Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶在小鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用機(jī)制研究*

谷 敏， 馮菲菲， 甘雪晴， 李 霜， 孫雄山△， 楊大春，△

（1西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都610031；2西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科，四川成都610083）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）是全球范圍內(nèi)第一位致死、致殘?jiān)騕1]。冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈和其他外周動(dòng)脈粥樣硬化作為常見(jiàn)的血管疾病，經(jīng)皮介入治療是重要的干預(yù)手段。血管再狹窄是血管介入治療的主要并發(fā)癥，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重心血管不良事件，同時(shí)也限制了支架的效用[2]。在血管再狹窄的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，首先是血管內(nèi)皮受到機(jī)械性損傷，隨后活化的血小板和炎癥細(xì)胞聚集在受損區(qū)域并分泌多種細(xì)胞因子，如血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和白細(xì)胞介素6等，這些生長(zhǎng)因子和炎癥介質(zhì)會(huì)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖和遷移，從而導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生和再狹窄[3]。目前，血管再狹窄的分子調(diào)控機(jī)制主要包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB/AKT）等[4]，但針對(duì)這些機(jī)制的防治措施仍不能完全遏制再狹窄的發(fā)生。因此，揭示再狹窄的潛在機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)是亟待解決的問(wèn)題。

Ⅲ型磷脂酰肌醇3-磷酸5-激酶（phosphatidylinositol 3-phosphate 5-kinase type III，PIKfyve）是一種進(jìn)化上相對(duì)保守的脂質(zhì)激酶，可以催化其相應(yīng)的底物合成磷脂酰肌醇5-磷酸（phosphatidylinositol 5-phosphate，PtdIns5P）和磷脂酰肌醇3，5-二磷酸（phosphatidylinositol 3，5-bisphosphate，PtdIns3，5P2）[5]。PIKfyve在哺乳動(dòng)物心臟、血管、腦、骨骼肌和脂肪等組織表達(dá)豐富，最近多項(xiàng)研究顯示PIKfyve 在血管鈣化和心肌肥厚等心血管疾病中也發(fā)揮重要作用[6-7]。VSMC作為血管壁的主要構(gòu)分，其在病理刺激下過(guò)度增殖和遷移在血管內(nèi)膜增生和再狹窄中發(fā)揮重要作用[8]。有研究表明，抑制PIKfyve可以降低肝癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的增殖和遷移[9-11]，但是PIKfyve 在VSMC 增殖、遷移及血管內(nèi)膜增生中的作用目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)使用PDGF-BB 干預(yù)VSMC誘導(dǎo)體外增殖和遷移，并且構(gòu)建小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型[12]，探討PIKfyve 對(duì)VSMC 增殖和遷移及血管內(nèi)膜增生的影響，以期為血管再狹窄的治療提供參考資料。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞 8～10 周齡SPF 級(jí)C57BL/6J 雄性野生型小鼠50只，體重25 g左右，購(gòu)自成都達(dá)碩生物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（川）2020-030。日夜規(guī)律光照各12 h，自由攝入水和食物，飼養(yǎng)室內(nèi)保持恒溫22～25℃。使用酶消化分離法從8～10 周小鼠胸主動(dòng)脈中分離出VSMC。

