基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究“黃芪-當(dāng)歸”治療慢性再生障礙性貧血的作用機(jī)制*

楊志文，何 靖，劉增慧，麥喆钘

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，廣州 510405； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣州 510405)

再生障礙性貧血(AA)是一種由多病因引起的造血衰竭綜合征，主要以貧血、感染和出血為臨床表現(xiàn)，其發(fā)病率在我國(guó)為0.74/10萬[1]。AA主要分為重型再生障礙性貧血(SAA)和慢性再生障礙性貧血(CAA)[1]，其中SAA病情危重，若無及時(shí)積極的治療，多導(dǎo)致患者死亡[2]，而CAA治療療程長(zhǎng)，給患者及社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[3]。目前針對(duì)AA的治療手段主要有造血干細(xì)胞移植(HSCT)和免疫抑制治療(IST)，但是HSCT受到多條件限制，并非所有患者均適用[1]，而IST雖適用于大部分患者，但是長(zhǎng)期接受IST會(huì)增加嚴(yán)重感染的風(fēng)險(xiǎn)[2]。而在近年的研究中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥在治療CAA上具有獨(dú)到之處，可增強(qiáng)治療效果，改善患者生存質(zhì)量[4-5]。

CAA在中醫(yī)古籍中并無此病名，但根據(jù)其臨床表現(xiàn)，屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇，病機(jī)主要是氣陰虧虛，治療原則為健脾益氣、滋陰養(yǎng)血[6]。根據(jù)本研究團(tuán)隊(duì)對(duì)于臨床的觀察并結(jié)合中醫(yī)大家的經(jīng)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)在治療CAA中運(yùn)用最多[7]。然而，現(xiàn)在仍缺少對(duì)于黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)治療CAA的機(jī)制研究，同時(shí)由于中藥成分復(fù)雜，在體內(nèi)作用靶點(diǎn)眾多，作用機(jī)制十分復(fù)雜，單憑動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行機(jī)制研究是較難實(shí)現(xiàn)的。因此，本研究團(tuán)隊(duì)基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)原理，對(duì)黃芪-當(dāng)歸的有效成分、作用靶標(biāo)及相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行分析，通過網(wǎng)絡(luò)分析的方法揭示其治療CAA的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 獲取黃芪-當(dāng)歸的活性成分

分別以“黃芪”和“當(dāng)歸”為關(guān)鍵詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(http：//lsp.nwu.edu.cn/，TCMSP)檢索黃芪和當(dāng)歸的所有化學(xué)成分。根據(jù)毒藥物動(dòng)力學(xué)原理指導(dǎo)，設(shè)定“OB(口服度)≥30%”和“DL(類藥性)≥0.18”為篩選條件[8]，篩選出可作為藥物被人體吸收的化學(xué)成分，作為黃芪-當(dāng)歸的活性成分。

1.2 獲取成分-疾病靶標(biāo)

1.2.1 獲取活性成分靶標(biāo) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取活性成分(1.1項(xiàng))Pubchem CID錄入Pubchem數(shù)據(jù)庫，獲取該活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)式和平面結(jié)構(gòu)圖。將各化學(xué)結(jié)構(gòu)式輸入SwissTargetPrediction服務(wù)器，基于反向分子對(duì)接法，獲得各成分的可作用靶標(biāo)，并根據(jù)probability(結(jié)合概率)值由大到小排名，選取前15位的可作用靶標(biāo)作為活性成分靶標(biāo)[9]，并獲取活性成分靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的Uniprot ID。

1.2.2 獲取疾病靶標(biāo) 以“chronic aplastic anemia”或“CAA”為關(guān)鍵詞在Genecards數(shù)據(jù)庫上檢索CAA的相關(guān)靶標(biāo)，取2次檢索結(jié)果的合集結(jié)果作為疾病靶標(biāo)。

1.2.3 獲取成分-疾病靶標(biāo) 篩選出活性成分靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)的交集部分，作為黃芪-當(dāng)歸治療CAA中可發(fā)揮作用的靶標(biāo)，即成分-疾病靶標(biāo)。

1.3 獲取有效成分-成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

篩選出活性成分(1.1項(xiàng))中可作用于成分-疾病靶標(biāo)的成分(1.2.3項(xiàng))，作為有效成分。將有效成分和成分-疾病靶標(biāo)及兩者間的對(duì)應(yīng)關(guān)系(1.2.1項(xiàng))導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建有效成分-成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，通過讀圖進(jìn)行分析與研究。

1.4 獲取核心靶標(biāo)

