楊航 張輝 胡南 丁德馨

南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，衡陽421001；南華大學(xué)極貧鈾資源綠色開發(fā)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽421001

0 引言

鈾礦山、核電站以及放射醫(yī)療環(huán)境中存在電離輻射，人體長期接受電離輻射會(huì)損傷體內(nèi)DNA，從而對(duì)健康造成嚴(yán)重威脅。研究結(jié)果表明，細(xì)胞DNA是電離輻射的主要靶點(diǎn)，電離輻射通過改變堿基或破壞糖-磷酸基來破壞DNA，將DNA堿基序列結(jié)構(gòu)上的任何重大變化統(tǒng)稱為DNA損傷。DNA輻射損傷檢測技術(shù)的發(fā)展對(duì)評(píng)估生物體的受輻射損害程度、診斷輻射相關(guān)的疾病以及提供相應(yīng)的輻射防護(hù)方法具有重大意義。對(duì)常用的DNA輻射損傷檢測技術(shù)的原理及應(yīng)用范圍進(jìn)行綜述，有助于科研人員根據(jù)輻射樣本的實(shí)際情況選擇最佳檢測方法。本文主要對(duì)常用的DNA輻射損傷檢測方法的原理、功能及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)其研究的未來發(fā)展方向提出了建議。

1 直接檢測法

直接檢測法主要是檢測DNA結(jié)構(gòu)或DNA堿基在輻射損傷前后理化性質(zhì)的改變，如DNA鏈斷裂、DNA堿基暴露、DNA堿基氧化等，常用技術(shù)包括瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、色譜聯(lián)用技術(shù)、毛細(xì)管電泳技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)。

1.1 瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)

單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis,SCGE）是將細(xì)胞懸浮液與瓊脂糖混合，在顯微鏡載玻片上形成薄薄的凝膠；然后使用裂解劑破壞細(xì)胞膜和核膜，提取組蛋白，破壞核小體結(jié)構(gòu)，使DNA殘留嵌入凝膠中；若DNA鏈發(fā)生斷裂，其超螺旋結(jié)構(gòu)將會(huì)變得松散，在電場作用下DNA片段向陽極遷移；經(jīng)熒光染色后，可見形似彗星的特征性圖像，故又稱為彗星實(shí)驗(yàn)。DNA受損越嚴(yán)重，產(chǎn)生的斷鏈越多，則彗星尾長增加，尾部熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[1]。采用CASP軟件分析彗星圖像[2]，觀察彗星頭部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、彗星全長、尾長、尾矩和Olive尾矩等指標(biāo)，可對(duì)DNA損傷進(jìn)行定量。

SCGE能敏感又快速地檢測任何具核細(xì)胞的DNA鏈斷裂程度，包括培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物或人的血細(xì)胞、動(dòng)物的血液淋巴細(xì)胞、精子、分解的組織細(xì)胞核等，且檢測過程中無需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行放射性同位素標(biāo)記[1,3]。SCGE的實(shí)驗(yàn)特性使其可用于檢測任何形式的DNA損傷情況，包括DNA單鏈斷裂（single-strand breakage,SSB）、DNA雙鏈斷裂（doublestrand breakage,DSB）和DNA修復(fù)能力。且SCGE用于研究單細(xì)胞內(nèi)的DNA斷裂片段時(shí)，還可區(qū)分SSB與DSB。SCGE可檢測人體內(nèi)白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞的DNA損傷，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究[4]。體外實(shí)驗(yàn)中采用SCGE檢測電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷，結(jié)果呈劑量-效應(yīng)關(guān)系[5]，體現(xiàn)了SCGE在輻射生物劑量學(xué)測定中的應(yīng)用潛力。長期以來，堿性彗星實(shí)驗(yàn)一直被用于DNA氧化損傷的定量，且常被用于研究抵制電離輻射誘導(dǎo)DNA損傷的保護(hù)劑[6]，檢測DNA切除修復(fù)、DNA合成抑制鏈終止劑的作用。

SCGE的優(yōu)勢(shì)在于使用范圍廣泛[3]，適用于所有真核細(xì)胞，在檢測DNA輻射損傷的同時(shí)可對(duì)細(xì)胞群體異質(zhì)性進(jìn)行評(píng)估，且與細(xì)胞群體中是否存在程序性細(xì)胞死亡無關(guān)。但由于涉及領(lǐng)域廣泛，實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)難以確定，加之影響體內(nèi)和體外堿性彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素很多，如凝膠中瓊脂糖的濃度、酶處理時(shí)間、堿處理時(shí)間、電泳強(qiáng)度、DNA染色程度等[7]，甚至裂解步驟亦可能影響彗星分析的結(jié)果。

