孟志娟，黃云霞，李 巖，孫文毅，王 東，李 強(qiáng)，范素芳，張 巖

（河北省食品檢驗研究院 河北省食品安全重點實驗室，河北 石家莊 050091）

近年來，由于塑料制品普遍應(yīng)用于食品包裝、玩具、化妝品和醫(yī)療等很多材料中，鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs）大量進(jìn)入水體、土壤和生物體中，已成為全球最普遍的有機(jī)污染物之一。PAEs是一種常用的增塑劑和軟化劑，可增大產(chǎn)品的柔韌性、可塑性和耐用性，廣泛用于生產(chǎn)和生活用品中。PAEs會遷移出包裝并污染與之接觸的食品進(jìn)而進(jìn)入人體，存在很多風(fēng)險和安全隱患。PAEs在人體內(nèi)的殘留將嚴(yán)重地影響到人類的生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，使生物體內(nèi)激素不能正常分泌，肝腎功能下降，導(dǎo)致細(xì)胞突變、致畸和致癌等危害[1-3]。目前全球已有很多國家通過立法限制使用PAEs，包括歐盟《關(guān)于化學(xué)品注冊、評估、許可和限制的法規(guī)》和美國《消費品安全改進(jìn)法》等。我國衛(wèi)生部在2011年6月發(fā)布的緊急公告中已將PAEs類物質(zhì)列入食品中易濫用的非食用物質(zhì)和違法添加劑名單。PAEs具有親脂性，在原料引入、加工生產(chǎn)、包裝貯運和銷售等過程中極易從包裝材料中遷移，當(dāng)接觸到水、油脂等物質(zhì)時極易溶出，從而擴(kuò)散到環(huán)境或食物中[4-5]。我國市場上絕大多數(shù)食用植物油采用塑料桶包裝，PAEs很容易溶解遷移到植物油中，這也是PAEs超標(biāo)的重要成因，已有相關(guān)文獻(xiàn)報道食用植物油中PAEs的超標(biāo)率達(dá)20.8%[6]，因此建立能同時檢測多種PAEs殘留的高通量篩查方法顯得尤為重要。

植物油中脂肪類化合物容易和目標(biāo)物PAEs共萃取，從而影響PAEs的準(zhǔn)確定性定量分析。植物油中PAEs常用的前處理方法是固相萃取[7-9]和凝膠滲透色譜[10-11]提取。但這兩種方法存在耗時長、操作繁瑣和有機(jī)溶劑使用量大等不足，無法實現(xiàn)植物油中PAEs高效快速的檢測。分散固相萃取技術(shù)的原理與固相萃取類似，但其具備溶劑消耗量更少、選擇性更強(qiáng)、凈化效果更好等特點[12-13]。目前檢測方法主要是氣相色譜法[14]、高效液相色譜法[15-16]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-21]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[22-24]。由于植物油基質(zhì)復(fù)雜、干擾性大，用普通質(zhì)譜分析存在局限性，易出現(xiàn)假陽性造成誤判。氣相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（gas chromatography-electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry，Orbitrap GCMS）具有高分辨率和高靈敏度的特點，同時測定化合物不受數(shù)量限制，可采集更為全面的化合物信息，能對復(fù)雜基質(zhì)的低含量水平目標(biāo)化合物進(jìn)行快速準(zhǔn)確篩查和定量分析。高分辨率可更好地分離目標(biāo)化合物和干擾雜質(zhì)；高質(zhì)量精度可提供可靠、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)；高靈敏度則保證了低濃度化合物的有效檢出。因此，面對化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相似，具有相同碎片離子且基質(zhì)復(fù)雜的17 種PAEs，對其進(jìn)行痕量分析，選擇Orbitrap GC-MS方法顯得更為穩(wěn)定、方便、可靠。目前Orbitrap GC-MS技術(shù)已經(jīng)用于制藥研究[25]、環(huán)境分析[26]和水果蔬菜農(nóng)藥殘留[27]中，而采用Orbitrap GC-MS測定植物油中PAEs研究鮮見報道。

本研究以植物食用油中17 種常見的PAEs為檢測目標(biāo)，采用乙腈提取，冷凍除脂和分散固相萃取凈化，結(jié)合Orbitrap GC-MS技術(shù)，通過全掃描得到化合物的精確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合保留時間，建立了一種快速、準(zhǔn)確地測定植物油中PAEs類塑化劑的方法，大大地提高了復(fù)雜背景下的抗干擾能力，使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，同時對實際樣品進(jìn)行驗證取得了滿意的結(jié)果。該方法具有檢測速度快、通量高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點，為國家監(jiān)管提供了科學(xué)依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用大豆油、花生油、橄欖油、菜籽油、芝麻油、葵花籽油樣品共6 類均購于當(dāng)?shù)爻校孛芊獗４?，備用?/p>