1.4.1 獲取潛在核心靶標(biāo) 將成分-疾病靶標(biāo)(1.2.3項(xiàng))的Uniprot ID(1.2.1項(xiàng))導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種條件為“Homo sapiens”，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件繪制成分-疾病靶標(biāo)的相互作用網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interactions,PPI)，利用該軟件的網(wǎng)絡(luò)分析工具通過Degree值算法，篩選出黃芪-當(dāng)歸治療CAA時(shí)發(fā)揮作用最大的5個(gè)潛在核心靶標(biāo)。根據(jù)Degree值大小調(diào)整節(jié)點(diǎn)的面積，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中Degree值越大則節(jié)點(diǎn)面積越大，并通過讀圖進(jìn)行分析與研究。

1.4.2 分子對(duì)接驗(yàn)證潛在核心靶標(biāo)與有效成分的結(jié)合力 通過System Dock Web Site 服務(wù)器(http：//systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index)，對(duì)潛在核心靶標(biāo)的真實(shí)性進(jìn)行驗(yàn)證。從Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)獲取成分-疾病靶標(biāo)的PDB ID，再將成分-疾病靶標(biāo)的PDB ID與有效成分的平面結(jié)構(gòu)式(1.2.1項(xiàng))輸入到System Dock Web Site服務(wù)器進(jìn)行分子對(duì)接，得到對(duì)接評(píng)分。根據(jù)對(duì)接評(píng)分大小評(píng)價(jià)兩者之間的結(jié)合潛力，分析核心靶標(biāo)的真實(shí)性。當(dāng)對(duì)接評(píng)分>7.0時(shí)，表示其結(jié)合能力很高；當(dāng)對(duì)接評(píng)分>5.0時(shí)，表示其結(jié)合能力較高；當(dāng)對(duì)接評(píng)分>4.25時(shí)，表示分子和靶標(biāo)具有一定的結(jié)合能力[10]。

1.5 GO分析和KEGG分析

將成分-疾病靶標(biāo)(1.2.3項(xiàng))導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)，限定標(biāo)識(shí)符為“UNIPROT ACCESSION”，列表類型條件為“Gene List”，得出KEGG通路富集分析和GO分類富集分析的結(jié)果。GO分類富集分析包括生物過程、細(xì)胞組分和分子功能三部分。選取滿足KDR值少于0.05的信號(hào)通路，作為黃芪-當(dāng)歸治療CAA的相關(guān)通路，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析。

1.6 繪制有效成分-成分-疾病靶標(biāo)-重要通路網(wǎng)絡(luò)圖

通過閱讀文獻(xiàn)，篩選出目前研究認(rèn)為與CAA發(fā)病及治療相關(guān)的通路，作為重要通路。取富集于重要信號(hào)通路上的靶標(biāo)與成分-疾病靶標(biāo)(1.2.3項(xiàng))的交集部分；將交集靶標(biāo)與有效成分(1.3項(xiàng))相配對(duì)，將三者的配對(duì)關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件，構(gòu)建有效成分-成分-疾病靶標(biāo)-重要通路的網(wǎng)絡(luò)，通過讀圖進(jìn)行分析與研究黃芪-當(dāng)歸治療CAA的特點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-當(dāng)歸活性成分的篩選

表1示，檢索到黃芪-當(dāng)歸的化學(xué)成分有212個(gè)，符合納入條件的活性成分共20個(gè)，包括豆甾醇、谷固醇、槲皮黃酮、葉酸等。

表1 黃芪-當(dāng)歸活性成分比較

2.2 成分-疾病靶標(biāo)的篩選

表2示，黃芪-當(dāng)歸的20個(gè)活性成分在SwissTargetPrediction服務(wù)器中共獲得靶標(biāo)300個(gè)；在Genecards數(shù)據(jù)庫中獲取CAA相關(guān)靶標(biāo)5557個(gè)，與300個(gè)成分靶標(biāo)取交集后獲得成分-疾病靶標(biāo)144個(gè)。

表2 成分-疾病靶標(biāo)

2.3 有效成分-成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)

表1示，篩選出有效成分共20個(gè)，即活性成分均為有效成分。圖1示，有效成分-成分-疾病靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖，其中有164個(gè)節(jié)點(diǎn)，包括20個(gè)有效成分(矩形節(jié)點(diǎn))和144個(gè)成分-疾病靶標(biāo)(圓形節(jié)點(diǎn))；有邊線266條，代表20個(gè)有效成分與144個(gè)靶標(biāo)之間具有266種作用關(guān)系，表示同一靶標(biāo)可對(duì)應(yīng)不同的有效成分，不同的有效成分也可作用于不同的靶標(biāo)，由此看出，黃芪-當(dāng)歸治療CAA具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

圖1 有效成分-成分-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 核心靶標(biāo)

