飲食模式II、III能顯著改善衰老小鼠的運(yùn)動水平和抗焦慮能力。為了探尋效果更好的巴馬長壽特征飲食模式，并擴(kuò)大范圍研究其對年輕小鼠及自然衰老小鼠的抗衰老效果。本實驗通過凝練前期研究結(jié)果，進(jìn)一步優(yōu)化了膳食纖維、β-胡蘿卜素、番茄紅素、益生菌以及能量限制參數(shù)，設(shè)計了兩種優(yōu)化的巴馬長壽特征飲食模式，并分別采用年輕小鼠和自然衰老小鼠來驗證這兩種模式的抗衰老效果，以期為新飲食模式的具體應(yīng)用提供更加完善的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

36 只3 月齡SPF級昆明小鼠（雌雄各半，體質(zhì)量（36±3）g）和36 只15 月齡SPF級自然衰老的昆明小鼠（雌雄各半，體質(zhì)量（41±3）g）均購自廣西醫(yī)科大學(xué)（生產(chǎn)許可證號：SCXK（桂）2014-0002），飼養(yǎng)溫度（24±2）℃、相對濕度（60±10）%，12 h晝夜交替，每日喂食4 g飼料[16]，自由飲水。

基礎(chǔ)飼料（符合GB 13078—2017《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB 14924.3—2010《實驗動物 配合飼料營養(yǎng)成分》）北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

低聚木糖 山東龍力生物科技股份有限公司；低聚果糖、低聚異麥芽糖 山東百龍創(chuàng)園生物科技股份有限公司；VA醋酸酯干粉、VC粉、VE粉、葡萄糖酸亞鐵、葡萄糖酸錳、富硒酵母 河南明瑞食品添加劑有限公司；β-胡蘿卜素、番茄紅素、大豆異黃酮 西安圣青生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、TPY培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；羅伊氏乳桿菌LT018、發(fā)酵乳桿菌P132、干酪乳桿菌L614（均分離自巴馬百歲老人糞便）廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院食品營養(yǎng)與發(fā)酵工程研究室；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色液 南京建成生物工程研究所；質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛 河北博海生物工程開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CLF-10C超微粉碎機(jī) 浙江省溫嶺市創(chuàng)力藥材機(jī)械廠；9KLP-125制粒機(jī) 鄭州榮豐機(jī)械設(shè)備有限公司；Morris水迷宮設(shè)備上海欣軟信息科技有限公司；Pico17低溫冷凍離心機(jī)美國Thermo公司；立式高壓滅菌鍋上海三申醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；TG16W微量高速離心機(jī) 長沙平凡儀器儀表有限公司；METASH UV-5200紫外-可見分光光度計上海元析儀器有限公司；DNP-9082BS電熱恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CKX41倒置顯微鏡日本Olympus公司；EG1160石蠟包埋機(jī)、1020自動脫水機(jī)、RM2235石蠟切片機(jī) 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 飼料設(shè)計與制備

本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了膳食纖維、β-胡蘿卜素、番茄紅素和益生菌參數(shù)，并進(jìn)行能量限制，設(shè)計了巴馬長壽飲食模式優(yōu)化I（優(yōu)食I）和巴馬長壽飲食模式優(yōu)化II（優(yōu)食II），并分別以自然衰老小鼠和年輕小鼠進(jìn)行驗證。