乙腈、二氯甲烷、正己烷（均為色譜純） 德國Merck公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（ostadecylsilane，C18）、石墨化碳（graphitized carbon black，GCB） 美國Agilent公司。

17 種標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液）：鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二烯丙酯（diallyl phthalate，DAP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DIBP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（dibutyl phthalate，DBP）、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯（dimethylglycol phthalate，DMEP）、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯（bis(4-methyl-2-pentyl)phthalate，BMPP）、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯（bis(2-ethoxyethyl) phthalate，DEEP）、鄰苯二甲酸二戊酯（dipentyl phthalate，DPP）、鄰苯二甲酸二己酯（di-n-hexyl phthalate，DHXP）、鄰苯二甲酸丁基芐基酯（butyl benzyl phthalate，BBP）、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯（bis(2-butoxyethyl)phthalate，DBEP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（dicyclohexyl phthalate，DCHP）、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯（bis(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP）、鄰苯二甲酸二苯酯（diphenyl phthalate，DPhP）、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DNOP）、鄰苯二甲酸二壬酯（dinonyl phthalate，DNP）德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo ScientificTMGC-Orbitrap質(zhì)譜儀 美國Thermo公司；DB-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；3K15型高速冷凍離心機(jī)德國Sigma公司；渦旋混合器 德國IKA公司；冰箱中國青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

Agilent HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：260 ℃；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min升溫至220 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min；載氣：氮氣（純度≥99.999%），流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積：1 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電子電離源；電子能量：70 eV；離子源溫度：280 ℃；傳輸線溫度：300 ℃；采集模式：全掃描；質(zhì)量分辨率：60 000 FWHM（m/z200）；掃描范圍：m/z50～550；賽默飛TraceFinder工作軟件。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用玻璃移液管取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合工作溶液。將標(biāo)準(zhǔn)混合工作液用正己烷溶液稀釋至質(zhì)量濃度為0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，于4 ℃冰箱中保存，待用。

1.3.4 樣品前處理方法

1.3.4.1 試樣處理

準(zhǔn)確稱取植物油試樣2.0 g（精確至0.000 1 g）于15 mL具塞玻璃離心管中，準(zhǔn)確加入2 mL乙腈，渦旋2 min，4 000 r/min離心3 min。重復(fù)提取3 次，合并3 次提取的上清液，將提取液置于-20 ℃冰箱中冷凍30 min。取1 mL提取液至預(yù)先加入100 mg C18粉、100 mg PSA粉的玻璃凈化管中，渦旋1 min，4 000 r/min離心3 min。用微量玻璃注射器取上清液至進(jìn)樣品小瓶中，進(jìn)Orbitrap GC-MS分析。

1.3.4.2 空白實驗

除不加試樣外，均按1.3.4.1節(jié)測定步驟進(jìn)行。樣品檢測過程中不可避免引入PAEs，因此需對實驗過程PAEs空白值進(jìn)行控制和評價。整個處理過程均需在玻璃器皿中進(jìn)行，試劑均采用色譜純，避免塑料制品，防止檢測過程中PAEs的混入，從而使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。

1.3.5 數(shù)據(jù)庫的建立

在優(yōu)化色譜條件下進(jìn)樣，對17 種PAEs化合物進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，獲得相應(yīng)化合物的離子信息。數(shù)據(jù)導(dǎo)入TraceFinder軟件中，建立17 種PAEs化合物的一級精確質(zhì)量數(shù)數(shù)據(jù)庫，見表1。

表 1 17 種PAEs的分子式、保留時間、質(zhì)譜信息Table 1 Molecular formulae, retention times and mass spectrometric parameters of the 17 PAEs

