桉葉多酚提取物體內(nèi)外抗氧化活性評(píng)價(jià)

李 偉，葉嘉宜，陳運(yùn)嬌，曹 庸

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)和氧化物質(zhì)呈動(dòng)態(tài)平衡；當(dāng)機(jī)體受到氧化應(yīng)激后，細(xì)胞在新陳代謝的過程中會(huì)產(chǎn)生過量自由基，引起機(jī)體損傷。自由基與炎癥、衰老等多種疾病模型密切相關(guān)[1]。多酚作為植物體內(nèi)重要的次生代謝產(chǎn)物，能有效清除自由基[2]；此外，植物多酚被證實(shí)能有效預(yù)防高血脂、心腦血管等疾病[3]，還能降低癌癥等患病風(fēng)險(xiǎn)[4]，因而逐漸受到人們的重視。

桉樹是桃金娘科桉屬植物的統(tǒng)稱，原產(chǎn)于澳大利亞，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[5]；我國桉樹人工種植林主要分布在廣東、廣西、云南、四川、海南等省。作為桉樹副產(chǎn)物，桉葉年產(chǎn)量大但利用率低，除了部分用于提取精油，大部分被廢棄或焚燒。有研究指出桉葉中含有?；宇惣捌溲苌?、黃酮類化合物、鞣質(zhì)、三萜類及其苷類以及部分未知高活性化合物[6]，具有抗氧化、抗炎、抗菌等多種生物活性[7-8]。基于桉葉多酚提取物資源廣泛且活性顯著，日本已將其應(yīng)用于食品添加劑和化妝品中[9]。本實(shí)驗(yàn)室前期已鑒定出桉葉多酚提取物中重要的抗氧化活性物質(zhì)，包括月見草素B、1,2,3,4,6-五沒食子酰基葡萄糖及特里馬素等[10]；桉葉多酚提取物在體外具有良好清除自由基能力[11]，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也表明其能有效提高血清中抗氧化酶[12]。桉葉多酚提取物中多酚類物質(zhì)和月見草素B含量對(duì)抗氧化能力至關(guān)重要，這一推測與Amakura等[13]研究一致。因此，對(duì)桉葉多酚提取物進(jìn)行分離純化，提高粗提物中多酚類物質(zhì)及月見草素B含量對(duì)改善其抗氧化活性具有重要意義。然而，現(xiàn)有報(bào)道多是采用單一方法對(duì)桉葉多酚提取物進(jìn)行功效評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)方法不系統(tǒng)且沒有純化后桉葉多酚的活性研究。為了系統(tǒng)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的化學(xué)評(píng)價(jià)方法，并建立氧化損傷RAW264.7巨噬細(xì)胞模型，結(jié)合秀麗隱桿線蟲（以下簡稱線蟲）模型，全面評(píng)價(jià)純化后桉葉多酚抗氧化能力，為桉葉多酚提取物開發(fā)成功能性食品或食品抗氧化劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

野生型秀麗隱桿線蟲品系（基因型N2）購于美國明尼蘇達(dá)大學(xué)線蟲種質(zhì)中心。

桉葉采集于廣東省茂名市寶圩鎮(zhèn)；RAW264.7巨噬細(xì)胞購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫。

DMEM 高糖培養(yǎng)基美國Hyclone 公司；胎牛血清、雙抗（青霉素和鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）美國Gibco公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、抗壞血酸及H2O2美國Sigma公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）及過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL401電子天平瑞士Mettler Toledo公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康技術(shù)公司；LC-15C高效液相色譜儀日本島津公司；SMZ-T4連續(xù)變倍體視顯微鏡重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；SWCJ-A超凈工作臺(tái)上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；EnSpire酶標(biāo)儀美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 桉葉多酚提取物制備及純化