飼料配制：結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果以及GB 14924.3—2010，并參考齊廣海等[17]的方法。最終確定巴馬長壽特征優(yōu)食I、II的配方：將基礎(chǔ)飼料粉碎，并加入強(qiáng)化的營養(yǎng)素，混勻后，制粒成型。優(yōu)食I中，低聚果糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆異黃酮、VA、VC、VE、鐵、錳、鈷、硒劑量為蘭海靜等[15]所設(shè)巴馬特色飲食模式II組和Ⅲ組之間的中間劑量，計算方法參考文獻(xiàn)[18]，β-胡蘿卜素劑量參考文獻(xiàn)[19]，番茄紅素劑量參考文獻(xiàn)[20]。在優(yōu)食I的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對各類營養(yǎng)素的劑量進(jìn)行強(qiáng)化，得到優(yōu)食II。優(yōu)食II中，膳食纖維用量參考文獻(xiàn)[21-23]，VA用量依據(jù)蘭海靜等[15]飲食模式II進(jìn)行設(shè)計，VC、VE和大豆異黃酮的用量為優(yōu)食I與蘭海靜等[15]所設(shè)計的飲食模式II之間的中間劑量，計算方法參考文獻(xiàn)[18]，β-胡蘿卜素和番茄紅素用量參考文獻(xiàn)[19-20]，鐵、錳劑量參考GB 14924.3—2010進(jìn)行設(shè)計，鈷、硒劑量分別參考宋奇等[14]復(fù)合組、元素組進(jìn)行設(shè)計。兩種優(yōu)化飲食均加入復(fù)合益生菌，干酪乳桿菌L614、發(fā)酵乳桿菌P132和羅伊氏乳桿菌LT018的活菌數(shù)均為108CFU/mL，按照菌液體積比例1∶1∶1混合，灌胃劑量為0.1 mL/10 gmb。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，并灌胃等體積的生理鹽水。

1.3.2 動物分組及處理

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6 組，雌雄各半，每組12 只。36 只3 月齡小鼠隨機(jī)分為年輕對照組、年輕優(yōu)食I組和年輕優(yōu)食II組；36 只15 月齡小鼠隨機(jī)分為衰老對照組、衰老優(yōu)食I組和衰老優(yōu)食II組。各組給予不同處理，年輕優(yōu)食I組和衰老優(yōu)食I組飼喂優(yōu)食I飼料，年輕優(yōu)食II組和衰老優(yōu)食II組飼喂優(yōu)食II飼料，每只小鼠限制進(jìn)食4 g/d，并以0.1 mL/10 gmb灌胃活菌數(shù)為108CFU/mL的混合菌液，年輕對照組和衰老對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，灌胃等體積的生理鹽水。每周記錄一次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化及時調(diào)整灌胃劑量。

1.3.3 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮設(shè)備由一個高50 cm、直徑120 cm的圓形水池及一個平臺組成，池壁每間隔90°設(shè)置一個標(biāo)志物，將平面劃分為4 個象限，平臺設(shè)置在第三象限。水池中加入清水，采用加熱棒調(diào)整水溫在（24±2）℃，添加食品級黑色素將水染成黑色，以隱蔽位于水下的平臺。水迷宮實驗于灌胃第8周開始，參照文獻(xiàn)[24-25]進(jìn)行，為期6 d，實驗前5 d進(jìn)行定位航行實驗，第6天進(jìn)行空間探索實驗。定位航行實驗每天訓(xùn)練4 次，每次訓(xùn)練小鼠都從不同象限的入水點進(jìn)入，入水的同時開始計時，記錄小鼠找到隱藏平臺的時間，即逃避潛伏期，如果60 s內(nèi)小鼠未能找到平臺，則記錄本次的逃避潛伏期為60 s，并將小鼠引導(dǎo)到平臺上，讓其站立在平臺上觀察10 s?？臻g探索實驗將隱藏在水下的平臺撤掉，選取第二象限作為小鼠的入水點，記錄小鼠的逃避潛伏期、60 s內(nèi)小鼠穿越平臺的次數(shù)、在目標(biāo)象限的停留時間和目標(biāo)象限內(nèi)的行駛路程。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)的測定

Morris水迷宮行為學(xué)實驗結(jié)束之后，所有小鼠禁食、禁水12 h，稱體質(zhì)量，麻醉后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，于冰上解剖取出腦組織，用生理鹽水漂洗，濾紙擦干，稱質(zhì)量，并迅速放入-80 ℃冰箱保存。測定當(dāng)天取出腦組織，稱質(zhì)量，加入腦組織質(zhì)量9 倍體積的生理鹽水，在冰水浴中使用勻漿器進(jìn)行勻漿，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%腦組織勻漿液，4 ℃、3 500 r/min離心10 min，取上清液測定SOD活力、GSH-Px活力和MDA含量。