1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)液及0.25%胰蛋白酶（HyClone）；胎牛血清（Gibco）；HE 染色試劑盒（Solarbio）；RNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR（TaKaRa）；qPCR 引物由成都擎科偉業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；PIKfyve 抑制劑YM201636（MCE）；PIKfyve 抗體（Santa Cruz）；PIKfyvesiRNA 由廣州銳博生物公司合成；GAPDH、核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，S6）、磷酸化（phospho，p）-S6Ser235/236、4E 結(jié) 合 蛋 白1（4E-binding protein 1，4EBP1）和p-4EBP1Thr37/46抗體（Cell Signaling Technology）；Ki-67抗體（Bioss）；山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗鼠Ⅱ抗（Solarbio）；PDGF-BB（PeproTech）；ECL 發(fā)光液（Millipore）；重組人胰島素（Solarbio）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠VSMC 的培養(yǎng)及分組 用酶消化分離法從8～10 周小鼠胸主動(dòng)脈中分離出VSMC，用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育。隨后每2 d 更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約90%時(shí)，用0.25%胰酶消化后按照1∶2 或1∶3 傳代培養(yǎng)。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用PDGF-BB 干預(yù)VSMC 誘導(dǎo)體外的增殖和遷移，用PIKfyve特異性siRNA 敲減PIKfyve的表達(dá)，用PIKfyve 抑制劑YM201636 抑制PIKfyve 活性，用胰島素激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）的活性。為觀察敲減PIKfyve表達(dá)對(duì)VSMC 增殖和遷移的影響，將VSMC 分為DMSO+siCon 組、PDGF-BB+siCon 組、DMSO+siPIKfyve 組和PDGF-BB+siPIKfyve組，各組在成功轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA 載體或者PIKfyvesiRNA 后加入PDGF-BB（30 μg/L）或者DMSO 干預(yù)24 h。為觀察抑制PIKfyve 活性對(duì)VSMC 增殖和遷移的 影 響，將VSMC 分 為DMSO 組、PDGF-BB 組、YM201636 組和PDGF-BB+YM201636 組，按 分組加入YM201636（1 μmol/L）或DMSO 預(yù)孵育12 h，再加入PDGF-BB 或DMSO 共孵育24 h。為進(jìn)一步研究PIKfyve 通過(guò)影響mTORC1 活性調(diào)控VSMC 增殖和遷移，在敲減PIKfyve表達(dá)或抑制其活性的基礎(chǔ)上，加入胰島素（5 mg/L）孵育24 h。

2.2 細(xì)胞PIKfyvesiRNA 轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞懸液鋪于孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至大約40%時(shí)候按照試劑使用說(shuō)明用Lipofectamine 2000 作為轉(zhuǎn)染試劑以50 nmol/L 濃度進(jìn)行PIKfyvesiRNA 或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。PIKfyvesiRNA序列：5"-GUUGUCAAUGGCUUUGUUU-3"和5"-AAACAAAGCCAUUGACAAC-3"[6]。

2.3 Ki-67免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞增殖 在24孔板中放入爬片，加入細(xì)胞懸液，按前述分組干預(yù)完成后倒掉培養(yǎng)液，用PBS浸洗爬片3次，4%多聚甲醛固定30 min 以上，PBS 洗3 次，0.3%～0.5%的TritonX-100室溫通透15 min，PBS 洗3 次，吸水紙吸干，山羊血清室溫封閉30 min，吸水紙吸掉封閉液，每張玻片滴加足量的Ⅰ抗并放入濕盒中4℃過(guò)夜。之后PBS洗滌3次，滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗（此后在暗室操作），濕盒37℃孵育1 h，滴加DAPI復(fù)染核5 min，PBS洗掉多余的DAPI，吸水紙吸干液體后用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下采集圖像。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 用記號(hào)筆在6 孔板背后均勻地劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1 cm一道，每孔有5 條橫線穿過(guò)。于6 孔板中鋪細(xì)胞，待細(xì)胞鋪滿后用無(wú)菌10 μL 吸頭垂直于橫線劃一條痕。用PBS 洗細(xì)胞3 次，洗去多余懸浮細(xì)胞，拍攝0 h 照片。加入無(wú)血清培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行干預(yù)，放入孵育箱中培養(yǎng)，24 h后在光學(xué)顯微鏡下拍照。

2.5 qPCR 檢測(cè)PIKfyve mRNA 表達(dá)水平 用RNA提取試劑盒，并根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取VSMC 的總RNA。標(biāo)準(zhǔn)化各組RNA 濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH 為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計(jì)算PIKfyv 的相對(duì)表達(dá)量。PIKfyv 的上游引物序列為5"-ATGGCCACAGATGACAAGAGTTCC-3"，下游引物序列為5"-CAGACTGTGTTCTTGAAGGG-3"[6]；GAPDH 的 上 游引物序列為5"-AATGGATTTGGACGCATTGGT-3"，下游引物序列為5"-TTTGCACTGGTACGTGTTGAT-3"。

