周舒揚，張丕奇, 戴肖東，趙曉宇

(黑龍江省科學(xué)院 微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010)

20世紀(jì)60年代，研究人員在革蘭陰性細菌的電子顯微圖像中觀察到球形膜泡，當(dāng)時對它的內(nèi)容物、組成和用途是未知的，被認為是細胞凋亡所產(chǎn)生的細胞碎片[1]。1987年，Johnstone等[2]首次發(fā)現(xiàn)羊網(wǎng)狀細胞分泌的囊泡，并將其命名為外泌體(exosome)。隨著研究領(lǐng)域的不斷擴展，研究人員發(fā)現(xiàn)在諸多生物中均產(chǎn)生類似exosome的囊泡，功能與exosome相似，稱為外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)。因此，OMV也被稱為exosome。2007年，Valadi等[3]首次在OMV中發(fā)現(xiàn)了miRNA和RNA，顯示其可能在細胞間傳遞遺傳信息。為了揭示這一生物學(xué)現(xiàn)象，揭示分子之間相互作用的原理，近年來研究細胞間通訊機制成為研究熱點。細胞間通訊是通過細胞間隙連接、細胞膜表面分子接觸和細胞分泌的化學(xué)物質(zhì)來進行的。除了這些機制外，最近的研究表明，OMV也參與細胞間通訊。研究人員也把注意力轉(zhuǎn)移到OMV的研究上，OMV似乎徹底改變了細胞間通訊的傳統(tǒng)概念。近年來，OMV 在腫瘤、感染性疾病、代謝性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要生物學(xué)作用逐漸成為研究熱點，而細菌OMV研究還處于開始階段。本文綜述近幾年關(guān)于細菌OMV的研究進展，包括OMV及其產(chǎn)生、OMV特定成分以及OMV的功能等，以期為細菌與宿主多種多樣的互作機制研究提供參考。

1 外膜囊泡的發(fā)現(xiàn)

細菌OMV首次被報道發(fā)現(xiàn)于大腸埃希菌(Escherichiacoli)，之后越來越多的革蘭陰性細菌被證明可以產(chǎn)生和分泌OMV，如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)等[4-10]。隨著對炭疽桿菌(Bacillusanthraci)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的深入研究，發(fā)現(xiàn)革蘭陽性菌也可產(chǎn)生OMV[11-13](表1)。

表1 已報道產(chǎn)生OMV的細菌

細菌的OMV是閉合的大小不均的球體粒子，平均直徑10～300 nm。電子顯微鏡(EM)觀察，OMV的產(chǎn)生是由外膜(OM)向外凸起，包裹著周質(zhì)、胞質(zhì)蛋白、DNA和RNA等物質(zhì)，以出芽方式形成的囊泡[14](圖1)。對OMV蛋白質(zhì)組的分析表明，其內(nèi)部含有非母體細胞所具有的蛋白質(zhì)成分，說明OMV不是細胞死亡的產(chǎn)物，因為其含有新合成的蛋白質(zhì)[15]。

圖1 OMV的結(jié)構(gòu)

2 外膜囊泡的產(chǎn)生

根據(jù)各種生化和遺傳研究，科學(xué)家們提出了幾種OMV產(chǎn)生的模型。Burdett等[16]對OMV生物起源的研究表明，肽聚糖(PG)和外膜(OM)之間交聯(lián)的減少觸發(fā)了OMV的形成。由于脂蛋白(Lpp)參與了OM-PG的連鎖反應(yīng)，所以推測可能是由于lpp基因突變引起OMV的形成[17]。脂蛋白(Vfgl)與E.coliAIEC和E.coliK12株中OMV的產(chǎn)生有關(guān)，Vfgl是一種參與合成和降解PG的脂蛋白，在OMV產(chǎn)生過程中，vfgl可能與PG產(chǎn)量的增加有關(guān)，或是參與下調(diào)和維持OM膨壓[18]。隨著OMV數(shù)量的增加，OMV以出芽形式從OM釋放，減輕了PG和胞壁酸在細胞壁合成過程中所施加給OM的壓力。雖然生化研究顯示OMV和OM具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，但胞質(zhì)分子是如何被包裝進入OMV的尚不清楚。

