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      維生素D干預(yù)對大鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型血管功能的影響

      2021-04-06 03:06:38付文軼徐男男徐內(nèi)利張寧
      關(guān)鍵詞:腎素藥組造模

      付文軼,徐男男,徐內(nèi)利,張寧

      類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和肢體殘疾最常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎。RA的自身免疫和炎性反應(yīng)可能會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[1]。80%的RA患者血管內(nèi)皮功能受損, 并且與RA的疾病活動(dòng)相關(guān)[2]。RA患者內(nèi)皮功能障礙可能與腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-6、膽固醇(cholesterol,CHOL)、一氧化氮(NO)水平相關(guān)[3-6]。已有研究表明TNF-α或IL-6受體拮抗劑可改善RA相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙[7-8]。有研究表明維生素D(vitamin D,VD)水平也可能與RA血管功能相關(guān)[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)VD制劑可能改善慢性腎病患者的血管功能[11-13],活性VD抑制腎素的轉(zhuǎn)錄[14]。本研究通過觀察維生素D干預(yù)對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis,CIA)造模大鼠血管功能的影響,探討非活性維生素D對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎血管功能的影響。

      1 材料與方法

      1.1 主要試劑和儀器

      冰醋酸(北京索萊寶科技有限公司);雞Ⅱ型膠原(Sigma);完全氟式佐劑(Sigma);膽維丁乳(國藥準(zhǔn)字:H10910070 上海信宜金朱藥業(yè)有限公司);Total 25-OH Vitamin D IVD ELISA Kit(R&D Systems);抗鼠VDR單克隆抗體(Santa Cruz);鼠IgG Kappa結(jié)合蛋白偶聯(lián)辣根過氧化物酶(Santa Cruz);Rat Angiotensin Ⅱ (ANG-Ⅱ) ELISA Kit(CUSABIO);Rat Renin ELISA Kit(CUSABIO);TRIpure 裂解液(Thermo Fisher);Direct-zol RNA MiniPrep PLUS (ZYMO RESEARCH);VDR引物(生工公司);腎素引物(生工公司);β-actin引物(Thermo Fisher);Power SYBRTMGreen PCR Master Mix (SYBR Green);酶標(biāo)儀(BIO-RAD iMarkTMMicroplate Reader);7500 Real Time PCR System (Thermo Hybaid)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)對象

      雌性4周齡體質(zhì)量100 g左右Wistar大鼠60只,購自遼寧長生生物有限公司,飼養(yǎng)于中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室的 SPF 清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

      所有大鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,稱重后按體質(zhì)量分組。空白對照組12只,空白給藥組12只,實(shí)驗(yàn)組36只,造模CIA模型后,剔除造模不理想大鼠,造模成功者分配于2組實(shí)驗(yàn)組,每組12只,分別為造模對照組,造模給藥組。

      1.3 膠原誘導(dǎo)Wistar大鼠關(guān)節(jié)炎模型

      按照文獻(xiàn)[15]方法初次、二次免疫造模。二次免疫造模1周后,評(píng)估造模情況,選取造模成功大鼠按體重分配至造模對照組和造模給藥組,每組12只。

      1.4 藥物干預(yù)

      根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,應(yīng)用膽維丁乳,劑型:8 mL,15 mg,給藥組按照30 000 IU/kg給藥,對照組給予同等體積生理鹽水,應(yīng)用灌胃針給大鼠灌藥。

      1.5 取材與標(biāo)本處理

      每組12只大鼠,在初次免疫4周即給藥后2周取材,每組剩余6只在初次免疫6周即給藥后4周取材。麻醉后分離主動(dòng)脈,留取血標(biāo)本,主動(dòng)脈標(biāo)本剪成3 mm左右長度,分別于凍存管-80 ℃冰箱和中性福爾馬林中浸泡,4 ℃冰箱保存。

      1.6 ELISA法檢測

      大鼠外周血清及主動(dòng)脈組織中腎素(renin)、血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,ANG-Ⅱ):使用Rat Angiotensin Ⅱ (ANG-Ⅱ) ELISA Kit和Rat Renin ELISA Kit所述方法檢測血液及主動(dòng)脈勻漿。

      1.7 免疫組化檢測

      大鼠主動(dòng)脈組織維生素D受體(vitamin D receptor,VDR): Nikon Eclipse 80顯微鏡下觀察切片,Nikon Digital Sight采集圖片。VDR陽性表達(dá)產(chǎn)物的免疫組化片呈棕褐色,應(yīng)用許良中免疫組化十三點(diǎn)評(píng)分法半定量分析免疫組化結(jié)果。