圖2示，PPI網(wǎng)絡(luò)圖包括節(jié)點(diǎn)141個(gè)，邊線1023條。圖中圓形節(jié)點(diǎn)表示作用靶標(biāo)，邊表示靶標(biāo)之間的相互作用關(guān)系。由于CA1、PDE8B、RORA 3個(gè)靶標(biāo)與其他靶標(biāo)之間未有相互作用關(guān)系，所以未在圖中表示。表3示，其中連接度最高的5個(gè)分別是VEGF、EGFR、IFN、TNF、AR。分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果為18種對(duì)接關(guān)系的對(duì)接評(píng)分>7.0，占比18%；有42種對(duì)接關(guān)系的對(duì)接評(píng)分在 7.0～5.0之間，占比42%；有33種對(duì)接關(guān)系的對(duì)接評(píng)分在5.0～4.25之間，占比33%；有7種對(duì)接關(guān)系的對(duì)接評(píng)分<4.25，占比7%。因此，上述5個(gè)靶標(biāo)確為核心靶標(biāo)。PPI網(wǎng)絡(luò)圖也證明，黃芪-當(dāng)歸治療CAA不僅是通過廣泛作用多個(gè)靶標(biāo)而發(fā)揮療效，還可通過靶標(biāo)之間的相互影響產(chǎn)生復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)效果。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 核心靶標(biāo)信息比較

2.5 GO分析結(jié)果

表4示，GO分類富集分析結(jié)果中符合篩選條件的生物過程有20個(gè)；表5示，細(xì)胞組分有10個(gè)；表6示，分子功能有15個(gè)。

表4 生物過程分析結(jié)果比較

表5 細(xì)胞組分分析結(jié)果比較

表6 分子功能分析結(jié)果比較

2.6 KEGG結(jié)果與分析

表7示，KEGG通路富集分析結(jié)果中符合篩選條件的信號(hào)通路有20條。閱讀相關(guān)文獻(xiàn)后，本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為黃芪-當(dāng)歸治療冠心病主要通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路發(fā)揮療效。

表7 KEGG通路富集分析結(jié)果

2.7 有效成分-成分-疾病-重要通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

圖3示，圖中有節(jié)點(diǎn)41個(gè)，代表2個(gè)藥物(三角形)，12個(gè)有效成分(六邊形)，25個(gè)成分-疾病靶標(biāo)(圓形)，2條重要通路(矩形)。黃芪-當(dāng)歸治療CAA的作用機(jī)制主要是由12個(gè)有效成分作用于25個(gè)成分-疾病靶標(biāo)，進(jìn)而調(diào)控PI3K-Akt通路和VEGF通路。

圖3 有效成分-成分-疾病-重要通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

再生障礙性貧血屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞”范疇。本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，臨床上多用黃芪-當(dāng)歸藥對(duì)治療。據(jù)報(bào)道，黃芪具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、增加骨髓造血的作用；當(dāng)歸可以減少細(xì)胞凋亡，改善造血微環(huán)境，從而發(fā)揮促進(jìn)造血的作用[11]。