準(zhǔn)確稱取100 g桉葉粉末，以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液為提取溶劑，按料液比1∶7（m/V）在50 ℃條件下攪拌提取2 h，提取2 次。將兩次提取液合并后濃縮，真空冷凍干燥成粉，得桉葉多酚提取物。再將得到的桉葉提取物配制成200 mg/mL，4 ℃下冷藏8 h，除去下層沉淀；再以乙醇-乙酸乙酯體系（2∶98，V/V）萃取5 次，保留下層液；再以乙醇-乙酸乙酯（30∶70，V/V）萃取5 次后，將上清液濃縮干燥后可得純化后的桉葉多酚提取物（以福林-酚法測定總多酚含量，高效液相色譜法[7]檢測多酚組成）。參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》、GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》、GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》分別檢測純化后桉葉多酚提取物粗蛋白、粗脂肪及灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 桉葉多酚提取物體外抗氧化活性測定

1.3.2.1 DPPH自由基清除能力測定

參考Kumaran等[14]的方法，評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物DPPH自由基清除率。將桉葉多酚提取物配成不同質(zhì)量濃度（0.025～0.4 mg/mL）儲(chǔ)備液。取0.2 mL不同質(zhì)量濃度桉葉多酚提取物溶液和3.8 mL DPPH溶液（1×104mol/L）混勻，暗處反應(yīng)30 min；以空白溶劑作參照，以抗壞血酸為陽性對(duì)照，在517 nm波長處測定吸光度，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。DPPH自由基清除率按公式（1）計(jì)算。

式中：A1為0.2 mL樣品溶液+3.8 mL DPPH溶液的吸光度；A2為0.2 mL樣品溶液+3.8 mL空白溶劑的吸光度；A0為0.2 mL空白溶劑+3.8 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.2.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

參照王俊亮等[11]方法，評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除率。準(zhǔn)備ABTS儲(chǔ)備液，再配成ABTS工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用，734 nm波長處吸光度為0.70±0.02。取不同質(zhì)量濃度桉葉多酚提取物10 μL到96 孔板，再加200 μL ABTS工作液，振蕩混勻10 s，避光反應(yīng)10 min；以空白溶劑作參照、抗壞血酸為陽性對(duì)照，在405 nm波長處測定吸光度，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。ABTS陽離子自由基清除率按公式（2）計(jì)算。

式中：A1為10 μL樣品溶液+200 μL ABTS工作液的吸光度；A0為10 μL空白溶劑+200 μL ABTS工作液的吸光度。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除能力測定

參考Giese等[15]方法，評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物超氧陰離子自由基清除率。反應(yīng)體系包括1 mL不同質(zhì)量濃度（0.025～0.4 mg/mL）桉葉多酚提取物儲(chǔ)備液、4.5 mL Tris-HCl（0.1 mol/L、25 ℃）及1 mL鄰苯三酚（3 mmol/L、25 ℃），混勻后反應(yīng)4 min；加入0.5 mL HCl（8 mol/L）終止反應(yīng)，在320 nm波長處測定吸光度A1；以去離子水代替樣品在320 nm波長處測定吸光度A3；以去離子水代替鄰苯三酚在320 nm波長處測定吸光度A2；以抗壞血酸為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品3 個(gè)平行。超氧陰離子自由基清除率按公式（3）計(jì)算。

1.3.2.4 總還原能力測定

參考Shon等[16]方法，評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物還原能力。反應(yīng)體系包括2.5 mL不同質(zhì)量濃度（0.025～0.4 mg/mL）桉葉多酚提取物溶液和2.5 mL鐵氰化鉀（質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%），50 ℃下反應(yīng)20 min，再加入2.5 mL三氯乙酸（10%）?；靹蚝箅x心（3 000 r/min、10 min），取5 mL上清液、5 mL蒸餾水及1 mL三氯化鐵（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%），混勻后在700 nm波長處測定吸光度。吸光度越大表明還原能力越強(qiáng)。

