吳鳳 鄧有展 秦玉燕 蔣越華 張莉娟 羅義燦 李冬桂

摘 要：金花白茶是白茶中的一種新興產(chǎn)品。研究金花白茶中金花菌的類型有利于為白茶產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新發(fā)展提供一定的參考依據(jù)。本研究以產(chǎn)自2018年的湖南湘豐牌桑植白茶作為材料，通過平板涂布法及三點(diǎn)接種法分離純化金花菌，采用形態(tài)學(xué)觀察并聯(lián)合分子生物學(xué)手段對(duì)所獲得的分離株進(jìn)行鑒定。分離獲得一株金花菌BC-1，經(jīng)菌落特征、顯微形態(tài)觀察、ITS測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，將該菌鑒定為冠突曲霉（Aspergillus cristatum）。從白茶中分離獲得的金花菌BC-1為冠突曲霉（A. cristatum），豐富了白茶中金花菌的分類鑒定研究，對(duì)金花白茶的開發(fā)利用提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：白茶;金花菌;冠突曲霉;冠突散囊菌;分離;鑒定

中圖分類號(hào)：TS201.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation and Identification of Golden Flower Fungus

from White Tea

WU Feng，DENG Youzhan，QIN Yuyan，JIANG Yuehua，

ZHANG Lijuan，LUO Yican，LI Donggui

（Guangxi Subtropical Crops Research Institute， Quality Supervision and Testing Center of Subtropical Fruit and Vegetable， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanning， Guangxi 530001， China）

Abstract： Golden flower white tea is a new production of white tea. To study the types of golden flower fungus in golden flower white tea is helpful to provide a theoretical basis for the innovative development of white tea industry. In this study， Hunan Xiangfeng Sangzhi white tea produced in 2018 was used as material， the golden flower fungus was isolated and purified by plate coating method and three-point inoculation method， and the obtained isolate was identified by morphological observation and molecular biological methods. A strain of golden flower fungus BC-1 was isolated and identified as Aspergillus cristatum by colony characteristics， microscopic morphology observation， ITS sequencing and phylogenetic tree construction. The study enriches the research on the classification and identification of golden flower fungus in white tea， and provides a certain reference for the development and utilization of golden flower white tea.

Key words： White tea; golden flower fungus; Aspergillus cristatum; Eurotium cristatum; isolation; identification

白茶屬于我國(guó)的六大茶葉類型之一，也是一種微發(fā)酵茶。傳統(tǒng)的白茶無需殺青或揉捻，只經(jīng)過包括萎凋、干燥、揀剔等工序制作而成[1-3]。白茶的味道清淡甘甜，起到清熱潤(rùn)肺、消炎解毒等多種保健作用[4]，因而深受廣大消費(fèi)者的喜愛。

傳統(tǒng)的白茶沒有發(fā)花工藝，但隨著茶葉市場(chǎng)的大熱，市面上也出現(xiàn)了帶“金花”的白茶。金花白茶源于前人一次偶然下發(fā)現(xiàn)了白茶中的“金花”，經(jīng)過該團(tuán)隊(duì)多年研究，通過在白茶工藝上添加使用模擬茯磚茶自然發(fā)花過程研制形成金花白茶[5]。隨著2018年7月14日金花白茶創(chuàng)新研討會(huì)的成功舉辦以及金花白茶企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的第一次公開發(fā)布，金花白茶作為白茶的一個(gè)新型產(chǎn)品，有力推動(dòng)了白茶產(chǎn)業(yè)的創(chuàng)新和升級(jí)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)白茶的研究主要集中在生產(chǎn)工藝、生理生化成分、感官品質(zhì)以及保健功效等方面[4，6-9]。

茶葉中的微生物種類繁多，在某種程度上會(huì)對(duì)茶葉的原有品質(zhì)和風(fēng)味造成影響。茶葉在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的大熱，使得茶葉中的微生物成為了研究熱點(diǎn)之一，出現(xiàn)了大量以茯磚茶等黑茶為代表的金花菌分類鑒定的相關(guān)研究報(bào)道。根據(jù)前人研究報(bào)道，金花菌有多種不同的鑒定結(jié)果[10-20]，如冠突散囊菌（Eurotium cristatum）、謝瓦散囊菌（E. chevalieri）、雪花散囊菌（E. niveoglaucum）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）等，最終命名至今尚存在異議，但多數(shù)文獻(xiàn)以“冠突散囊菌（E. cristatum）”進(jìn)行報(bào)道，也是最為常見的金花菌類型。