      1.8 qPCR檢測VDR及腎素表達(dá)

      使用Direct-zol RNA MiniPrep PLUS (ZYMO RESEARCH) 提取大鼠主動(dòng)脈組織RNA,進(jìn)行濃度測定,反轉(zhuǎn)錄RNA獲取cDNA,之后qPCR檢測VDR及腎素的表達(dá)。

      1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

      采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分析數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用單因素ANOVA檢驗(yàn)2組數(shù)據(jù)方差齊性,方差齊則組間比較采用t檢驗(yàn),方差不齊應(yīng)用Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分

      造模2周時(shí),選擇關(guān)節(jié)炎評(píng)分為4分的大鼠分為造模對照組及造模給藥物。造模4周時(shí)關(guān)節(jié)炎評(píng)分最高,之后逐漸減低。6周觀察期內(nèi)造模對照組及造模給藥組無明顯差異(圖1)。

      圖 1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎評(píng)分及空白組和CIA造模組大鼠典型圖Fig 1 Score of Arthritis in each group, and typical diagrams of rat pam in the blank group and CIA modelA:空白組大鼠爪; B:CIA組大鼠爪

      2.2 大鼠血清25(OH)VD水平

      給藥2周及4周分批取材檢測大鼠外周血25(OH)VD水平,造模后大鼠血清25(OH)VD水平下降,與空白對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);維生素D制劑干預(yù)2周時(shí)造模組血清25(OH)VD達(dá)到空白對照組水平,4周時(shí)略下降(圖2)。

      圖 2 給藥2及4周大鼠外周血25(OH)VD水平Fig 2 25(OH)VD levels in peripheral blood of rats after 2 and 4 weeks of administration與同時(shí)期空白對照比較,*P<0.05; 與同時(shí)期造模組比較,#P<0.05

      2.3 大鼠外周血及主動(dòng)脈組織腎素、ANG-Ⅱ水平

      給藥2及4周檢測大鼠外周血及主動(dòng)脈組織腎素、ANG-Ⅱ水平,CIA造模及VD干預(yù)未影響大鼠外周血腎素、ANG-Ⅱ水平。而主動(dòng)脈局部腎素、ANG-Ⅱ水平在CIA造模后增高,VD制劑干預(yù)后4周時(shí)輕度降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但仍高于空白對照組(圖3)。

      2.4 大鼠主動(dòng)脈VDR表達(dá)

      造模4及6周時(shí),分別取各組大鼠主動(dòng)脈組織進(jìn)行VDR免疫組化,結(jié)果經(jīng)CIA造模,大鼠主動(dòng)脈VDR表達(dá)明顯增高,與空白對照比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在4周時(shí)造模給藥組VDR表達(dá)較造模對照組下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模6周時(shí)造模對照組VDR表達(dá)較4周時(shí)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4, 圖5)。

      2.5 qPCR檢測大鼠主動(dòng)脈腎素、VDR表達(dá)

      給藥2及4周時(shí),分別提取各組大鼠主動(dòng)脈組織RNA,結(jié)果顯示CIA造模后大鼠主動(dòng)脈VDR及腎素mRNA水平均升高,與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VD制劑干預(yù)后2及4周均可見VDR及腎素mRNA水平下降,與CIA造模對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造模6周時(shí)CIA造模組VDR比造模4周時(shí)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

      圖 3 給藥2及4周大鼠外周血及主動(dòng)脈組織腎素、血管緊張素Ⅱ水平Fig 3 Renin and angiotensin Ⅱ levels in peripheral blood and aorta of rats after 2 and 4 weeks of administrationA: 給藥2及4周各組外周血腎素水平;B: 給藥2及4周各組外周血血管緊張素Ⅱ水平;C: 給藥2及4周各組主動(dòng)脈腎素水平;D: 給藥2及4周各組主動(dòng)脈血管緊張素Ⅱ水平; 與同時(shí)期空白對照比較,*P<0.05; 與同時(shí)期造模組相比,#P<0.05

      圖 4 造模4及6周大鼠主動(dòng)脈VDR表達(dá)Fig 4 Expression of VDR in rat aorta at 4 and 6 weeks after modeling與同時(shí)期空白對照比較,*P<0.05;與同時(shí)期造模組比較,#P<0.05