1.2 色譜聯(lián)用技術(shù)

電離輻射過程中產(chǎn)生的羥基自由基可作為活性氧參與DNA的氧化損傷，將鳥嘌呤氧化成一系列穩(wěn)定的堿基氧化產(chǎn)物，其中8-羥基-2′-脫氧鳥苷已被廣泛認(rèn)為是DNA氧化損傷的標(biāo)志物[8]，采用色譜聯(lián)用技術(shù)檢測8-羥基-2′-脫氧鳥苷可用于評(píng)價(jià)DNA的損傷程度。

通過色譜法檢測DNA氧化產(chǎn)物以確定DNA的輻射損傷[9]，選擇的模型化合物可以是分離的核苷或短鏈寡核苷酸，經(jīng)氧化損傷后，可先使用高效液相色譜分離得到分解產(chǎn)物，然后選擇合適的光譜進(jìn)行表征[10]。色譜技術(shù)還可與其他高靈敏度檢測手段聯(lián)合使用，8-羥基-2′-脫氧鳥苷檢測研究最早采用的是高效液相色譜-電化學(xué)聯(lián)用技術(shù)，是一種簡易的檢測方式[11]。使用直接氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測時(shí)常會(huì)導(dǎo)致堿基在正常人為操作下的氧化，而改進(jìn)檢測條件的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可用于檢測DNA中穩(wěn)定的堿基氧化物，并對(duì)其進(jìn)行定量[12]。另外，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是一種將液相色譜與電噴霧質(zhì)譜檢測相結(jié)合的分析方法，可用于多種DNA堿基修飾的檢測，評(píng)估受損DNA的堿基水平，如小牛胸腺DNA、大鼠肝臟DNA或尿液DNA樣本中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷[13]。如今，高效液相色譜與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用是最強(qiáng)大的分析工具之一，提高了測量方式的靈敏度和特異性，此外聯(lián)用的同位素稀釋質(zhì)譜技術(shù)可提高對(duì)檢測物質(zhì)定量的精準(zhǔn)性[9]。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了色譜技術(shù)顯著的分離能力和質(zhì)譜技術(shù)高特異性的分辨能力，可先將樣品洗脫、分離得到純化的堿基氧化產(chǎn)物，再用離子化技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜定量，大大提高檢測效率與檢測精度。色譜法與質(zhì)譜法的多種結(jié)合方式中，以高效液相色譜與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用最為高效，其具有多重反應(yīng)監(jiān)測模式，與常規(guī)離子監(jiān)測模式相比，進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度。但其存在一些缺點(diǎn)，如儀器價(jià)格昂貴、維護(hù)成本高、樣品前處理復(fù)雜、對(duì)操作技能的要求較高。

1.3 毛細(xì)管電泳技術(shù)

毛細(xì)管電泳技術(shù)是以毛細(xì)管為通道分離帶電粒子，以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)物質(zhì)間電泳分配和流速的不同實(shí)現(xiàn)組分的分離。DNA在電離輻射過程中產(chǎn)生的8-羥基-2′-脫氧鳥苷，在機(jī)體修復(fù)機(jī)制的作用下，從DNA鏈上脫落并經(jīng)尿液排出體外[14]。使用毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測尿液中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷可評(píng)估DNA的損傷程度，為DNA損傷的定量提供了一種無創(chuàng)檢測手段[15]。

1967年Hjertén[16]首先提出在細(xì)孔徑管兩端加壓，使管壁中自由溶液進(jìn)行區(qū)帶電泳分離。通過優(yōu)化區(qū)帶電泳的運(yùn)行電壓、溫度、緩沖溶液pH值等條件，8-羥基-2′-脫氧鳥苷的最低檢測濃度可達(dá)0.1μmol/L[17]。而采用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)可檢測電離輻射細(xì)胞壞死后的DNA片段，是一種經(jīng)典的DNA損傷檢測方式[18]。毛細(xì)管電泳技術(shù)還可與其他檢測手段聯(lián)合使用，如高效毛細(xì)管電泳-紫外光譜聯(lián)用技術(shù)可快速測定未經(jīng)處理的尿液樣品中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷含量，比直接毛細(xì)管電泳更具操作優(yōu)勢(shì)[19]。目前，毛細(xì)管電泳技術(shù)仍需進(jìn)一步改進(jìn)。通常提高毛細(xì)管電泳的在線富集技術(shù)，如場放大堆積[20]、等速電泳[21]等，可顯著改善檢測方法的靈敏度，甚至達(dá)到對(duì)痕量樣品的富集與檢測，。

