楊 惠， 武 靜， 曹琨琨， 李聰慧， 駱錕峰， 李帶雨， 高云霓

（河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院， 河南新鄉(xiāng)453007）

沉水植物不僅能夠起到凈化水體環(huán)境的作用，還具備良好的觀賞價(jià)值，能夠?yàn)楦鞣N水生動(dòng)物提供良好的生活棲息場(chǎng)所，在沉水植物表面通常存在大量微生物群落，例如附著藻類、附著細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物、有機(jī)碎屑等，還包括衰老和死亡的細(xì)胞以及一些無機(jī)顆粒[1]，其中附著細(xì)菌占主要地位，且組成復(fù)雜，很多學(xué)者把它們作為一個(gè)整體進(jìn)行研究，且把這個(gè)整體稱為沉水植物附植生物群落 (epiphytic community)或生物膜(biofilm)。沉水植物與這些附著微生物存在復(fù)雜的關(guān)系，沉水植物會(huì)分泌化感物質(zhì)，影響其表面附著微生物群落，導(dǎo)致附生細(xì)菌群落的多樣性和宿主的專一性[2]。

沉水植物附著微生物會(huì)隨植物種類不同而發(fā)生變化，篦齒眼子菜（Potamogeton pectinatus）和金魚藻（Ceratophyllum demersum）表面放線菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌[3]，穗花狐尾藻（Myriophyllum spicatum）和穿葉眼子菜（Potamogeton perfoliatus）表面Cytophaga屬、Flavobacter屬細(xì)菌豐度較高[4]，太湖輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）附著細(xì)菌主要包括α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、δ-變形菌綱，苦草附著細(xì)菌主要包括α-變形菌綱、β-變形菌綱、γ-變形菌綱[2]。附植細(xì)菌群落特征易受到多種因素影響，如沉水植物種類、植物生長狀態(tài)等生物因素和水溫、光照、溶氧、pH、營養(yǎng)等非生物因素[5]。

絲狀藻常伴隨著沉水植物大量生長，嚴(yán)重影響沉水植物的生長和水體凈化效果[6]，但相關(guān)機(jī)制還不清楚。為此，本研究選取沉水植物穗花狐尾藻，基于附植微生物和浮游微生物多樣性探討絲狀藻對(duì)穗花狐尾藻的影響，為淺水湖泊沉水植物恢復(fù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

從湖北洪湖（N29.82°,E113.48°）采集穗花狐尾藻，挑選長勢(shì)良好且均一的植株，分成兩組在相同條件下培養(yǎng)，一組生長過程中，絲狀藻很少，為穗花狐尾藻單獨(dú)生長組，命名為C1#，另一組生長過程中，絲狀藻大量生長，為與絲狀藻共存生長組，命名為C2#，待生長3月后，采集兩組植物的附著細(xì)菌和水柱中的浮游細(xì)菌。

1.2 水質(zhì)樣品采集和測(cè)定

現(xiàn)場(chǎng)采用便攜式水質(zhì)分析儀（HACH）測(cè)定pH和溶氧（DO），另采集水樣1 L，過0.45 μm濾膜后測(cè)定其他水質(zhì)指標(biāo)。其中，總?cè)芙庑蕴迹═OC）用Multi 3100 TOC分析儀測(cè)定，化學(xué)需氧量（COD）、磷酸根（PO4-P）、銨態(tài)氮（NH3-N）、總氮（TN）、總磷（TP）等水化指標(biāo)參照國標(biāo)方法測(cè)定。

1.3 附著細(xì)菌和浮游細(xì)菌樣品采集

戴上無菌乳膠手套收集狐尾藻植株，C1#組和C2#組穗花狐尾藻鮮重分別為87.34 g和81.59 g，用無菌棉簽均勻刮取狐尾藻表面附著物，每組三個(gè)平行，刮取完成后立刻將其放進(jìn)無菌的10 mL離心管中，-80℃保存。

將500 mL種植水經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾，收集濾膜，每組三個(gè)平行，將其放入無菌的10 mL離心管中，即為浮游細(xì)菌樣品，-80℃保存。

1.4 附著細(xì)菌和浮游細(xì)菌DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)狀況

狐尾藻單獨(dú)生長組（C1#）水體pH和DO分別為10.08 mg/L和12.09 mg/L，均高于與絲狀藻共存生長組（C2#），同時(shí)TOC、COD、PO4-P、NH3-N、TN、TP含量也呈現(xiàn)相同規(guī)律（表1）。

2.2 穗花狐尾藻附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征

狐尾藻單獨(dú)生長組（C1#）附著細(xì)菌共檢出17門，與絲狀藻共存生長組（C2#）附著細(xì)菌共檢出24門，其中變形菌門（Proteobacteria）在兩組中均為優(yōu)勢(shì)菌，而擬桿菌門（Bacteroidetes）、Patescibacteria、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetes）在C2#中占比更高，芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在C1#中占比更高（圖1）。