1.3.3 桉葉多酚提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

1.3.3.1 MTT法檢測桉葉多酚提取物對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響

RAW264.7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、5%雙抗及DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基配成的完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將處于生長對(duì)數(shù)期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種在96 孔板中，每孔200 μL（1×104個(gè)/孔），孵育24 h。去除上清液，以不同質(zhì)量濃度桉葉多酚提取物處理細(xì)胞24 h。再將20 μL 5 mg/mL MTT溶液培養(yǎng)細(xì)胞4 h。去除上清液后以PBS洗3 次細(xì)胞，最后加入150 mL DMSO，振蕩溶解10 min，在570 nm波長處測定吸光度。以DMSO為空白對(duì)照，以正常細(xì)胞為對(duì)照，細(xì)胞活性按公式（4）計(jì)算。

式中：A0為空白吸光度；A1為樣品吸光度；A2為對(duì)照吸光度。

1.3.3.2 MTT法檢測桉葉多酚提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞活性的影響

將處于生長對(duì)數(shù)期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種在96 孔板中，每孔200 μL（1×104個(gè)/孔），孵育24 h。將實(shí)驗(yàn)分成5 個(gè)處理組：對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基，模型組加入終濃度為400 μmol/L H2O2，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以不同質(zhì)量濃度桉葉多酚提取物（低、中、高劑量組分別為12.5、25、50 μg/mL）預(yù)處理24 h后再加入H2O2（終濃度為400 μmol/L）誘導(dǎo)損傷。損傷24 h，再將20 μL 5 mg/mL MTT溶液培養(yǎng)細(xì)胞4 h。去除上清液后以PBS洗滌3 次細(xì)胞，最后加入150 mL DMSO，振蕩溶解10 min，在570 nm波長處測定吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算公式同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3 氧化損傷細(xì)胞中MDA和GSH含量、T-SOD和CAT活力的測定

將處于生長對(duì)數(shù)期的RAW264.7巨噬細(xì)胞接種在6 孔板中，每孔2 mL（20×104個(gè)/孔），孵育24 h。將實(shí)驗(yàn)分成6 個(gè)處理組：對(duì)照組加入完全培養(yǎng)基；模型組加入終濃度為400 μmol/L的H2O2；陽性對(duì)照組以25 μg/mL抗壞血酸預(yù)處理24 h后再加入H2O2（終濃度為400 μmol/L）誘導(dǎo)損傷；實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞以不同濃度桉葉多酚提取物（低、中、高劑量組分別為12.5、25、50 μg/mL）預(yù)處理24 h后再加入H2O2（終濃度為400 μmol/L）誘導(dǎo)損傷。損傷處理24 h，去除上清液后以PBS清洗3 遍，收集細(xì)胞。按照試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)MDA和GSH含量、T-SOD和CAT活力。

1.3.4 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲抗氧化能力的影響

1.3.4.1 線蟲培養(yǎng)

以涂有大腸桿菌OP50（E. coliOP50）的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（nematome growth medium，NGM）培養(yǎng)線蟲，培養(yǎng)溫度20 ℃，根據(jù)線蟲生長狀況定期將線蟲轉(zhuǎn)移到新的涂有E. coliOP50NGM培養(yǎng)基中。

1.3.4.2 ROS水平測定

將同期化后的線蟲在樣品培養(yǎng)基中培養(yǎng)96 h，將線蟲轉(zhuǎn)移到NGM 3 次。挑取50 條線蟲轉(zhuǎn)移到含有50 μL PBS的96 孔板（不透光），再加入50 μL 100 μmol/L H2DCF-DA溶液，以不含線蟲的H2DCF-DA溶液作對(duì)照。立即將96 孔板置于酶標(biāo)儀中測定熒光強(qiáng)度：反應(yīng)溫度25 ℃、發(fā)射波長528 nm、激發(fā)波長485 nm，每隔15 min測一次，反應(yīng)12 h，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4.3 線蟲壽命實(shí)驗(yàn)