毛細(xì)管電泳技術(shù)實(shí)際包含電泳技術(shù)、色譜技術(shù)及其交叉內(nèi)容，它使樣品分析檢測量從微升水平進(jìn)入納升水平。毛細(xì)管電泳的優(yōu)點(diǎn)包括高效、分析速度快、進(jìn)樣量少、自動(dòng)化程度高、分析對(duì)象廣泛、分辨率高等，是一種新型的生物分析方法。雖然該技術(shù)檢測峰窄，選擇性好，但靈敏度較差，故用于定量檢測DNA損傷時(shí)會(huì)受到限制。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)是酶免疫測定技術(shù)中的主要手段。其基本原理為將已知抗原或抗體結(jié)合于固相載體表面，保持其免疫活性；將抗原或抗體與特定酶連接成酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體；檢測時(shí)，按相應(yīng)順序加入待檢樣品和酶標(biāo)抗原或酶標(biāo)抗體，使其與固相載體表面的抗原或抗體結(jié)合，洗滌；滴加底物溶液，底物可在酶的作用下使其所含的供氫體顯色，最后通過顏色反應(yīng)對(duì)待檢樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定量[22]。

目前，主要通過酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒測定尿液和血清中的8-羥基-2′-脫氧鳥苷[23-24]來研究長期低劑量電離輻射對(duì)人體DNA的損傷程度。酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是無需昂貴設(shè)備、使用方便且無需對(duì)尿液進(jìn)行預(yù)處理（但混濁樣品需離心處理）。然而，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)存在特異性問題，每個(gè)特定的核酸檢測均需要一個(gè)特定的反應(yīng)試劑盒，尚不能廣泛應(yīng)用。

2 間接檢測法

生物細(xì)胞在應(yīng)對(duì)電離輻射造成的DNA損傷時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)體系，以保證自身的正常生長水平。間接檢測法主要檢測機(jī)體響應(yīng)過程中產(chǎn)生的標(biāo)志性蛋白和一些參與損傷修復(fù)機(jī)制的基因的表達(dá)。間接檢測法主要包括磷酸化組蛋白H2AX（phospho-histone H2AX，γ-H2AX）免疫檢測和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）。

2.1 γ-H2AX免疫檢測技術(shù)

細(xì)胞在電離輻射條件下形成的DSB會(huì)激活細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，將H2AX磷酸化為γ-H2AX。γ-H2AX形成的核心聚集區(qū)，稱為γ-H2AX灶點(diǎn)或DNA損傷灶點(diǎn)。使用γ-H2AX免疫細(xì)胞學(xué)分析技術(shù)量化γ-H2AX灶點(diǎn)數(shù)目，即可評(píng)價(jià)DSB形成的數(shù)量和位置，從而評(píng)估電離輻射對(duì)DNA的損傷程度[25]。

γ-H2AX的檢測方法通常涉及免疫印跡法、流式細(xì)胞術(shù)和免疫染色法。免疫印跡法通常用于分析大量的細(xì)胞群或組織提取物，而簡單細(xì)胞的分析則通過流式細(xì)胞術(shù)或免疫染色法（熒光顯微鏡）進(jìn)行檢測。流式細(xì)胞術(shù)可快速檢測大量細(xì)胞中的γ-H2AX水平，評(píng)估不同細(xì)胞周期所有階段的γ-H2AX信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)評(píng)價(jià)與其相關(guān)的其他蛋白[26]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，γ-H2AX信號(hào)強(qiáng)度與細(xì)胞中γ-H2AX灶點(diǎn)的數(shù)量及大小呈定量相關(guān)性[27]。當(dāng)γ-H2AX灶點(diǎn)經(jīng)特定的免疫熒光染色后可視化為熒光離散點(diǎn)，使用熒光顯微鏡檢測離散的γ-H2AX灶點(diǎn)為DSB的定量提供了一種敏感、有效、高特異性的方法[28]。

免疫印跡法因樣品需求量太大而很少用于臨床研究[29]。流式細(xì)胞術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于快速、可靠、檢測細(xì)胞量大，但通常對(duì)γ-H2AX灶點(diǎn)的定量結(jié)果是相對(duì)的。相反，熒光顯微鏡可檢測單個(gè)細(xì)胞中的單個(gè)灶點(diǎn)[30]，故特別適用于檢測低灶點(diǎn)量的輻射損傷細(xì)胞。目前，關(guān)于流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡對(duì)γ-H2AX的檢測性能對(duì)比研究較為匱乏。此外，雖然一個(gè)DSB的發(fā)生與一個(gè)γ-H2AX灶點(diǎn)的形成相關(guān)，但兩者關(guān)系仍需深入考究。事實(shí)上，在足夠的低氧濃度下，共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變（ataxia telangiectasiamutated,ATM）蛋白和DNA依賴蛋白激酶（兩者統(tǒng)稱為DNA損傷應(yīng)答激酶）均可獨(dú)立于其他蛋白的介導(dǎo)作用而被激活，因此這些激酶可不依賴于DSB的信號(hào)而自行磷酸化H2AX[31]，這在一定程度上限制了γ-H2AX檢測法的應(yīng)用。盡管如此，γ-H2AX檢測法仍是目前檢測DNA雙鏈損傷最靈敏和有效的方法之一。