2.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞PIKfyve 表達(dá)和反映mTORC1 活性的靶分子S6（Ser235/236）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化水平 提取血管或VSMC 蛋白，按照蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。測(cè)定蛋白濃度，取蛋白樣品行SDS-PAGE 分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉或胎牛血清中室溫封閉1 h。加入相 應(yīng) 的Ⅰ抗（PIKfyve、S6、p-S6Ser235/236、4EBP1、p-4EBP1Thr37/46和GAPDH 抗體，均按1∶1 000 稀釋），于4℃過(guò)夜孵育。次日TBST洗膜后再用Ⅱ抗（1∶10 000）常溫孵育1 h。再次TBST 洗膜后使用ECL 發(fā)光液顯色，用ImageJ軟件分析結(jié)果。

2.7 動(dòng)物分組及小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型的建立 為觀察PIKfyve 在血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生中的作用，將20 只野生型小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷組、YM201636（PIKfyve 活性抑制劑）組和頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷+YM201636 組，每組5 只。小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型的建立：按照參考文獻(xiàn)[12]，小鼠稱重后用0.3%的戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射以麻醉小鼠，固定在手術(shù)臺(tái)上；頸部皮膚脫毛并用碘伏消毒，在頸部正中切開(kāi)1 cm左右小口，分離小鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈，用血管夾暫時(shí)夾閉頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用0.38 mm 粗糙導(dǎo)絲從頸外動(dòng)脈近心端插入頸總動(dòng)脈，來(lái)回旋轉(zhuǎn)通過(guò)3 次以損傷血管內(nèi)皮，迅速取出導(dǎo)絲，結(jié)扎頸外動(dòng)脈穿刺段，松開(kāi)血管夾恢復(fù)血流，縫合小鼠頸部切口。假手術(shù)組小鼠與模型組小鼠操作相同但不用導(dǎo)絲損傷頸動(dòng)脈內(nèi)皮。術(shù)后按分組腹腔注射生理鹽水或YM201636（2 mg·kg-1·d-1），持續(xù)15 d。28 d 后，處死小鼠，取出頸總動(dòng)脈，用4%多聚甲醛固定，以備后續(xù)使用。

2.8 HE 染色 取材，固定，石蠟包埋，切片。用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇及水洗，蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗。鹽酸乙醇分化2～10 s，自來(lái)水沖洗2 min，伊紅染色30 s～2 min，自來(lái)水沖掉多余染液，約10 s，晾干，中性樹(shù)膠封片、鏡檢、采圖。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析；兩組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 PDGF-BB 增加小鼠VSMC 中PIKfyve 的表達(dá)水平

qPCR 和Western blot 結(jié) 果 顯 示，與DMSO 組 相比，PDGF-BB 組VSMC 中PIKfyve 的mRNA 表達(dá)增加（P＜0.01），蛋白水平亦顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

Figure 1. The mRNA and protein levels of PIKfyve were increased in mouse VSMC treated by PDGF-BB. A：the mRNA expression of PIKfyve was detected by qPCR；B：the protein expression of PIKfyve was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs DMSO group.圖1 PDGF-BB 增加 了小 鼠VSMC 中PIKfyve 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平

2 敲減PIKfyve 抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的小鼠VSMC的增殖和遷移

Ki-67 免疫熒光染色結(jié)果顯示，PDGF-BB 處理后VSMC中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞率增加（P＜0.01）；與DMSO+siCon 組相比，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)PDGF-BB 處理，敲減PIKfyve表達(dá)均顯著降低Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率（P＜0.01）；在敲減PIKfyve的前提下，DMSO 和PDGF-BB處理VSMC 的Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2A。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DMSO+siCon 組相比，PDGF-BB 使VSMC 劃痕愈合速度增快（P＜0.01），敲減PIKfyve使劃痕愈合速度減慢（P＜0.01）；與PDGFBB+siCon 組相比，PDGF-BB+siPIKfyve 組劃痕愈合速度也顯著減慢（P＜0.01）；在敲減PIKfyve 的前提下，DMSO 和PDGF-BB 處理VSMC 的劃痕愈合速度無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖2B。