1.3.5 腦組織切片觀察

解剖后取出小鼠的左側(cè)大腦，4 ℃條件下，將左側(cè)大腦固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中24 h以上，脫水處理后，包埋在石蠟中，用石蠟切片機(jī)對樣品切片，再用HE染色，中性樹脂封片，倒置顯微鏡（400×）觀察HE染色顯示的海馬區(qū)形態(tài)學(xué)特征。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 7.00軟件作圖，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用單因素方差分析，多組間比較采用單因素方差分析和Duncan檢驗，P＜0.05表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠體質(zhì)量的影響

表 1 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of Bama longevity characteristic dietary patterns on body mass of mice

體質(zhì)量作為衡量機(jī)體生長的一項指標(biāo)，常用于反映機(jī)體的健康狀況[26]。由表1可知，實驗開始時，年輕雌雄小鼠組間初始體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），衰老雌雄小鼠組間初始體質(zhì)量也無顯著差異（P＞0.05）。實驗結(jié)束后，衰老優(yōu)食II組雌雄小鼠最終體質(zhì)量之間存在顯著性差異（P＜0.05）。與年輕對照組相比，年輕優(yōu)食I組和II組小鼠體質(zhì)量增加量差異不顯著（P＞0.05）。衰老對照組雌鼠和雄鼠體質(zhì)量增加量分別為-2.88、-2.40 g，表明機(jī)體的衰老導(dǎo)致了體質(zhì)量下降。與衰老對照組相比，衰老優(yōu)食I組雌鼠和雄鼠體質(zhì)量增加量均有顯著性差異（P＜0.05）。衰老優(yōu)食II組雌鼠體質(zhì)量增加量為-0.93 g，雄鼠體質(zhì)量增加量為1.68 g。宋奇[14]和蘭海靜[15]等研究發(fā)現(xiàn)巴馬長壽特征飲食模式對D-半乳糖致衰老模型小鼠的生長發(fā)育沒有不良影響。本實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)巴馬長壽特征飲食模式對年輕小鼠的生長發(fā)育影響不顯著，但能夠顯著減緩衰老小鼠體質(zhì)量下降的趨勢。

2.2 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

表 2 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠在水迷宮中逃避潛伏期的影響Table 2 Effects of Bama longevity characteristic dietary patterns on escape latency of mice in water maze test

表2為5 d定位航行實驗中，各組小鼠逃避潛伏期的變化情況。隨訓(xùn)練時間的延長，除衰老對照組外，其余5 組小鼠的逃避潛伏期顯著縮短，年輕對照組雌鼠和雄鼠逃避潛伏期分別縮短了2 7.2 1%、2 4.9 2%（P＜0.05）。年輕優(yōu)食I、II組雌鼠的逃避潛伏期分別縮短了41.67%、32.18%（P＜0.05），雄鼠的逃避潛伏期分別縮短了48.89%、44.05%（P＜0.05）。衰老對照組逃避潛伏期并沒有隨訓(xùn)練時間的延長發(fā)生顯著變化，雌鼠和雄鼠的逃避潛伏期僅分別縮短13.78%、13.02%（P＞0.05），說明自然衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重退化。而衰老優(yōu)食I、II組雌鼠的逃避潛伏期分別縮短46.35%、31.96%（P＜0.05），雄鼠的逃避潛伏期分別縮短27.14%、28.59%（P＜0.05）。年輕優(yōu)食I、II組雄鼠逃避潛伏期下降程度大于雌鼠，而衰老優(yōu)食I、II組雌鼠逃避潛伏期下降程度大于雄鼠，組內(nèi)雌鼠和雄鼠逃避潛伏期差異均不顯著。晏林等[27]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)17 周灌胃不同劑量的枸杞汁能夠使自然衰老小鼠（12 月齡）在定位航行實驗中的逃避潛伏期縮短27.55%～32.69%。相比較而言，本實驗中年輕優(yōu)食I組雌鼠和雄鼠、年輕優(yōu)食II組雄鼠、衰老優(yōu)食I組雌鼠逃避潛伏期下降程度更大，且自然衰老小鼠年齡更大，飲食干預(yù)時間更短，表明巴馬長壽特征飲食模式具有增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的作用，并且優(yōu)食I對學(xué)習(xí)記憶損傷修復(fù)的效果也更明顯。