將同期化后的蟲卵孵育在樣品培養(yǎng)基上，20 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h至L4期幼蟲。挑取L4期幼蟲到新的各組平板上（每組3 個(gè)平板，每個(gè)平板30 條）繼續(xù)培養(yǎng)。線蟲生殖期每天將線蟲轉(zhuǎn)移到新的各組平板中，其他時(shí)期每2 d轉(zhuǎn)移到新的平板中，記錄線蟲生存、死亡及剔除情況，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束（線蟲存活天數(shù)從卵孵化第1天算起）。線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)：用鉑絲輕觸蟲體無反應(yīng)，即視為死亡。線蟲剔除標(biāo)準(zhǔn)：逃出培養(yǎng)基而干死的線蟲、蟲卵在體內(nèi)孵化而成袋樣蟲、鉆入瓊脂中線蟲。

1.3.4.4 線蟲體內(nèi)抗氧化能力測定

按照1.3.4.3節(jié)所述，培養(yǎng)96 h后，將各組線蟲轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)基上，再用1 mL PBS（pH 7.2～7.4）洗滌培養(yǎng)皿并分別收集成蟲。在4 000 r/min條件下離心1 min，重復(fù)3 次，保留蟲液用于勻漿。再用組織破碎儀（60 Hz、30 s）在冰浴條件下將蟲體破碎兩次，勻漿液在10 000×g、4 ℃離心10 min，上清液備用待測。參照試劑盒說明書測定抗氧化能力（MDA含量和GSH-Px、T-SOD、CAT活力）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析并用最小顯著性差異法進(jìn)行多重比較，顯著水平設(shè)置為P＜0.05和P＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉葉多酚提取物制備與純化結(jié)果

圖 1 桉葉多酚提取物純化前后高效液相色譜圖Fig. 1 High performance liquid chromatograms of PEPE before and after purification

由圖1 可知，相對(duì)于純化前桉葉多酚提取物，純化后桉葉多酚提取物中月見草素B峰面積明顯增大，純化方法起到有效分離作用。經(jīng)計(jì)算，純化前桉葉多酚提取物總多酚含量為（294.36±27.32）mg/g，月見草素B 含量為（94.53±11.0 7）mg/g；純化后，桉葉多酚提取物總多酚含量為（51 3.4 9±41.25）mg/g，其中月見草素B含量為（384.90±34.73）m g/g。純化后桉葉多酚提取物中總多酚和月見草素B含量分別提高74.45%和307.17%。進(jìn)一步對(duì)純化后桉葉多酚進(jìn)行營養(yǎng)成分檢測，可得粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（2.25±0.46）%、（1.37±0.24）%、（0.97±0.39）%，以純化后桉葉多酚開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 桉葉多酚提取物體外抗氧化活性

圖 2 桉葉多酚提取物體外抗氧化能力Fig. 2 Antioxidant activity in vitro of PEPE

由圖2A可知，桉葉多酚提取物和抗壞血酸的DPPH自由基清除率隨著質(zhì)量濃度增大呈劑量依賴性增大；桉葉多酚提取物和抗壞血酸半抑制質(zhì)量濃度（50%inhibiting concentration，IC50）分別為0.06 mg/mL和0.021 mg/mL。當(dāng)桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，最大清除率為（93.09±5.38）%，這也說明桉葉多酚提取物在一定質(zhì)量濃度時(shí)具有良好的DPPH自由基清除能力，此時(shí)與抗壞血酸無明顯差異。桉葉多酚提取物的清除機(jī)理可能是多酚中具有多種供氫體，能將DPPH自由基還原成黃色的DPPH—H；隨著桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度增高，供氫能力增強(qiáng)，表現(xiàn)出高效的DPPH自由基清除率和更低的IC50。這種推測與范金波等[17]研究結(jié)論一致，該研究指出咖啡酸具有良好供氫能力，能有效清除DPPH自由基。

由圖2B可知，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，桉葉多酚提取物和抗壞血酸ABTS陽離子自由基清除能力逐漸增強(qiáng)；其中抗壞血酸大于0.1 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到平穩(wěn)期，IC50為0.016 mg/mL，而桉葉多酚提取物IC50為0.052 mg/mL。清除ABTS陽離子自由基的原理與清除DPPH自由基不同，主要是電子轉(zhuǎn)移的過程；ABTS也更容易反應(yīng)，因?yàn)樗扔H水也親脂。本實(shí)驗(yàn)中桉葉多酚提取物表現(xiàn)出良好的ABTS陽離子自由基清除能力，與其供電子能力強(qiáng)有關(guān)；前期研究也表明不同月份桉葉多酚提取物能有效清除ABTS陽離子自由基[18]。