3 PIKfyve 失活抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的小鼠VSMC增殖和遷移

Ki-67 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與DMSO 組相比，PDGF-BB 增 加Ki-67 陽(yáng) 性 細(xì) 胞率（P＜0.01），YM201636 組Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低（P＜0.01）；與PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+YM201636 組的Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率也顯著降低（P＜0.01）；YM201636 組與PDGF-BB+YM201636 組的Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3A。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DMSO 組相比，PDGF-BB 組劃痕愈合速度增快（P＜0.01），YM201636 組 劃 痕 愈 合 速 度 減 慢（P＜0.01）；與PDGF-BB 組相比，PDGF-BB+YM201636 組劃痕愈合速度也顯著減慢（P＜0.01）；YM201636 組和PDGFBB+YM201636 組劃痕愈合速度無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3B。

4 敲減PIKfyve 的表達(dá)通過(guò)降低mTORC1 活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移

S6（Ser235/236）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化是反映mTORC1 活性的下游靶分子。與DMSO+si-Con 組相比，PDGF-BB 處理使VSMC 的p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平顯著增加（P＜0.05），而敲減PIKfyve使p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與DMSO+siPIKfyve 組相比，在敲減PIKfyve的基礎(chǔ)上再進(jìn)行PDGF-BB 干預(yù)，也不能增加p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋 白 水 平，見(jiàn) 圖4。與PDGF-BB+siPIKfyve 組相比，胰島素的加入增加了p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平，表明胰島素恢復(fù)了mTORC1 活性，見(jiàn)圖5A；而在利用胰島素恢復(fù)mTORC1 活 性 后，敲 減PIKfyve對(duì)PDGF-BB 處 理 后Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率上升和劃痕愈合速率增快的抑制作用消失，見(jiàn)圖5B、C。

5 PIKfyve 失活通過(guò)降低mTORC1 活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移

Western blot 結(jié)果顯示，與DMSO 組相比，PDGF-BB 組VSMC 的p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平增加（P＜0.05），YM201636 組p-S6Ser235/236和p-4EBP1Thr37/46蛋白水平降低（P＜0.05）；與PDGF-BB 組相 比，PDGF-BB+YM201636 組 p-S6Ser235/236和 p-4EBP1Thr37/46蛋 白 水 平 也 顯 著 降 低（P＜0.01）；YM201636 組與PDGF-BB+YM201636 組無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖6A。而在利用胰島素恢復(fù)mTORC1 活性后，PIKfyve 失活對(duì)PDGF-BB 處理后Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞率上升和劃痕愈合速率增快的抑制作用消失，見(jiàn)圖6B、C。

Figure 2. PIKfyve knockdown suppressed PDGF-BB-induced proliferation and migration of mouse VSMC. A：the proliferation of the cells was detected by Ki-67 staining；B：the migration of the cells was detected by scratch test. Scale bar=50 μm. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs DMSO+siCon group；##P＜0.01 vs PDGF-BB+siCon group.圖2 敲減PIKfyve表達(dá)抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的小鼠VSMC增殖和遷移

6 抑制PIKfyve 活性能減輕小鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生

Western blot 檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈PIKfyve 表達(dá)水平，與假手術(shù)組相比，頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷組PIKfyve 的表達(dá)顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖7A。HE 染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷組內(nèi)膜增生明顯，內(nèi)膜/中膜面積比值增高（P＜0.01）；與假手術(shù)組相比，假手術(shù)+YM201636 組管腔狹窄程度和內(nèi)膜/中膜面積比值無(wú)顯著差異；與頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷組相比，頸動(dòng)脈內(nèi)皮損傷+YM201636 組頸動(dòng)脈管腔狹窄程度減輕，內(nèi)膜/中膜面積比值顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖7B。

討論

血管經(jīng)皮介入治療是一種廣泛應(yīng)用于動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病如冠心病的治療策略，然而，血管再狹窄已成為限制其臨床療效的嚴(yán)重并發(fā)癥。血管再狹窄的起始步驟是支架等機(jī)械性損傷血管內(nèi)皮[8]，隨后，活化的血小板和炎癥細(xì)胞聚集在受損區(qū)域并分泌多種細(xì)胞因子，如PDGF、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素1β 等[13]。這些生長(zhǎng)因子和炎癥介質(zhì)會(huì)促進(jìn)VSMC從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋承停涮卣魇窃鲋?、遷移增加，從而導(dǎo)致新生內(nèi)膜增生和再狹窄[3，14]。VSMC 的增殖和遷移是防治血管再狹窄的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究使用PDGF-BB 模擬小鼠血管受損后釋放的PDGF的作用，以誘導(dǎo)體外的增殖和遷移，探討PIKfyve 對(duì)VSMC增殖和遷移的作用及其機(jī)制。