各組小鼠在平臺象限內(nèi)運(yùn)動情況的典型路線見圖1，整體運(yùn)動趨勢為：年輕對照組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的運(yùn)動范圍較多，停留時間較長，多次穿越平臺。與年輕對照組相比，年輕優(yōu)食I組與年輕優(yōu)食II組小鼠多在目標(biāo)象限內(nèi)運(yùn)動，且在目標(biāo)象限內(nèi)運(yùn)動的路程和停留時間更長，穿越平臺次數(shù)更多；此外，年輕優(yōu)食I組小鼠穿越平臺次數(shù)比年輕優(yōu)食II組較多。衰老對照組小鼠主要圍繞象限的四周運(yùn)動，運(yùn)動方向不明確，很少圍繞平臺象限運(yùn)動，幾乎沒有穿過平臺，在目標(biāo)象限內(nèi)的運(yùn)動路程和停留時間都遠(yuǎn)短于年輕對照組，結(jié)果表明衰老對照組小鼠在前5 d的定位航行實驗中獲得強(qiáng)化記憶的效果很差，學(xué)習(xí)記憶能力嚴(yán)重衰退。與衰老對照組相比，衰老優(yōu)食I、II組小鼠在目標(biāo)象限內(nèi)的運(yùn)動路程和停留時間都有所延長，且多次穿越平臺。說明優(yōu)食I、II組對改善年輕小鼠及自然衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均有效果，有關(guān)量化統(tǒng)計結(jié)果見圖2。

圖 2 巴馬長壽特征飲食模式對各組小鼠逃避潛伏期（A）、穿越平臺次數(shù)（B）、目標(biāo)象限停留時間（C）、目標(biāo)象限路程（D）的影響Fig. 2 Effects of Bama longevity characteristic dietary patterns on escape latency (A), platform-crossing number (B), target quadrant residence time (C) and target quadrant travel distance (D) of mice in each group

由圖2可知，與年輕對照組相比，衰老對照組小鼠逃避潛伏期顯著延長、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間及目標(biāo)象限路程均有所下降，其中雄鼠的逃避潛伏期顯著延長了100.78%（P＜0.05）、穿越平臺次數(shù)顯著下降了58.50%（P＜0.05）。衰老優(yōu)食I、II組與衰老對照組相比，逃避潛伏期均顯著縮短，衰老優(yōu)食I組雌鼠和雄鼠逃避潛伏期分別縮短62.84%、46.59%（P＜0.05），衰老優(yōu)食II組雌鼠和雄鼠逃避潛伏期分別縮短44.51%、59.54%（P＜0.05），年輕優(yōu)食I、II組雌鼠和雄鼠逃避潛伏期與年輕對照組相比也有所縮短，但差異不顯著（P＞0.05）。年輕優(yōu)食I組雌鼠和雄鼠穿越平臺次數(shù)均為最高，與年輕對照組相比，分別提高133.33%（P＜0.05）和50.0%（P＞0.05）。與衰老對照組相比，衰老優(yōu)食I組雌鼠穿越平臺次數(shù)提高150.0%，衰老優(yōu)食II組雄鼠提高120.48%，但差異不顯著（P＞0.05）。衰老優(yōu)食II組雄鼠目標(biāo)象限停留時間較衰老對照組顯著延長108.78%（P＜0.05）。與年輕對照組相比，年輕優(yōu)食I、II組雄鼠目標(biāo)象限停留時間分別延長57.49%、54.39%，但差異不顯著（P＞0.05）。各組雌鼠目標(biāo)象限路程之間沒有顯著性差異，年輕優(yōu)食I、II組雄鼠目標(biāo)象限路程較年輕對照組分別顯著延長68.14%、61.78%（P＜0.05）。衰老優(yōu)食I、II組雄鼠目標(biāo)象限路程比衰老對照組分別延長78.49%、58.51%，但差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，機(jī)體的衰老會引起學(xué)習(xí)記憶能力的衰退，巴馬長壽特征飲食模式能夠提高年輕小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并有效逆轉(zhuǎn)衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的程度。