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的選擇

鄰苯二甲酸酯類化合物難溶于水，但溶于大多有機(jī)溶劑。按照1.3.4節(jié)方法，本研究采用二氯甲烷、正己烷、乙腈、正己烷+乙腈進(jìn)行提取，比較不同提取溶劑對17 種PAEs回收率（添加量1.0 mg/kg）的影響。結(jié)果表明，二氯甲烷提取效果較差，回收率最低；脂肪在正己烷中溶解度大，干擾嚴(yán)重；因為乙腈能夠沉降蛋白，具有較好的除脂效果，同時脂肪在乙腈中溶解度低，但仍會有甘油三酯、甘油二酯、脂肪酸等也可以從植物油中同時萃取，給后續(xù)凈化造成影響。用乙腈后再用正己烷萃取乙腈相中的脂肪，發(fā)現(xiàn)PAEs在正己烷中的溶解度增加隨著PAEs碳鏈的增加而增加，導(dǎo)致如DEHP等回收率低，長碳鏈PAEs的損失更嚴(yán)重。因此對于植物油試樣，僅用乙腈提取，而后上清液在-20 ℃冷凍30 min，油脂析出，再取上清液凈化能有效地避免油脂對樣品的干擾，并且樣品中17 種PAEs的加標(biāo)回收率均高于80%。

2.2 凈化條件的選擇

植物油樣品中含有脂肪、多酚化合物和色素等復(fù)雜基質(zhì)，若不凈化將嚴(yán)重干擾測定，同時隨著進(jìn)樣次數(shù)的增加，色譜峰會拖尾且儀器靈敏度會下降，干擾PAEs的測定，因此選擇合適的凈化方式對結(jié)果影響顯著。本實驗通過食用植物油中添加PAEs（1.0 mg/kg）進(jìn)行加標(biāo)回收，對C18、GCB和PSA三種凈化劑進(jìn)行比較。GCB對色素有很好的吸附作用，但同時對PAEs均有一定程度的吸附。C18是一種反向色譜凈化劑，疏水性極強(qiáng)，能夠有效吸附脂肪、脂肪酸和色素等化合物。PSA固相材料作為常用的分散固相萃取凈化劑，可通過弱陰離子交換或極性作用去除植物油中的脂肪酸、有機(jī)酸和極性色素等物質(zhì)。通過對不同比例的C18和PSA進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PSA和C18的用量均在150 mg時能取得較好的凈化效果，基線明顯較低并且基質(zhì)的干擾被有效去除，同時PAEs的回收率在80%～110%之間，因此最終選擇凈化劑為150 mg PSA和150 mg C18。

2.3 本方法與國標(biāo)方法樣品前處理的比較

GB 5009.271—2016《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》方法是SPE凈化-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[28]，國標(biāo)法中樣品用乙腈提取，超聲提取，過SPE凈化柱，氮吹后用正己烷定容上機(jī)。實驗過程需要活化SPE凈化柱，試劑用量多，操作復(fù)雜耗時長，同時過程中容易帶入PAEs造成污染影響結(jié)果。本實驗的測定方法是分散固相萃取凈化和Orbitrap GC-MS聯(lián)用，采用乙腈渦旋提取，冷凍除脂，分散固相萃取凈化，取上清液上機(jī)。本方法分散固相萃取凈化縮短了前處理的時間，Orbitrap GC-MS準(zhǔn)確定性定量達(dá)到高通量檢測的目的，其抗基質(zhì)干擾的能力比單四極桿高，能夠準(zhǔn)確對PAEs定性定量分析，適用于植物油中PAEs快速篩查分析。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

Orbitrap GC-MS高分辨質(zhì)譜與三重四極桿的定量手段不同，本研究采用的Orbitrap GC-MS是在全掃描模式下進(jìn)行質(zhì)譜全掃描，簡化了氣相色譜-質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，節(jié)省了樣品前處理準(zhǔn)備時間，方便快速開展篩查和準(zhǔn)確定量分析，提高了工作效率和準(zhǔn)確度。通過全掃描獲得目標(biāo)化合物的精確質(zhì)量數(shù)，表1中列出17 種PAEs的3 個碎片離子的精確質(zhì)量m/z，能夠精確到小數(shù)點后4 位，能夠有效準(zhǔn)確與干擾物質(zhì)區(qū)分。采用一個作為定量離子，另兩個作為定性離子。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樣品檢測中采用分辨率R=60 000及以上，基質(zhì)干擾顯著降低，篩查準(zhǔn)確度提高，所有待測物目標(biāo)物可以與基質(zhì)中的干擾物明顯區(qū)分，并可以對PAEs快速判斷和準(zhǔn)確定量，提高檢測結(jié)果的可靠性。圖1為17 種PAEs的總離子流色譜圖。

圖 1 17 種PAEs的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of the 17 PAEs

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

表 2 17 種PAEs的線性方程、相關(guān)系數(shù)r、線性范圍、方法檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, linear ranges,LODs and LOQs of the 17 PAEs