圖1示，黃芪-當(dāng)歸治療CAA的有效成分為括葉酸、槲皮黃酮、谷固醇、豆甾醇等。研究發(fā)現(xiàn)，AA患兒體內(nèi)的葉酸水平較正常兒童低，對(duì)AA患兒常規(guī)治療后，葉酸水平有所升高，但仍低于正常水平[12]。因此本團(tuán)隊(duì)考慮，黃芪-當(dāng)歸可通過直接補(bǔ)充葉酸來治療CAA。本團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于大部分的有效成分，國(guó)內(nèi)外尚缺少治療CAA的藥理學(xué)研究，這提示研究者可從中藥單體切入進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。除此以外，從圖1中還可以直觀的發(fā)現(xiàn)，黃芪-當(dāng)歸治療CAA具有多成分、多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖可得，各成分-疾病靶標(biāo)之間存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系，表明黃芪-當(dāng)歸的治療機(jī)制復(fù)雜多樣，不僅是有效成分作用于某一靶標(biāo)發(fā)揮作用，同時(shí)成分-疾病靶標(biāo)之間的相互作用也可有影響。研究得出VEGF、IFN、TNF、AR、EGFR為核心靶標(biāo)，分子對(duì)接結(jié)果也驗(yàn)證了核心靶標(biāo)的真實(shí)性。本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為，核心靶標(biāo)在治療過程中可發(fā)揮較為重要的作用，該推論也與既往研究相符。研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的重要因子之一。VEGF的高表達(dá)可促進(jìn)骨髓微血管的形成，為造血細(xì)胞的成熟與分化提供有利環(huán)境，促進(jìn)AA患者造血功能的恢復(fù)[13-14]。因此本團(tuán)隊(duì)推測(cè)，黃芪-當(dāng)歸可能是通過促進(jìn)VEGF的高表達(dá)來發(fā)揮療效。IFN是一種負(fù)性造血調(diào)控因子，在AA患者中表達(dá)異常，導(dǎo)致機(jī)體體液免疫出現(xiàn)異常，抑制機(jī)體造血干/祖細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致AA的發(fā)生[15]。研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方聯(lián)合常規(guī)用藥治療AA患者后，可明顯減低IFN的表達(dá)，抑制T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)AA中的Th1優(yōu)勢(shì)，進(jìn)而改善免疫功能和造血微環(huán)境[16-17]。同時(shí)TNF也是一種負(fù)性造血調(diào)控因子，在AA的發(fā)病機(jī)制中具有與IFN類似的作用，可加快造血干/祖細(xì)胞凋亡[18-19]。其相關(guān)研究也證明，藥物治療后AA患者體內(nèi)的IFN和TNF水平均會(huì)下降[20-21]，所以本團(tuán)隊(duì)認(rèn)為黃芪-當(dāng)歸可通過降低IFN和TNF的表達(dá)活性來治療CAA。對(duì)于造血系統(tǒng)，AR主要分布在骨髓基質(zhì)細(xì)胞、血小板和紅系祖細(xì)胞[22]，與雄激素結(jié)合后可刺激促紅細(xì)胞生成素的分泌，從而改善造血功能[23]。對(duì)此，本團(tuán)隊(duì)推測(cè)黃芪-當(dāng)歸可通過增加AR的表達(dá)，從而充分發(fā)揮雄激素的生物功能，或者發(fā)揮類雄激素效果直接作用于AR，促進(jìn)促紅細(xì)胞素的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，EGFR在治療CAA中為核心靶標(biāo)之一，但目前在CAA方面尚未對(duì)該靶標(biāo)具體的藥理學(xué)研究，提示研究者可以此為切入點(diǎn)，進(jìn)行更深一步的探究。

圖3示，由KEGG通路富集分析結(jié)果和有效成分-成分-疾病靶標(biāo)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖可看出，現(xiàn)有研究認(rèn)為黃芪-當(dāng)歸可通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路和VEGF信號(hào)通路來治療CAA。PI3K-Akt通路下游還有眾多通路，其中PI3K-Akt-mTOR通路在調(diào)節(jié)造血干細(xì)胞增殖與分化中發(fā)揮著重要作用[24-25]。程明秀[26]等在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)與骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMNCs)共培養(yǎng)體系中加入滋腎生血藥物后發(fā)現(xiàn)，藥物可促進(jìn)BMSCs分泌SDF-1，結(jié)合造血干細(xì)胞的CXCR4受體，激活PI3K-Akt-mTOR通路促進(jìn)血管的生成，加強(qiáng)造血作用。VEGF信號(hào)通路在調(diào)控血管生成上發(fā)揮著重要作用[27]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)VEGF水平升高后可激活VEGF通路的下游Notch通路，促進(jìn)血管的形成與發(fā)育，并改善BMSCs的分化能力[28]。本團(tuán)隊(duì)分析，黃芪-當(dāng)歸治療CAA主要是調(diào)控PI3K-Akt-mTOR通路的活性，同時(shí)調(diào)控VEGF通路，促進(jìn)BMSCc向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，增加新生血管，調(diào)節(jié)造血功能，改善血象與癥狀。

由GO分類富集分析結(jié)果可得，黃芪-當(dāng)歸治療CAA除影響免疫功能和造血功能外，還會(huì)對(duì)體內(nèi)多種分子功能、細(xì)胞組分、生物過程產(chǎn)生影響。這可能是中醫(yī)“整體觀”的具體表現(xiàn)。

綜上所述，本研究體現(xiàn)了黃芪-當(dāng)歸治療CAA的過程中涉及多個(gè)有效成分、成分-疾病靶標(biāo)及多條信號(hào)通路，證實(shí)其作用機(jī)制復(fù)雜的觀點(diǎn)。本研究大部分結(jié)論與現(xiàn)有研究結(jié)果相一致，但同時(shí)仍有部分結(jié)果未能有相關(guān)研究支持，這可能是多次對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行交互分析產(chǎn)生的誤差，但也不否認(rèn)這是由于研究不全面所導(dǎo)致的，所以本研究為研究者提供了新的研究切入點(diǎn)。本研究?jī)H從理論層面研究黃芪-當(dāng)歸治療CAA的作用機(jī)制，尚未考慮中藥煎煮中發(fā)生的成分變化，所以仍需更多的臨床試驗(yàn)與相關(guān)細(xì)胞、分子實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證。