Morris水迷宮實驗常用于評價小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[28]，據(jù)報道，連續(xù)6 周攝入25～100 mg/kgmb的鷹嘴豆異黃酮提取物可使衰老小鼠的逃避潛伏期縮短5.06%～17.88%[29]。連續(xù)8 周攝入20 g/kgmb的血人參提取物能使D-半乳糖衰老模型小鼠的逃避潛伏期縮短32.74%[30]。連續(xù)6 周攝入250 mg/kgmb的無瓣海桑果實乙醇提取物能使D-半乳糖衰老模型小鼠的穿越平臺次數(shù)顯著提高38.94%[31]。不同劑量的絲瓜提取物能使衰老模型小鼠的目標(biāo)象限停留時間延長26.08%～61.85%[32]。綜上，本實驗中優(yōu)食I、II對增強(qiáng)年輕小鼠與衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與有關(guān)報道相比具有一定的優(yōu)勢。

2.3 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠腦組織抗氧化指標(biāo)的影響

SOD能夠清除機(jī)體內(nèi)的自由基，使細(xì)胞免受氧化損傷，其活性水平與機(jī)體氧化應(yīng)激水平緊密相關(guān)[33]。由圖3A可知，衰老對照組腦組織SOD活力與年輕對照組相比有所降低，且雌鼠顯著下降23.46%（P＜0.05）。年輕優(yōu)食I組與年輕對照組相比，衰老優(yōu)食I、II組與衰老對照組相比，腦組織SOD活力均顯著上升，特別是衰老優(yōu)食I組，雌鼠SOD活力顯著提高49.33%（P＜0.05），雄鼠SOD活力顯著提高34.30%（P＜0.05），衰老優(yōu)食II組雌鼠SOD活力顯著提高41.08%（P＜0.05），雄鼠SOD活力顯著提高30.41%（P＜0.05）。宋奇等[14]設(shè)計的5 種巴馬長壽飲食模式對衰老模型小鼠腦組織SOD活力影響并不顯著（P＞0.05）。羅磊等[34]發(fā)現(xiàn)灌胃200 mg/（kgmb·d）的金銀花葉黃酮能將衰老模型小鼠腦組織SOD活力提高27.34%，均低于本實驗中優(yōu)食I、II對衰老小鼠腦組織SOD活力的調(diào)節(jié)效果。

圖 3 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠腦組織SOD活力（A）、MDA含量（B）和GSH-Px活力（C）的影響Fig. 3 Effects of Bama longevity characteristic dietary patterns on SOD activity (A), MDA content (B) and GSH-Px activity (C) in brain tissue of mice