Mashburn等[19]提出，通過磷脂、脂多糖(LPS)和其他特定分子富集在OM上，使得OM的曲率發(fā)生變化從而產(chǎn)生OMV。對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的研究揭示了群體感應(yīng)(quorum sensing)分子PQS(2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolone)插入膜后所帶來的膜曲率變化，從而產(chǎn)生OMV[20]。通過添加螯合劑(EDTA)可以觀察到OMV產(chǎn)量的增加，但是向銅綠假單胞菌添加Mg2+會導(dǎo)致拮抗作用[21]。相反，OM蛋白如OmpA、TolA/B(toll-pal)、YbgF和Lppab，也有助于OMV的生物發(fā)生[22]。此外，高溫脅迫、抗生素等也會增加OMV的產(chǎn)生。

3 細菌外膜囊泡的成分

對OMV成分的分析表明，囊泡含有多種活性因子，這些活性因子包括蛋白黏附素、毒素、酶以及脂多糖(LPS)等非蛋白抗原。純化的OMV與原核細胞和真核細胞相互作用，顯示出毒力因子的傳遞能力。此外，OMV中含有病原體相關(guān)分子模式(MAMPs)和其他外膜成分，這些成分可以影響感染過程和宿主對感染的反應(yīng)。通過密度梯度離心法純化OMV分析其組分，鑒定了OMV的成分信息，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等。

3.1 蛋白質(zhì)

OMV的研究揭示了大量的OM蛋白(OmpA、OmpC和OmpF)、周質(zhì)蛋白(AcrA、堿性磷酸酶)和一系列毒力因子參與了細菌對宿主的黏附和侵染。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，已鑒定3 500多種與OMV相關(guān)的蛋白質(zhì)[23]。當(dāng)細菌在不同的環(huán)境條件下生長時，囊泡的產(chǎn)生速率和OMV的蛋白質(zhì)含量會發(fā)生變化，這暗示特定蛋白質(zhì)有選擇地進入OMV[24]。在粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中，外膜蛋白(OMPs)、孔蛋白(porin)和外膜通道蛋白(TolC)等大量蛋白存在于OM上，而在OMV中未被檢測到。在粘質(zhì)沙雷氏菌中，OMV檢測到外膜蛋白MipA，但在OM中卻沒有檢測到[25]。痢疾桿菌(Dysenterybacillus)通過促進OMV的產(chǎn)生而促進其志賀毒素的分泌[26]。在OMV中導(dǎo)入或排除特定蛋白質(zhì)的機制尚不明確，目前是研究的熱點[27-29]。為引起疾病而選擇性分泌的蛋白質(zhì)，以及為細菌健康而選擇性去除的蛋白質(zhì)之間的區(qū)別，解決這些問題將是解釋各種細菌OMV蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。

3.2 脂質(zhì)

脂質(zhì)是細菌OMV的重要結(jié)構(gòu)成分。Horstman等[30]報道大腸埃希菌OMV以甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂為主要脂質(zhì)，這些脂質(zhì)與OMV的曲度有關(guān)。Chowdhury等[31]在對紫丁香進行質(zhì)譜(MS)分析時發(fā)現(xiàn)磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺是OMV中主要的脂質(zhì)成分。同樣，其他研究也發(fā)現(xiàn)磷脂酰甘油是OMV的主要成分，但也發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺是OM的主要成分。此外，OMV中較高比例的飽和脂肪酸使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。LPS在生物膜中起黏附作用，同時也是OMV的組成部分。與蛋白質(zhì)類似，OMV中只存在少量的親本LPS[32]。

3.3 核酸

外膜囊泡既攜帶腔內(nèi)DNA，也攜帶表面DNA，二者之間的區(qū)別在于用DNA酶處理之后，腔內(nèi) DNA仍然具有抗性。與此同時，從大腸埃希菌、淋球菌(Neisseriagonorrhoeae)、銅綠假單胞菌和流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenza)中發(fā)現(xiàn)了幾種不同形式的腔內(nèi) DNA。除了DNA，OMV還包含miRNA、mRNA和其他非編碼RNA。自首次在動物體內(nèi)OMV中發(fā)現(xiàn)含有RNA以來，人們對使用OMV中RNA作為診斷生物標(biāo)志物的研究產(chǎn)生了極大的興趣。Skog等[33]發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤患者的血清中OMV含有可用于提供診斷信息的特征性突變mRNA(EGFRvIII mRNA)和miRNA。這些核酸的發(fā)現(xiàn)讓研究人員提出了OMV可以在細胞間傳遞遺傳信息的假設(shè)。事實上，Valadi等[33]和Skog等[34]均發(fā)現(xiàn)OMV中含有mRNA，可以在進入宿主細胞后被轉(zhuǎn)移和翻譯。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和其他非編碼RNA在OMV中也有報道[35-36]。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了OMV作為遺傳信息載體和傳遞者的重要性[37-38]，但核酸進入OMV的機制尚不清楚。