Figure 4. PIKfyve knockdown reduced the activity of mTORC1 in mouse VSMC. The protein levels of p-S6，S6，p-4EBP1 and 4EBP1 were determined by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO+siCon group；##P＜0.01 vs PDGF-BB+si-Con group.圖4 敲減PIKfyve表達(dá)降低了小鼠VSMC中mTORC1活性

Figure 5. Activation of mTORC1 by insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on proliferation and migration of mouse VSMC exposed to PDGF-BB. A：insulin restored the activity of mTORC1（n=3）；B：activation of mTORC1 by insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on proliferation of VSMC（n=5）；C：insulin reversed the inhibitory effect of PIKfyve knockdown on migration of VSMC（n=5）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P＜0.05，**P＜0.01 vs PDGFBB+siCon group；##P＜0.01 vs PDGF-BB+siPIKfyve group.圖5 胰島素激活mTORC1逆轉(zhuǎn)了敲減PIKfyve對(duì)PDGF-BB誘導(dǎo)的小鼠VSMC增殖和遷移的抑制作用

PIKfyve 是一種相對(duì)保守的脂質(zhì)激酶，其主要生理功能為糖代謝調(diào)控、抑制肥胖、內(nèi)體運(yùn)輸和調(diào)節(jié)自噬等[15-17]。既往研究顯示PIKfyve 在心臟、脂肪、血管和骨骼肌等組織中豐富表達(dá)[17]。Tronchere 等[6]的研究結(jié)果表明，PIKfyve 的抑制通過(guò)sirtuin-3 依賴性途徑減輕心肌細(xì)胞線粒體活性氧產(chǎn)生并減少細(xì)胞凋亡，在高脂致肥胖小鼠模型中，PIKfyve 的抑制減輕心肌肥大并改善心臟功能。Cao 等[7]使用螢光素酶實(shí)驗(yàn)鑒定PIKfyve為微小RNA（microRNA，miR）-32-5p的靶基因，并認(rèn)為PIKfyve 通過(guò)抑制BV2細(xì)胞中腫瘤壞死因子α 的產(chǎn)生進(jìn)而減輕血管的鈣化。上述研究表明PIKfyve 在心臟和血管中發(fā)揮重要作用，但PIKfyve 在機(jī)械性損傷后血管內(nèi)膜增生中的作用及機(jī)制尚未明確。研究表明，抑制PIKfyve 可以降低多種細(xì)胞如肝癌細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的增殖和遷移[9-11]，但其在VSMC 增殖和遷移中是否發(fā)揮調(diào)控作用并不清楚。本研究顯示PIKfyve 在PDGFBB 處理后的VSMC 中表達(dá)增加，而降低PIKfyve 活性或敲減PIKfyve表達(dá)，均可以抑制PDGF-BB 誘導(dǎo)的VSMC 增殖和遷移。這說(shuō)明PIKfyve 表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)VSMC 的增殖和遷移過(guò)程，但是其調(diào)控VSMC 增殖和遷移的機(jī)制目前暫不清楚。

Figure 6. PIKfyve inactivation inhibited the proliferation and migration of mouse VSMC via reducing mTORC1 activity. A：PIKfyve inactivation reduced the activity of mTORC1 in VSMC（n=3）；B：activation of mTORC1 by insulin reversed the effect of PIKfyve inactivation on proliferation of VSMC（n=5）；C：insulin reversed the effect of PIKfyve inactivation on migration of VSMC（n=5）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. *P＜0.05 vs DMSO group；##P＜0.01 vs PDGF-BB group；△△P＜0.01 vs PDGFBB+YM201636 group.圖6 PIKfyve失活通過(guò)降低mTORC1活性抑制小鼠VSMC增殖和遷移