2.2 Western Blot

Western Blot是一種免疫檢測蛋白質(zhì)的方法，步驟包括蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、蛋白質(zhì)的免疫檢測[32]。先利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，將其吸附至固相基質(zhì)上；然后以固定的蛋白質(zhì)作為抗原，與特異性抗體起免疫反應(yīng)；再與酶標(biāo)記的第二抗體進(jìn)行反應(yīng)，利用底物顯色技術(shù)檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。電離輻射對(duì)DNA的損傷會(huì)激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制，引起DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的含量和活化程度的改變，應(yīng)用Western Blot檢測DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)，可評(píng)價(jià)電離輻射對(duì)DNA的損傷程度。

Towbin等[33]首次提出了在電泳和非電泳條件下實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)從凝膠到膜的轉(zhuǎn)移，使抗體這樣的大分子可更好地靶向膜上的蛋白質(zhì)，成為Western Blot的簡單形態(tài)。隨著不同蛋白轉(zhuǎn)移方式的出現(xiàn)，Western Blot已廣泛應(yīng)用于DNA輻射損傷檢測領(lǐng)域。電離輻射可引起細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致DNA斷裂，而核因子E2相關(guān)因子2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子，可增強(qiáng)抗氧化酶以及Ⅱ相解毒酶的表達(dá)[34]。Western Blot可檢測核因子E2相關(guān)因子2及相關(guān)抗氧化基因的表達(dá)，從而反映電離輻射下DNA受損程度和活細(xì)胞的抗輻射能力。另一方面，ATM是一種在感應(yīng)和傳遞DNA損傷信號(hào)、啟動(dòng)損傷DNA修復(fù)中起著重要作用的蛋白，其活化程度與DNA損傷程度存在依賴關(guān)系[35]，采用Western Blot檢測ATM蛋白的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA輻射損傷的檢測。另外，利用Western Blot分析細(xì)胞衰老的相關(guān)基因p21、p16和RecQ解旋酶介導(dǎo)的基因組穩(wěn)定性蛋白1（RMI1）的量變化，可評(píng)估電離輻射誘導(dǎo)的DNA損傷程度及DNA修復(fù)能力[36]。

Western Blot的優(yōu)點(diǎn)是可廣泛應(yīng)用于低豐度蛋白的檢測。在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)輻射現(xiàn)場無法模擬與重建時(shí)，用Western Blot生物分析法評(píng)估人員的受照劑量具有很大優(yōu)勢(shì)，但目前仍存在一些不成熟的技術(shù)問題[37]，且Western Blot的操作步驟繁瑣。

3 展 望

DNA輻射損傷檢測技術(shù)的研究可為新型輻射生物劑量計(jì)的發(fā)明提供新的研究思路，也可為核輻射患者的早期分類與臨床診斷提供新的研究方向。人們從對(duì)DNA輻射損傷的簡單認(rèn)識(shí)到發(fā)現(xiàn)DNA損傷的修復(fù)機(jī)制，相應(yīng)地設(shè)計(jì)出了對(duì)DNA結(jié)構(gòu)改變的檢測方法和機(jī)體響應(yīng)機(jī)制中基因蛋白的評(píng)估手段。

常用的DNA輻射損傷檢測方法中，高效液相色譜與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)成為實(shí)驗(yàn)室檢測手段的最佳選擇，其可實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷的精準(zhǔn)定量。但在實(shí)際臨床診斷中，通常存在不同類型的DNA輻射損傷，因此研究人員需要考慮生物調(diào)控的響應(yīng)或修復(fù)機(jī)制，適當(dāng)選擇不同的檢測技術(shù)聯(lián)合使用。隨著研究的進(jìn)一步深入，越來越多高靈敏度和高特異性的新興DNA輻射損傷檢測技術(shù)將被開發(fā)出來，未來應(yīng)集中于研究一種綜合分析能力強(qiáng)大的DNA損傷檢測手段，始終朝著簡便、快捷、靈敏、穩(wěn)定的方向發(fā)展。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突