大多數(shù)人對(duì)金花菌的研究主要關(guān)注于茯磚、六堡、普洱等黑茶品種上，而對(duì)白茶金花菌的研究鮮少報(bào)道。金花白茶中的“金花”是模擬茯磚茶發(fā)花工藝產(chǎn)生，作為決定金花白茶品質(zhì)的關(guān)鍵要素之一，與茯磚茶等黑茶中產(chǎn)生的金花菌是否為同一類型，值得大家關(guān)注。本研究選用市售某品牌的金花白茶材料進(jìn)行金花菌的分離鑒定，通過培養(yǎng)基分離純化金花白茶中的金花，觀察培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征，運(yùn)用ITS序列進(jìn)行測(cè)序及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以期從分子水平上初步揭示金花白茶中金花菌的類型，為白茶中金花菌的分類鑒定和白茶的深入研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用茶葉樣品為市售的湖南湘豐牌桑植白茶，為2018年生產(chǎn)的白茶緊壓茶，凈含量為1000 g，茶樣見圖1。

用于金花菌菌株的分離純化的馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基和菌株形態(tài)鑒定用的察氏（CZ）培養(yǎng)基，均購(gòu)于環(huán)凱微生物;用于DNA提取的植物基因組DNA提取試劑盒、用于PCR產(chǎn)物純化的通用型DNA純化回收試劑盒、瓊脂糖等物品和試劑均購(gòu)于天根生化，2×EasyTaq■PCR SuperMix （+dye ）、DNA Maker等購(gòu)于北京全式金。

1.2 主要儀器設(shè)備

潔凈工作臺(tái)、霉菌培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、普通光學(xué)顯微鏡、普通PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、離心機(jī)、電動(dòng)研磨儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白茶樣品金花菌的分離純化

白茶茶樣中金花菌的分離按照GB 4789.15-2016國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法一進(jìn)行操作[21]，機(jī)械粉碎茶樣材料，在無菌條件下稱取粉碎的茶樣材料25 g，加入225 mL已滅菌的磷酸緩沖液，充分振搖混勻，按10倍遞增系列稀釋，吸取100 uL稀釋度為10-5、10-6、10-7的稀釋液，使用涂布棒均勻涂布在PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5天，選取典型的黃色單菌落進(jìn)行多次劃線分離純化直至獲得單一純化菌株[17]。

1.3.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察

將已純化的金花菌菌株按照三點(diǎn)接種法分別轉(zhuǎn)接至PDA和CZ培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5天，記錄不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征;挑取CZ培養(yǎng)基中微量菌絲，觀察及拍照該菌株的典型顯微形態(tài)特征。

1.3.3 白茶金花菌的分子鑒定

1.3.3.1 菌株基因組DNA的提取

刮取少量新鮮培養(yǎng)的菌絲于已滅菌的試管，加入液氮后使用電動(dòng)研磨儀迅速將菌絲研磨至粉末狀，之后按照天根植物基因組DNA提取試劑盒說明書上的實(shí)驗(yàn)步驟提取DNA。

1.3.3.2 ITS序列的擴(kuò)增及測(cè)序

采用真菌通用的ITS引物[22]對(duì)提取的菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列詳細(xì)信息如表1所示，由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL，2×EasyTaq PCR■SuperMix （+dye ）（全式金）12.5 μL，引物各0.5 μL，加無菌水補(bǔ)足至25.0 μL。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)拍照。之后使用天根通用型DNA純化回收試劑盒純化的PCR產(chǎn)物后送到上海生工測(cè)序。PCR反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序設(shè)定如下：

預(yù)變性：94℃? ? ? 5 min

變性： 94℃? ? ? 30 s

退火： 58℃? ? ? 30 s ? ? ? ? ? ?35 cycle

延伸： 72℃? ? ? 30 s

終延伸：72℃? ? ? 10 min

保存： 4℃? ? ? ? 60 min

1.3.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST對(duì)測(cè)序所獲的ITS序列進(jìn)行同源性比對(duì)，下載數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度較高的同源序列，運(yùn)用MEGA 7.0.14版本進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建（Neighbor-joining方法，Bootstrap驗(yàn)證，P-distance模式，隨機(jī)搜索設(shè)為1000）。

2 結(jié)果與分析

2.1 白茶金花菌的形態(tài)特征

將獲取的金花菌菌株編號(hào)BC-1。該菌株在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，培養(yǎng)5天菌落直徑為22～25 mm（圖2-A、2-B），正面看整個(gè)菌落呈圓形，菌落質(zhì)地致密，有放射性脊，顏色分層明顯類似于同心圓狀，邊緣為淺黃色輻射狀，中間部分顏色較深，從外到里呈淺黃色、深黃色至黑褐色，菌落黑褐色部分向外滲出黑色水滴狀液體;反面看菌落從外到里呈金黃色、深黃色、黑褐色，顏色逐步加深。該菌株在CZ培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)5天菌落直徑為26～30 mm（圖2-C，2-D），正面看整個(gè)菌落均呈金黃色蓬松絨狀，中間微隆起，有放射性脊;反面看菌落中間接種點(diǎn)呈黑褐色，由里向外從深黃色變成金黃色。刮取少量菌絲在顯微鏡下觀察，可看到大量近圓球狀的黃色閉囊殼（圖2-E），這些黃色閉囊殼中包裹了許多球狀子囊，破裂后會(huì)釋放出來，進(jìn)而產(chǎn)生大量的子囊孢子（圖2-F）。