Figure 7. Inhibition of PIKfyve activity decreased neointimal hyperplasia after mouse vascular endothelial injury. A：the protein expression of PIKfyve was determined by Western blot（n=3）；B：the vascular intima/media ratio was measured by HE staining（n=5）. Scale bar=50 μm. Mean±SD. **P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs sham+saline group；△△P＜0.01 vs injured+saline group.圖7 抑制PIKfyve活性能減輕小鼠血管內(nèi)皮損傷后內(nèi)膜增生

mTORC1 是一種蛋白激酶復(fù)合物，在控制細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、遷移、新陳代謝等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物（tuberous sclerosis complex，TSC）1/2 異二聚體是mTORC1 上游的關(guān)鍵負(fù)性調(diào)控因子，它作為GTP 酶的激活蛋白，可使下游的腦Ras 同源蛋白（Ras homolog enriched in brain，Rheb）處于與GTP 解離的失活狀態(tài)，從而抑制mTORC1[19]。Sun等[12]的研究表明，PDGF-BB促進(jìn)了mTORC1 的活化，利用VSMC 特異性的TSC1基因敲除激活mTORC1 后，促進(jìn)了VSMC 異常增殖、遷移及血管內(nèi)皮機(jī)械性損傷后的內(nèi)膜增生。但PIKfyve 是否通過(guò)影響mTORC1參與VSMC增殖、遷移調(diào)控并不清楚。因此，我們進(jìn)一步在VSMC 中研究了PIKfyve對(duì)mTORC1 活性的影響。S6（Ser235/236）和4EBP1（Thr37/46）的磷酸化是反映mTORC1 活性的兩個(gè)下游核心指標(biāo)[18]。我們的體外實(shí)驗(yàn)表明，敲減PIKfyve表達(dá)或者抑制PIKfyve 活性均能降低S6 和4EBP1 的磷酸化水平。既往研究也支持PIKfyve 正向調(diào)控mTORC1 活性，在3T3-L1 脂肪細(xì)胞中，敲減PIKfyve表達(dá)降低了p-S6 和p-4EBP1 水平[20]。既往研究表明，胰島素通過(guò)PI3K/Akt 通路激活mTORC1 的活性[19]。在本研究中胰島素的干預(yù)逆轉(zhuǎn)了敲減PIKfyve表達(dá)后降低的S6 和4EBP1 的磷酸化水平，表明胰島素激活了mTORC1 活性，而利用胰島素恢復(fù)mTORC1 活性后，敲減PIKfyve表達(dá)或者抑制PIKfyve活性對(duì)VSMC 增殖和遷移的抑制作用消失。據(jù)此推論，PIKfyve 可能通過(guò)誘導(dǎo)mTORC1 活化來(lái)促進(jìn)VSMC的增殖和遷移。

為了進(jìn)一步研究PIKfyve 在血管內(nèi)膜增生中發(fā)揮的作用，本研究采用機(jī)械性損傷血管內(nèi)皮法構(gòu)建了小鼠頸總動(dòng)脈內(nèi)皮損傷模型。結(jié)果顯示，PIKfyve在頸總動(dòng)脈內(nèi)皮損傷后表達(dá)增加，提示PIKfyve 可能在內(nèi)膜增生中發(fā)揮促進(jìn)作用。PIKfyve 活性抑制劑的使用可以減輕血管損傷后的內(nèi)膜增生和管腔狹窄程度，說(shuō)明PIKfyve 誘導(dǎo)小鼠血管損傷后內(nèi)膜增生。但是PIKfyve 在血管再狹窄中的作用機(jī)制仍有較多未知。本項(xiàng)工作主要集中于體外實(shí)驗(yàn)研究，在體內(nèi)的機(jī)制研究仍需進(jìn)一步探討。

綜上所述，PIKfyve 可通過(guò)誘導(dǎo)mTORC1 活化來(lái)促進(jìn)小鼠VSMC 的增殖和遷移，表明抑制PIKfyve 表達(dá)或活性可能是防治血管再狹窄的新靶點(diǎn)。本研究為血管再狹窄的防治提供了參考資料。