由圖2C可知，本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自氧化法測定桉葉多酚提取物超氧陰離子自由基清除能力，清除效果呈量效關(guān)系，多酚含量越高，清除能力越強(qiáng)；桉葉多酚提取物IC50為0.056 mg/mL，而抗壞血酸為0.025 mg/mL。當(dāng)桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL，清除超氧陰離子自由基能力與抗壞血酸無明顯差異。超氧陰離子自由基是線粒體呼吸鏈過程中產(chǎn)生的，它能與金屬離子發(fā)生Fenton反應(yīng)，生成羥自由基，進(jìn)而造成細(xì)胞損傷；中和過量的超氧陰離子自由基有利于提高線粒體抗氧化能力[19]?？傊袢~多酚提取物達(dá)到一定質(zhì)量濃度時(shí)，具有良好的清除超氧陰離子自由基能力。

多酚能使反應(yīng)體系中Fe3+還原成Fe2+，溶液由黃色變成不同程度的藍(lán)色[20]；還原能力越強(qiáng)，吸光度越大。由圖2D可知，隨著樣品質(zhì)量濃度增大，桉葉多酚提取物和抗壞血酸吸光度逐漸增大，表現(xiàn)出良好還原能力。還原能力可延緩或終止自由基反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示桉葉多酚提取物的優(yōu)異抗氧化活性，多酚質(zhì)量濃度越高還原能力越強(qiáng)。

桉葉多酚是一種具有良好抗氧化活性的天然活性多酚，前期研究指出桉葉多酚提取物能有效清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基，提高鐵離子還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力[21]。王俊亮等[11]指出多酚類物質(zhì)是桉葉提取物中主要抗氧化成分，桉葉多酚比相同質(zhì)量濃度下茶葉粗提物具有更好的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)通過溶劑萃取方法對(duì)桉葉多酚提取物進(jìn)行分離純化，得到多酚含量較高的桉葉多酚提取物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，純化后的桉葉多酚提取物具有更高的DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、超氧陰離子自由基清除能力及鐵離子還原能力。然而僅僅采用體外抗氧化評(píng)價(jià)方法是不全面的，需要系統(tǒng)研究桉葉多酚提取物的抗氧化能力，因此進(jìn)一步開展桉葉多酚提取物對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的影響。

2.3 桉葉多酚提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.3.1 桉葉多酚提取物對(duì)細(xì)胞活性的影響

圖 3 桉葉多酚提取物對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響Fig. 3 Effect of PEPE on the viability of RAW264.7 cells

采用MTT法分析桉葉多酚提取物對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的影響。由圖3可見，相比于對(duì)照組，當(dāng)桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度在12.5～100 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性均高于90%，且在12.5～50 μg/mL范圍內(nèi)具有一定促進(jìn)細(xì)胞增殖的效果；當(dāng)桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度在200～800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞活性受到顯著抑制（P＜0.05）。因此選擇12.5、25、50 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度。

2.3.2 桉葉多酚提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化損傷細(xì)胞活性的影響

圖 4 桉葉多酚提取物對(duì)氧化損傷RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響Fig. 4 Effect of PEPE on the viability of RAW264.7 cells with H2O2-induced damage

基于本實(shí)驗(yàn)室前期研究，以400 μmol/L H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷。由圖4可見，模型組細(xì)胞存活率極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01），此時(shí)細(xì)胞活性為（51.67±9.77）%，說明造模成功。此外，桉葉多酚提取物處理組細(xì)胞活性隨質(zhì)量濃度增大呈上升趨勢，其中25 μg/mL和50 μg/mL桉葉多酚提取物組細(xì)胞活性分別顯著高于模型組27.94%和37.66%（P＜0.05，P＜0.01）；這說明桉葉多酚提取物具有良好的抗氧化效果，能減輕細(xì)胞氧化損傷，有效保護(hù)細(xì)胞。