      圖 5 造模4及6周大鼠主動(dòng)脈VDR免疫組化Fig 5 VDR immunohistochemistry of rat aorta at 4 and 6 weeks after modelingA: 造模4周空白對照組;B: 造模4周空白給藥組;C: 造模4周造模對照組;D: 造模4周造模給藥組;E: 造模6周空白對照組; F: 造模6周空白給藥組;G: 造模6周造模對照組;H: 造模6周造模給藥組(×200)

      圖 6 給藥2及4周大鼠主動(dòng)脈腎素、VDR mRNA水平Fig 6 mRNA levels of renin and VDR in rat aorta after 2 and 4 weeks of administrationA:給藥2及4周大鼠主動(dòng)脈腎素mRNA水平;B:給藥2及4周大鼠主動(dòng)脈VDR mRNA水平;與同時(shí)期空白對照比較,*P<0.05; 與同時(shí)期造模對照組比較,#P<0.05

      3 討論

      RA 長期慢性炎癥負(fù)擔(dān)和自身免疫激活,可能導(dǎo)致血管損傷和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[16]。RA的大血管和微血管水平都有內(nèi)皮功能障礙。而VD水平可能與RA血管功能相關(guān)[9-10]。大量研究發(fā)現(xiàn)RA患者VD缺乏明顯[17-19]。本研究通過CIA造模模擬RA,發(fā)現(xiàn)和RA患者相同,CIA大鼠血清中25(OH)VD水平下降。

      腎素血管緊張素系統(tǒng)是一種激素調(diào)節(jié)系統(tǒng),影響血管收縮。經(jīng)典的腎素由腎臟分泌,腎素激活血管緊張素前體形成血管緊張素Ⅰ,之后水解產(chǎn)生有活性的ANG-Ⅱ從而調(diào)節(jié)血管舒張。除了經(jīng)典的途徑外,局部組織中如血管壁也發(fā)現(xiàn)有腎素及血管緊張素的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)CIA造模對大鼠血清腎素及ANG-Ⅱ水平無影響,而主動(dòng)脈局部腎素及ANG-Ⅱ水平在造模后升高,VD干預(yù)后有所下降,二者變化與主動(dòng)脈中VDR水平變化一致。

      VD對腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響機(jī)制尚不清楚。既往有研究發(fā)現(xiàn)RA伴有高血壓患者腎素血管緊張素活性增強(qiáng)[20],RA患者的關(guān)節(jié)滑膜和滑液中腎素活性增強(qiáng)[21]。已有實(shí)驗(yàn)也證實(shí)活性VD可抑制腎素血管緊張素系統(tǒng)活性[14,22]。本研究發(fā)現(xiàn)CIA大鼠主動(dòng)脈局部的腎素血管緊張素系統(tǒng)可能受血清VD水平影響。適度補(bǔ)充VD制劑,提高血清25(OH)VD,可能通過局部1α-羥化酶催化為活性VD[23],結(jié)合血管局部VDR,形成激素受體復(fù)合物,作用于靶基因的特定DNA序列,調(diào)節(jié)腎素基因的表達(dá),從而減弱局部增高的腎素血管緊張素系統(tǒng)活性,改善局部血管功能[24]。充足的血清25(OH)VD活化也可能通過特定基因調(diào)控促進(jìn)免疫穩(wěn)態(tài),降低自身免疫反應(yīng),降低局部增高的腎素水平。

      CIA大鼠主動(dòng)脈VDR高表達(dá),推測CIA大鼠自身免疫炎癥激活血管組織自身穩(wěn)態(tài)修復(fù),高表達(dá)VDR通過DNA反應(yīng)元件影響靶基因表達(dá),調(diào)控免疫反應(yīng),消耗大量VD,引起血清25(OH)VD水平降低。隨造模時(shí)間延長,CIA大鼠自身免疫炎癥減弱,因此造模對照組VDR表達(dá)隨時(shí)間延長下調(diào)。而VD干預(yù)后,提升血清25(OH)VD水平,可部分降低組織VDR的高表達(dá),提示可能存在針對VDR的負(fù)反饋調(diào)節(jié),當(dāng)血清25(OH)VD缺乏時(shí)VDR表達(dá)增高,血清25(OH)VD水平回升后,組織中VDR表達(dá)相對下調(diào)。

      總之,CIA大鼠出現(xiàn)血清25(OH)VD水平降低,可能由于自身免疫炎癥促使機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)消耗引起,適量補(bǔ)充VD可能對CIA大鼠血管功能有益。由于CIA造模時(shí)限性,無法長期觀察CIA大鼠血管形態(tài),需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證VD對CIA大鼠血管功能的作用。

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