MDA是體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，含量過高會加劇細(xì)胞膜損傷，MDA含量直接反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化水平[35]。由圖3B可知，與年輕對照組相比，衰老對照組雌雄小鼠腦組織MDA含量分別顯著上升22.98%、46.77%（P＜0.05），表明自然衰老小鼠機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化水平升高。年輕優(yōu)食I、II組與年輕對照組相比，小鼠腦組織MDA含量均有一定程度的下降，尤其是年輕優(yōu)食I組：雌鼠M D A 含量下降2 3.4 7%，雄鼠M D A 含量下降21.51%，但差異不顯著（P＞0.05）。與衰老對照組相比，衰老優(yōu)食I、II組小鼠MDA含量均顯著下降，其中衰老優(yōu)食I組雌雄小鼠MDA含量分別下降21.37%、30.53%（P＜0.05），衰老優(yōu)食II組雌雄小鼠MDA含量分別下降31.45%、36.39%（P＜0.05）。宋奇等[14]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合組飲食模式能使衰老小鼠腦組織MDA含量下降35.26%，略低于本實驗中衰老優(yōu)食II組雄鼠腦組織MDA含量的下降程度。據(jù)報道，持續(xù)6 周灌胃200 mg/（kgmb·d）的秀珍菇多糖可使D-半乳糖致衰老小鼠腦組織中MDA含量下降29.24%[36]。劉貴珊等[37]研究發(fā)現(xiàn)灌胃劑量為100 mg/（kgmb·d）的白藜蘆醇能使衰老模型小鼠腦組織的MDA含量顯著下降23.76%，均低于本實驗中衰老優(yōu)食I組對雄鼠、II組雌鼠和雄鼠的調(diào)節(jié)效果。表明優(yōu)食I、II均可降低年輕小鼠和衰老小鼠腦組織脂質(zhì)過氧化水平，衰老優(yōu)食I、II組中脂質(zhì)過氧化水平降低的效果更加明顯。

GSH-Px作為機(jī)體內(nèi)的一種過氧化氫分解酶，可以清除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的羥自由基和過氧化物，GSH還可促進(jìn)H2O2的分解，使細(xì)胞膜免受過氧化物的損傷，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[38]。由圖3C可知，與年輕對照組相比，衰老對照組雌鼠和雄鼠腦組織GSH-Px活力分別顯著下降35.74%、30.26%（P＜0.05），說明衰老小鼠腦組織抗氧化能力嚴(yán)重?fù)p傷。與衰老對照組相比，衰老優(yōu)食I、II組小鼠腦組織GSH-Px活力均顯著提高，其中衰老優(yōu)食I組雌鼠和雄鼠分別提高71.57%、67.36%（P＜0.0 5），衰老優(yōu)食I I 組雌鼠和雄鼠分別提高58.75%、46.14%（P＜0.05）。與年輕對照組相比，年輕優(yōu)食I組GSH-Px活力也顯著提高，其中雌鼠GSH-Px活力提高36.64%（P＜0.05），雄鼠GSH-Px活力提高37.02%（P＜0.05）。包曉瑋等[39]研究發(fā)現(xiàn)攝入沙棘多糖可有效提高衰老小鼠腦組織GSH-Px活力（12.38%～46.04%），低于本實驗中優(yōu)食I、II對自然衰老小鼠腦組織GSH-Px活力的調(diào)節(jié)效果。結(jié)果表明，優(yōu)食I、II均可有效提高年輕小鼠與衰老小鼠體內(nèi)GSH-Px活力，減緩機(jī)體氧化損傷，優(yōu)食I改善效果更好。

2.4 巴馬長壽特征飲食模式對小鼠海馬區(qū)的保護(hù)作用

海馬區(qū)是腦組織邊緣系統(tǒng)的一部分，直接參與學(xué)習(xí)記憶過程。CA1區(qū)與海馬區(qū)生理功能的發(fā)揮密切相關(guān)，對外界病理因素最為敏感，也是病理變化最早出現(xiàn)的部位，所以海馬CA1區(qū)常作為腦損傷研究的一個典型區(qū)域[40]。大腦衰老與神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥存在因果關(guān)系，老年性慢性損傷打破神經(jīng)元所處的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子和相關(guān)抑制因子的平衡失調(diào)，引起神經(jīng)元變性、壞死和凋亡[41]。由圖4可知，年輕對照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞有3～4 層，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)完整，核仁清晰。年輕優(yōu)食I、II組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞有4～5 層，與年輕對照組相比，排列更為整齊緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)較完整，核仁清晰，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞凋亡及核固縮現(xiàn)象極少。衰老對照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列疏松散亂，層次不清，部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，部分神經(jīng)細(xì)胞形狀發(fā)生改變，呈現(xiàn)不規(guī)則齒狀形態(tài)，形態(tài)正常的細(xì)胞極少。與衰老對照組相比，衰老優(yōu)食I、II組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列更加整齊，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，邊界清晰，少見核固縮，細(xì)胞凋亡情況得到明顯改善。衰老優(yōu)食I組比衰老優(yōu)食II組神經(jīng)細(xì)胞多，出現(xiàn)核固縮、核溶解及細(xì)胞變性壞死的情況減少。陳燏[42]發(fā)現(xiàn)活性肽-N對減緩衰老小鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞神經(jīng)元變性、壞死和凋亡的發(fā)生起有效作用。比較而言，巴馬長壽特征飲食模式也具有預(yù)防衰老小鼠腦組織海馬區(qū)損傷的作用。