4 外膜囊泡的功能

外膜囊泡(OMV)具有介導(dǎo)DNA片段、自溶酶、細胞毒素、毒力因子和多種生物分子轉(zhuǎn)移的特性。OMV的分泌有助于細菌種間和種內(nèi)的信息交流，也加強了與宿主的相互作用。OMV在多種生理和病理功能中發(fā)揮著重要作用。

4.1 OMV免疫調(diào)節(jié)功能

OMV的組成使其成為激活宿主先天和獲得性免疫應(yīng)答通路的重要因子。除了強大的免疫調(diào)節(jié)分子LPS外，囊泡還含有OM孔蛋白和其他重要的先天免疫激活配體?？傊琌MV 成分協(xié)同作用，調(diào)節(jié)宿主的反應(yīng)，既可以促進病原體的清除，也可以增強感染的毒性，或是兩者兼有。此外，OMV的免疫原性可導(dǎo)致保護性黏膜和全身殺菌抗體反應(yīng)，已被用于疫苗開發(fā)。目前所有實驗證據(jù)表明，對OMV的先天免疫反應(yīng)是由細菌相關(guān)分子模式(PAMPs)和對LPS的識別共同作用的結(jié)果。囊泡中的脂蛋白和OM蛋白是一種生物活性分子，可以激活免疫細胞并誘導(dǎo)白細胞遷移[39]。

OMV中最豐富、最有效的免疫刺激成分是脂多糖(LPS)。LPS可激活巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等引起炎癥因子的釋放，導(dǎo)致宿主的損傷乃至敗血癥休克。許多研究已經(jīng)表明toll樣受體4(TLR4)復(fù)合物直接將LPS的刺激信號向細胞內(nèi)傳遞，從而觸發(fā)宿主炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細菌感染[40]。OMV作為LPS的載體，可以通過激活炎癥反應(yīng)而引起宿主組織損傷。許多關(guān)于TLR4介導(dǎo)的LPS的研究都使用化學(xué)方法提純LPS，很可能是由于LPS以O(shè)MV的形式從細菌中分泌，OMV是一種異質(zhì)的蛋白質(zhì)脂質(zhì)體，其尺寸比由LPS組成的脂質(zhì)體大[41]，這些性質(zhì)可能影響先天免疫應(yīng)答的效力。TLR4對LPS的介導(dǎo)需要從膜中提取LPS，主要是通過輔助蛋白如CD14、LPS結(jié)合蛋白(LBP)或通透性蛋白(BPI)等來提取的。雖然這些因子清除細菌膜上的LPS或?qū)PS傳遞給TLR4的機制尚不清楚，但研究已確定OMV既是脂多糖激活炎癥的關(guān)鍵因子，又是誘導(dǎo)炎癥的誘餌，結(jié)合這些可溶性因子抑制炎癥。Vesy等[42]發(fā)現(xiàn)沙門氏菌(Salmonellasp.)OMV中的LPS是通過LBP提取的，而不是通過CD14等其他因素。缺失LBP抑制了LPS與細胞表面TLR4-CD14復(fù)合物的結(jié)合。純化的LPS和OMV中的LPS不僅在刺激先天免疫反應(yīng)的能力上不同，而且在宿主組織內(nèi)的分配和清除也可能不同。這對于將純LPS注入動物模型內(nèi)研究尤為重要。OMV作為異質(zhì)的蛋白質(zhì)具有親水性結(jié)構(gòu)，使得更多的OMV通過各組織更快地與宿主膜結(jié)合，相比之下，純脂多糖可能表現(xiàn)出更多的疏水性。這些特性也可能導(dǎo)致OMV更容易被吞噬細胞識別和清除。

4.2 OMV的分泌促進了細菌感染過程

OMV分泌的一個特征是能夠協(xié)同地將多個效應(yīng)分子同時傳遞到目標(biāo)位點。銅綠假單胞菌釋放帶有毒力因子的OMV，保護性地將毒力因子移動到宿主細胞膜的目標(biāo)位置，在那里囊泡與宿主細胞膜融合，將毒力因子運送到細胞質(zhì)[43]中。這一現(xiàn)象在某種程度上類似于某些植物病原菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)將效應(yīng)物直接有效地輸送到宿主細胞質(zhì)中(圖2)[44]。與T3SS系統(tǒng)相比，OMV有可能向宿主細胞質(zhì)提供更大、更多樣的因子，而不需要直接接近細菌和宿主細胞。