2.2 白茶金花菌的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

使用ITS通用引物對(duì)提取的BC-1金花菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)顯示（圖3），所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物條帶單一明亮，位于500～600 bp之間，與預(yù)期結(jié)果相符。將測(cè)序所獲ITS序列在NCBI上進(jìn)行同源比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4），結(jié)果表明，白茶金花菌株BC-1的ITS序列（登錄號(hào)：OM250369.1）與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Aspergillus cristatum（登錄號(hào)：MH496725.1、MG659640.1、MG659637.1、KX858811.1）相似度高達(dá)100%，而且菌株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上屬同一分支。以序列相似程度≥97%劃分為同一個(gè)操作分類單元（OTU）原則[23]作為參考依據(jù)，本研究從金花白茶中分離的菌株BC-1與Aspergillus cristatum為同種微生物，結(jié)合菌株BC-1的菌落及顯微形態(tài)特征，可將其鑒定為冠突曲霉（A. cristatum）。

3 討論

真菌的形態(tài)特征復(fù)雜，不同環(huán)境條件下某些真菌的形態(tài)特征和生殖方式可能會(huì)發(fā)生改變，因而單單采用形態(tài)學(xué)鑒別真菌容易影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。隨著DNA測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，核酸序列分析被廣泛應(yīng)用于微生物的分類鑒定中，其中ITS片段因其長(zhǎng)度和序列變化較大，在真菌的分類鑒定中獲得普遍應(yīng)用。本研究對(duì)市售的湖南湘豐牌桑植白茶中的分離純化獲得的金花菌菌株BC-1進(jìn)行菌落及顯微形態(tài)特征鑒定，表明該菌具有金花菌的典型特征，ITS序列測(cè)序結(jié)果表明金花菌菌株BC-1與冠突曲霉（A. cristatum）高度相似，且在系統(tǒng)進(jìn)化樹上屬于同一個(gè)分支，得出該金花白茶的金花菌株BC-1為冠突曲霉（A. cristatum）的結(jié)論。這與陳勇強(qiáng)[5]的“福鼎”白茶的研究結(jié)果相同。

金花菌存在有性型和無性型兩種繁殖方式，例如冠突曲霉（A. cristatum）為有性型，而冠突散囊菌（E. cristatum）為冠突曲霉（A. cristatum）的無性型。目前金花菌的鑒定和命名有較大爭(zhēng)議，比如鑒定是同一種菌應(yīng)當(dāng)以有性型還是無性型進(jìn)行命名;其次是金花菌屬于哪一種。多數(shù)茶學(xué)研究者通過試驗(yàn)研究表明了金花菌為冠突散囊菌（E. cristatum）[10-12]。呂嘉櫪等認(rèn)為陜西茯磚茶中有謝瓦散囊菌（E. chevalieri）、冠突散囊菌（E. cristatum）、阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）、肋狀散囊菌（E. costiforme）4種優(yōu)勢(shì)金花菌[14，15]。胡治遠(yuǎn)等認(rèn)為湖南產(chǎn)區(qū)茯磚茶樣品中優(yōu)勢(shì)微生物主要有上述4中散囊菌還有蠟葉散囊菌（E. herbariorum）等散囊菌屬真菌[16];歐惠算、毛彥、陳然等人分別從不同的六堡茶樣品中分離得到阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）[17]、雪黃散囊菌（E. niveoglaucum）[18]、冠突散囊菌（E. cristatum）[19];鄧秀娟等通過illumina Miseq測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了普洱茶中存在雪黃散囊菌（E. niveoglaucum）[20]。上述學(xué)者們?cè)谲虼u茶、六堡茶、普洱茶等黑茶中發(fā)現(xiàn)了不同類型的金花菌，也說明黑茶中的金花菌具有多樣性。

金花白茶作為一種新興產(chǎn)品，金花數(shù)量成為了衡量金花白茶品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。本研究通過對(duì)金花白茶中的金花菌進(jìn)行分離鑒定，確定該金花白茶中的金花菌為冠突曲霉（冠突散囊菌的有性型），這與茯磚茶中的冠突散囊菌鑒定結(jié)果一致[10-12]，本研究結(jié)果為白茶中金花菌的分類鑒定和開發(fā)利用提供相應(yīng)的理論依據(jù)，也為探討白茶中的微生物及其作用、促進(jìn)白茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的參考依據(jù)。

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