2.3.3 桉葉多酚提取物對(duì)細(xì)胞抗氧化能力的影響

圖 5 桉葉多酚提取物對(duì)氧化損傷細(xì)胞抗氧化能力的影響Fig. 5 Protective effect of PEPE on oxidative damage in cells

以T-SOD、CAT活力、GSH及MDA水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究桉葉多酚提取物對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)包括酶類（T-SOD、GSH-Px、CAT等）和非酶物質(zhì)（GSH等），它們?cè)诩?xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)能有效清除過量的自由基，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[22]。而MDA作為脂質(zhì)氧化產(chǎn)物之一，直接反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度。由圖5可知，相比于對(duì)照組，模型組細(xì)胞中T-SOD、CAT活力及GSH含量極顯著降低（P＜0.01），而MDA含量極顯著升高（P＜0.01）。這說明細(xì)胞在受到外源性H2O2刺激后，細(xì)胞通過Fenton反應(yīng)等方式產(chǎn)生過量的高活性自由基（羥自由基、單線態(tài)氧等）造成細(xì)胞氧化損傷[23]。由圖5A、B可知，相比于模型組，50 μg/mL桉葉多酚提取物能顯著提高細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性（P＜0.05）；且桉葉多酚提取物中高劑量組均能極顯著提高CAT活力（P＜0.01），其中50 μg/mL桉葉多酚提取物組細(xì)胞CAT活力與抗壞血酸組接近，說明桉葉多酚提取物通過提高抗氧化酶活性，有效改善H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的氧化損傷。相似研究指出金銀花黃酮能顯著提高H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞及上清液的T-SOD及CAT活力[24]，這與其調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原系統(tǒng)有關(guān)；金銀花黃酮能清除過量自由基及有害物質(zhì)，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定。此外，圖5C也表明桉葉多酚提取物中、高劑量組極顯著提高細(xì)胞內(nèi)GSH含量（P＜0.01），呈量效關(guān)系。GSH作為細(xì)胞內(nèi)重要的非酶抗氧化物質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)能有效清除超氧陰離子、H2O2等。桉葉多酚提取物通過提高GSH含量的方式一定程度上清除產(chǎn)生的自由基和有害物質(zhì)，緩解細(xì)胞的氧化損傷，這與宋家樂等[25]報(bào)道結(jié)果一致。MDA作為細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化的副產(chǎn)物，常用作評(píng)價(jià)細(xì)胞氧化損傷程度。本實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)桉葉多酚提取物呈質(zhì)量濃度依賴性降低氧化損傷細(xì)胞中MDA含量，最高降低51.84%?？傮w來說，桉葉多酚提取物能有效提高氧化損傷細(xì)胞中T-SOD、CAT活力及GSH含量，降低MDA含量，起到清除自由基以保護(hù)氧化損傷細(xì)胞的作用。

H2O2是誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷常用的一種化學(xué)物質(zhì)，能較好地模擬自由基誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，桉葉多酚提取物能有效改善H2O2誘導(dǎo)氧化損傷RAW264.7巨噬細(xì)胞的活性，這與其抗氧化能力有關(guān)，具體表現(xiàn)在桉葉多酚提取物能顯著提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)含量，降低MDA含量。相似研究指出小葉薄荷黃酮提取物可降低MDA和乳酸脫氫酶水平，提高SOD、GSH-Px、CAT活性，減輕H2O2誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞氧化損傷[26]。氧化應(yīng)激常常與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生有關(guān)，而ROS包括超氧陰離子自由基、H2O2及其下游過氧化物等，細(xì)胞內(nèi)過量的ROS會(huì)加劇氧化損傷[27]。Wang Xu等[28]的報(bào)道支持這個(gè)理論，發(fā)現(xiàn)氧化損傷后的RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著提高，而蝦青素能有效降低氧化損傷細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，通過提高SOD活性和降低MDA含量的方式提高細(xì)胞抗氧化狀態(tài)，達(dá)到保護(hù)氧化損傷細(xì)胞的作用。桉葉多酚提取物作為一種富含多酚類物質(zhì)的提取物，同樣能起到有效減輕細(xì)胞氧化損傷的作用，這可能與其多種活性成分的綜合藥理效應(yīng)有關(guān)[29]。雖然桉葉多酚在化學(xué)和細(xì)胞抗氧化中表現(xiàn)出良好的抗氧化能力，但其在生物體內(nèi)是能否起到相當(dāng)?shù)目寡趸饔萌孕枰C實(shí)。多酚類物質(zhì)在體內(nèi)的吸收和代謝、聚合程度等都影響其在體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[30]，因此，對(duì)桉葉多酚提取物體內(nèi)抗氧化活性評(píng)價(jià)是必要的。