圖 4 巴馬長壽特征飲食模式對各組小鼠海馬區(qū)的影響（400×）Fig. 4 Effects of Bama longevity characteristic dietary patterns on brain hippocampal area of mice in each group (400 ×)

本實驗在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化了飲食模式，并對抗衰老效果進(jìn)行驗證。結(jié)果顯示優(yōu)食I、II均能有效增強(qiáng)年輕小鼠及自然衰老小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和抗氧化能力。雌雄小鼠僅衰老優(yōu)食II組雌雄小鼠之間最終體質(zhì)量存在顯著性差異，其余指標(biāo)雌雄之間差異均不顯著；其中，定位航行實驗表明，優(yōu)食I改善雌鼠與雄鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較好；空間探索實驗表明，在雌鼠分組中，優(yōu)食I改善年輕雌鼠與衰老雌鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的效果較好，在雄鼠分組中，優(yōu)食I、II均改善了年輕雄鼠與衰老雄鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，但各飲食干預(yù)組間改善效果差異不大；腦組織SOD活力、GSH-Px活力、MDA含量的綜合測定結(jié)果表明，優(yōu)食I對雌鼠和雄鼠的抗衰老效果均較好；優(yōu)食I、II對年輕小鼠海馬CA1區(qū)均有一定的保護(hù)作用，優(yōu)食I對衰老小鼠海馬CA1區(qū)保護(hù)效果更好。綜合實驗結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)食I改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與抗衰老的效果略優(yōu)于優(yōu)食II，初步表明巴馬長壽飲食模式具有良好的借鑒潛力和進(jìn)一步推廣的價值。

3 結(jié) 論

本實驗從探索巴馬長壽特征飲食的抗衰老效果出發(fā)，設(shè)計了兩種優(yōu)化的巴馬長壽飲食模式，并采用年輕小鼠和自然衰老小鼠進(jìn)行驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巴馬長壽特征飲食能夠顯著延緩衰老小鼠體質(zhì)量的下降趨勢，有效縮短年輕小鼠與衰老小鼠逃避潛伏期、提高穿越平臺次數(shù)、延長目標(biāo)象限停留時間及目標(biāo)象限路程。顯著提高年輕小鼠與衰老小鼠的腦組織SOD活力和GSH-Px活力，降低MDA含量，并改善腦組織海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞變性、凋亡的現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，優(yōu)化的巴馬長壽飲食模式對年輕小鼠及衰老小鼠均具有明顯的抗衰老效果。巴馬飲食模式對雌雄小鼠的影響趨勢基本一致，且優(yōu)食I對增強(qiáng)雌鼠與雄鼠的學(xué)習(xí)記憶能力、改善抗氧化效果較好。初步發(fā)現(xiàn)巴馬長壽特征飲食模式對衰老小鼠的抗衰老調(diào)節(jié)效果強(qiáng)于年輕小鼠。

總體而言，優(yōu)食I、II對增強(qiáng)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和預(yù)防腦組織損傷都發(fā)揮了較為顯著的效果，其中優(yōu)食I的效果略優(yōu)于優(yōu)食II，這將為巴馬長壽特征飲食走向成熟和實用提供重要的支撐。