采用Orbitrap GC-MS對17 種PAEs進(jìn)行定性定量分析，用正己烷將混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液逐級稀釋，配制一系列的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以色譜峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，相應(yīng)溶液的質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在空白基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，以分析物響應(yīng)約為3 倍噪聲和10 倍噪聲時確定方法的檢出限和定量限。結(jié)果表明，17 種PAEs在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（R2＞0.995 0），檢出限在0.005～0.010 mg/kg范圍內(nèi)，定量限在0.015～0.030 mg/kg范圍內(nèi)，可滿足檢測要求（表2）。

2.5.2 回收率和精密度

本實驗選取大豆油、花生油、橄欖油和菜籽油4 種具有代表性的植物油樣品進(jìn)行加標(biāo)測定實驗，考察該方法的精密度和回收率。按照1.3.4節(jié)的前處理方法，對樣品分別添加高、中、低水平分別為0.03、0.20、0.50 mg/kg的17 種PAEs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在優(yōu)化的條件下進(jìn)行測定，每個添加水平重復(fù)測定6 次，計算其平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見表3。平均回收率為除了DPhP回收率范圍在80.2%～84.2%略偏低以外，其他在85.1%～109.5%之間，RSD為1.2%～9.8%。說明該方法具有較好的回收率和重復(fù)性，可以滿足植物油試樣中17 種PAEs日常監(jiān)測的要求，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表 3 大豆油、花生油、橄欖油和菜籽油4 種基質(zhì)3 個添加水平17 種PAEs的加標(biāo)回收率和RSD（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of the 17 PAEs from soybean oil, peanut oil, olive oil and rapeseed oil samples at three spiked levels (n= 6)

續(xù)表3

2.6 實際樣品的測定結(jié)果

采用本實驗建立方法對50 個批次的植物油樣品（包括大豆油、花生油、橄欖油、菜籽油、芝麻油和葵花籽油）中的17 種PAEs殘留量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：DIBP在10 個批次中有檢出，含量范圍在0.042～0.317 mg/kg之間；DBP在30 個批次的樣品中均有檢出，含量范圍在0.059～0.934 mg/kg之間；DCHP在15 個批次的樣品中均有檢出，含量范圍在0.038～0.417 mg/kg之間，DEHP在30 個批次的樣品中均有檢出，含量范圍在0.032～0.817 mg/kg之間，其他鄰苯二甲酸酯類在所有樣品中未檢出，其中菜籽油和大豆油中PAEs殘留量較多，分析其中原因主要是在生產(chǎn)工藝和運輸過程中不合格容器和包裝材料的使用導(dǎo)致PAEs容易遷移到植物油中。隨后對陽性樣品采用GB 5009.271—2016《食品中鄰苯二甲酸酯的測定》方法測定，該方法中DIBP、DCHP和DEHP的定量限為0.5 mg/kg，DBP定量限為0.3 mg/kg，PAEs測定值低于定量限時無法準(zhǔn)確測定。本實驗所建立的方法具有更低的定量限，能夠測定低水平的PAEs，同時速度快、定性定量更準(zhǔn)確，完全滿足實際樣品篩查的需求。圖2為大豆油基質(zhì)陽性樣品總離子流圖，可以看出樣品基質(zhì)復(fù)雜，從圖中難以判斷所檢出化合物，圖3為標(biāo)準(zhǔn)品和大豆油陽性樣品DBP和DEHP的質(zhì)譜圖。

圖 2 大豆油陽性樣品中PAEs的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of PAEs in positive soybean oil sample

圖 3 標(biāo)準(zhǔn)品和大豆油陽性樣品DBP和DEHP的質(zhì)譜圖Fig. 3 Mass spectra of reference materials and positive soybean oil sample

3 結(jié) 論

本實驗建立分散固相萃取凈化結(jié)合Orbitrap GC-MS分析植物油中17 種PAEs的方法。方法采用分散固相萃取凈化，不需經(jīng)過固相萃取和凝膠色譜凈化等繁瑣步驟，節(jié)約成本和時間，通過保留時間和精確質(zhì)量數(shù)據(jù)庫篩查對目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定性，采用外標(biāo)校準(zhǔn)曲線法定量，實現(xiàn)植物油中17 種PAEs的篩查、確證與定量，并得到了滿意的結(jié)果。本方法除基質(zhì)干擾的能力和凈化效果好，去除假陽性的干擾，準(zhǔn)確度和精密度高，適合于植物油中17 種PAEs的同時快速檢測，為植物油樣品中痕量PAEs的測定提供了重要技術(shù)手段。