2.4 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲抗氧化能力的影響

2.4.1 桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度篩選

圖 6 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲體內(nèi)ROS水平的影響Fig. 6 Effect of PEPE treatment on reactive oxygen species accumulation in C. elegans

探究桉葉多酚提取物在常規(guī)培養(yǎng)及氧化損傷條件下對(duì)線蟲體內(nèi)ROS積累量的影響。ROS作為細(xì)胞新陳代謝過程中的產(chǎn)物，能引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)氧化等[31]。本實(shí)驗(yàn)首先以不同質(zhì)量濃度（25～200 μg/mL）桉葉多酚提取物培養(yǎng)線蟲96 h，通過熒光探針檢測線蟲體內(nèi)ROS積累量。圖6A表明，隨著桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度增大，線蟲體內(nèi)ROS積累量逐漸降低；相比于對(duì)照組，當(dāng)桉葉多酚提取物質(zhì)量濃度為100 μg/mL和200 μg/mL時(shí)，ROS積累量分別下降24.61%和30.48%（P＜0.05）。此時(shí)，兩個(gè)質(zhì)量濃度桉葉多酚提取物組間無顯著差異（P＞0.05），因此選用100 μg/mL開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了進(jìn)一步研究桉葉多酚提取物在線蟲氧化應(yīng)激狀態(tài)下是否起作用，實(shí)驗(yàn)將同期化后的線蟲（100 μg/mL桉葉多酚提取物培養(yǎng)96 h）在1 mmol/L H2O2下刺激24 h，測定線蟲體內(nèi)ROS積累量。如圖6B所示，H2O2處理組線蟲ROS積累量極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），說明H2O2處理后線蟲發(fā)生氧化損傷；而桉葉多酚提取物處理后的線蟲體內(nèi)ROS積累量極顯著下降29.97%。綜上，100 μg/mL桉葉多酚提取物能有效降低線蟲體內(nèi)ROS積累，起到保護(hù)線蟲的作用。

2.4.2 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲壽命的影響

以100 μg/mL桉葉多酚提取物培養(yǎng)線蟲，評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物對(duì)線蟲壽命的影響。由圖7可知，相比于對(duì)照組，桉葉多酚提取物組線蟲生存曲線發(fā)生高度顯著右移（P＜0.01），說明桉葉多酚提取物處理后線蟲整體壽命高于對(duì)照組。表1顯示桉葉多酚提取物組線蟲最長壽命和中位壽命均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），分別提高14.12%和14.03%。推測桉葉多酚提取物良好的抗氧化活性間接起到延長線蟲壽命的作用，這種推測與Luo Siyuan等[32]研究一致，其發(fā)現(xiàn)橄欖葉提取物能提高線蟲壽命，線蟲體內(nèi)抗氧化酶及基因均顯著提高。總之，桉葉多酚提取物能有效延長線蟲壽命，這可能與其良好的抗氧化活性有關(guān)。

圖 7 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲壽命的影響Fig. 7 Effect of PEPE on the lifespan of C. elegans