雖然OMV與植物細胞的融合尚未被證實，但OMV在對植物的細菌毒性方面發(fā)揮著作用。木質(zhì)部難養(yǎng)菌(Xylellafastidiosa)通過產(chǎn)生和感知擴散信號因子(DSF)來進行群體感應(yīng)、誘導(dǎo)聚集、表面附著和生物膜的形成。Ionesco等[45]的研究表明，缺乏DSF如ΔrpfF突變體，產(chǎn)生大量游離形式的OMV。研究人員認為OMV是一種抗黏附因子，參與調(diào)節(jié)細菌從生物膜形態(tài)向自由游離形態(tài)轉(zhuǎn)變，在木質(zhì)部分散并促進毒性。OMV分泌途徑也被發(fā)現(xiàn)可作為Ⅱ型分泌(T2SS)系統(tǒng)[46]分泌胞外酶的替代途徑。OMV[47]蛋白組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，如脂肪酶、蛋白酶和細胞壁修飾蛋白酶等可作為損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)的來源，被模式識別受體(PRRs)識別。事實上，通過T2SS系統(tǒng)分泌的酶和OMV內(nèi)含的酶似乎有重疊。木聚糖酶是一種植物細胞壁降解酶，其由T2SS系統(tǒng)和OMV分泌到細胞外對木質(zhì)部難養(yǎng)菌的毒力有重要作用。其他毒性因子也采取同樣的途徑。例如，在木質(zhì)部難養(yǎng)菌中T2SS系統(tǒng)分泌的一種脂肪酶LesA被包裝進OMV，從而促進了疾病的傳播[48]。與T2SS相比，將LesA和木聚糖酶包裝進入OMV可以保護蛋白質(zhì)免受細胞外環(huán)境的影響，從而擴大有效的活性范圍，并允許同時靶向和協(xié)同傳遞[49]。對T3SS分泌的效應(yīng)蛋白及植物病原菌OMV中轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的研究表明，OMV也可能是T3SS系統(tǒng)的替代途徑，或與之協(xié)同作用。

因此，OMV可促進細菌近端和遠端毒力因子的傳遞。了解OMV的傳遞機制以及OMV的產(chǎn)生與其他細菌分泌系統(tǒng)的相互作用，將有助于闡明細菌是如何影響細胞外環(huán)境的。

5 展 望

綜上所述，不同于細菌I-IX分泌系統(tǒng)，OMV介導(dǎo)毒力因子、黏附分子、毒素和其他免疫調(diào)節(jié)化合物的轉(zhuǎn)移，構(gòu)成了一個獨立的分泌系統(tǒng)，促進細菌對不同宿主的黏附和定殖。此外，OMV在營養(yǎng)獲取、細胞間通訊、防御和宿主的免疫調(diào)節(jié)等過程中的貢獻引起了科學(xué)界的極大興趣。

OMV作為抗原復(fù)合物與天然佐劑已經(jīng)成功應(yīng)用到疫苗中。通過設(shè)計高效的脂質(zhì)體納米載體(siRNA、microRNA和蛋白質(zhì))，意在實現(xiàn)藥物靶向性傳遞，在特定條件下促進藥物的釋放，以實現(xiàn)藥物更好的靶向性，增加藥物的吸收[50]。除了動物病原細菌外，其他微生物如植物病原細菌、真菌以及共生菌，如根瘤菌等互利微生物也可能分泌OMV[51]。細菌OMV是否能進入植物細胞或是否有植物胞質(zhì)受體檢測到OMV尚不清楚。植物細胞壁的存在是否阻止了OMV與植物細胞質(zhì)膜的融合，OMV誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)與直接由細菌引起的免疫反應(yīng)有何不同，OMV在發(fā)病機制和共生中的作用是什么，這些挑戰(zhàn)植物微生物相互作用領(lǐng)域的問題都有待研究人員一一解開。并且隨著科研的不斷深入，預(yù)計在不遠的將來，外泌體的研究將在疾病治療藥物、疫苗生產(chǎn)研發(fā)、動植物營養(yǎng)調(diào)節(jié)劑開發(fā)等領(lǐng)域展現(xiàn)巨大潛力。