表 1 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲壽命的影響（n＝60）Table 1 Effect of PEPE on the lifespan of C. elegans (n= 60)

2.4.3 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲抗氧化能力的影響

圖 8 桉葉多酚提取物對(duì)線蟲抗氧化能力的影響Fig. 8 Effect of PEPE on the antioxidant capacity of C. elegans

為了進(jìn)一步驗(yàn)證桉葉多酚提取物抗氧化作用與延長線蟲壽命有關(guān)，實(shí)驗(yàn)測定桉葉多酚提取物處理后線蟲體內(nèi)抗氧化指標(biāo)。由圖8可知，相比于對(duì)照組，桉葉多酚提取物組線蟲體內(nèi)T-SOD和GSH-Px活力分別顯著提高28.64%和32.45%（P＜0.05），MDA含量下降21.48%（P＜0.05）。這說明桉葉多酚提取物能有效提高線蟲抗氧化能力，降低新陳代謝過程中產(chǎn)生的自由基含量，起到延長線蟲壽命的作用。相似研究也指出鼠尾草酚能顯著提高線蟲抗氧化能力，實(shí)現(xiàn)提高線蟲壽命的作用[33]。綜上，桉葉多酚提取物能顯著提高線蟲抗氧化能力。

本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲評(píng)價(jià)桉葉多酚提取物抗氧化活性評(píng)價(jià)，該模型具有穩(wěn)定性好、周期短、費(fèi)用低等特點(diǎn)。線蟲60%～80%基因與人類相應(yīng)基因具有同源性，特別地，線蟲體內(nèi)存在的抗氧化酶與人體相似（SOD和CAT），也含有谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶基因等[34-35]。在本實(shí)驗(yàn)中，桉葉多酚提取物能降低常規(guī)和應(yīng)激條件下線蟲體內(nèi)的ROS積累量，表現(xiàn)出良好的抗氧化潛力。過量的ROS會(huì)引起線蟲氧化損傷（蛋白質(zhì)損傷、脂質(zhì)氧化、DNA受損等），進(jìn)而造成壽命縮短。這也說明桉葉多酚提取物可能提高了線蟲的耐受能力而延長線蟲壽命。有研究指出長壽型的突變體線蟲往往具有較高抵抗應(yīng)激的能力，從而延長線蟲壽命[36]。壽命實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)桉葉多酚提取物能顯著提高線蟲最長壽命和中位壽命，這可能與其降低線蟲生長過程中ROS的積累有關(guān)。此外，桉葉多酚提取物能顯著提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活力，降低MDA含量，推測這是其降低線蟲體內(nèi)ROS水平及延長壽命的部分原因。相似研究也指出紫薯提取物顯著提高線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力（SOD、CAT）是延長線蟲壽命的作用機(jī)制之一[37]。總體而言，桉葉多酚提取物體外抗氧化作用與線蟲體內(nèi)的結(jié)果一致，更能準(zhǔn)確反映其在生物體內(nèi)的抗氧化效用，為桉葉多酚提取物進(jìn)一步開發(fā)成食品抗氧化劑或功能食品提供參考。

3 結(jié) 論

本研究表明桉葉多酚提取物能有效清除DPPH自由基、ABTS陽離子自由基及超氧陰離子自由基，具有良好還原能力。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指出桉葉多酚提取物提高細(xì)胞內(nèi)T-SOD活力、CAT活力及GSH含量，降低MDA含量，清除細(xì)胞內(nèi)過量自由基和有害物質(zhì)，起到保護(hù)氧化損傷細(xì)胞的作用。此外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)桉葉多酚提取物能降低線蟲體內(nèi)ROS積累，提高抗氧化酶活力（T-SOD、GSH-Px），達(dá)到延長線蟲壽命的效果。本研究仍存在不足之處，如桉葉多酚純度不夠、抗氧化作用機(jī)制研究不深等，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究桉葉多酚中活性成分與生理功能的關(guān)系?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明桉葉多酚提取物具有良好的體內(nèi)外抗氧化效果，具有一定的研究價(jià)值。