圖1 兩處理組附著細(xì)菌組成（門水平）

表1 兩處理組水質(zhì)狀況

狐尾藻單獨(dú)生長組（C1#）附著細(xì)菌共檢出188個(gè)屬，與絲狀藻共存生長組（C2#）附著細(xì)菌共檢出371個(gè)屬。Rhodobacter、Truepera、norank_o__SepB-3、Gemmatimonas、unclassified_c__Alphaproteobacteria、Fuku-N57、SD04E11、Hyphomicrobium在兩組中同時(shí)存在，但在C1#中豐度高于C2#。CL500-3、norank_c__Subgroup_6、Cyanobium_PCC-6307、Dinghuibacter、norank_f__Chitinophagaceae在C1#豐度較高，在C2#中豐度很低或幾乎不存在（圖2）。

圖2 兩處理組附著細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬熱圖

C2#組的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)均明顯大于C1#組(圖3)，表明C2#組細(xì)菌群落多樣性和豐富度更高。

圖3 兩處理組附著細(xì)菌群落Shannon指數(shù)（a）和Chao指數(shù)（b）

2.3 穗花狐尾藻種植水中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

狐尾藻單獨(dú)生長組（C1#）共檢出浮游細(xì)菌23門，與絲狀藻共存生長組（C2#）共檢出浮游細(xì)菌25門，其中變形菌門和放線菌門均占優(yōu)勢(shì)，C1#組中擬桿菌門豐度高于C2#（圖4）。

圖4 兩處理組浮游細(xì)菌組成（門水平）

狐尾藻單獨(dú)生長組（C1#）水柱中共檢出浮游細(xì)菌305屬，絲狀藻共存生長組（C2#）共檢出浮游細(xì)菌362屬，其 中Bacillus、Rhodobacter、norank_f__NS9_marine_group、Lacibacter、noank_f__Methylophilaceae、norank_o__Candidatus、_Kaiserbacteria、noank_f__NS11-12_marine_group、unclassified_f__Rhodobacteraceae、norank_o__PeM15在C1#中豐度高于C2#組，Acinetobacter、Hydrogenophaga在C2#中豐度較高，整體看來，C1#和C2#組浮游細(xì)菌屬的組成相似（圖5）。

狐尾藻單獨(dú)生長組（C1#）和與絲狀藻共存生長組（C2#）浮游細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)無顯著性差異(圖6)。

圖5 兩處理組浮游細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬熱圖

圖6 兩處理組浮游細(xì)菌群落Shannon指數(shù)（a）和Chao指數(shù)（b）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)絲狀藻大量附著時(shí)，沉水植物穗花狐尾藻附著細(xì)菌群落表現(xiàn)出明顯變化，而水柱中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無顯著變化。不同沉水植物葉片形態(tài)、化學(xué)成分和分泌的化感物質(zhì)都會(huì)影響沉水植物附著生物的組成，但是絲狀藻對(duì)沉水植物附著微生物影響的研究較少。絲狀綠藻具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力和生命力，在合適的營養(yǎng)條件下就可以大量生長，水體中營養(yǎng)缺乏的條件下，絲狀藻會(huì)將有限的營養(yǎng)成分吸收，從而抑制其他水生植物的生長，而且絲狀藻比沉水植物更能耐受高濃度的營養(yǎng)鹽水平，所以更容易生長存活。水體中營養(yǎng)鹽濃度越高，絲狀藻繁殖越快，而沉水植物的生長就會(huì)受到嚴(yán)重影響，而且當(dāng)絲狀藻死亡腐爛之后會(huì)向水體中釋放大量的有害物質(zhì)，會(huì)對(duì)其他水生生物的生活造成嚴(yán)重影響[6]。本研究發(fā)現(xiàn)絲狀藻可能通過影響沉水植物附著細(xì)菌群落組成影響沉水植物生長和功能。

在附著細(xì)菌門類水平上，何聃[7]等的研究發(fā)現(xiàn)α-變形菌、β-變形菌、擬桿菌、放線菌、Planctomycetes、藍(lán)藻等門類在沉水植物表面普遍存在，本研究中變形菌、放線菌和藍(lán)藻門在穗花狐尾藻表面也都有發(fā)現(xiàn)，且變形菌門在兩個(gè)處理組中都是優(yōu)勢(shì)菌。馬杰[3]的研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門也為篦齒眼子菜附著細(xì)菌的主要門類，但是由于沉水植物葉片化學(xué)組成成分不盡相同，且會(huì)分泌化感物質(zhì)和物理結(jié)構(gòu)的不同，因此會(huì)導(dǎo)致沉水植物附著細(xì)菌的差異性。Hempel 等研究發(fā)現(xiàn)，浮霉菌門在輪藻表面豐度很高，但是在多酚類物質(zhì)含量豐富的狐尾藻上卻基本沒有發(fā)現(xiàn)[4]，但是在絲狀藻生長旺盛的處理組中，穗花狐尾藻附著細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了浮霉菌門，我們猜測(cè)絲狀藻附著在穗花狐尾藻表面對(duì)其生長造成了影響，使其分泌的多酚類物質(zhì)減少，從而降低了對(duì)浮霉菌門的抑制作用。擬桿菌在絲狀藻生長旺盛的處理組中豐度明顯高于健康生長的狐尾藻組，有研究表明，水體營養(yǎng)鹽水平越高，擬桿菌門豐度也越高[8]，但是在本研究中，絲狀藻生長旺盛的處理組的水體中營養(yǎng)水平較低，擬桿菌門的豐度卻明顯較高，我們猜測(cè)附著的擬桿菌不僅與水體營養(yǎng)鹽濃度密切相關(guān)，與狐尾藻自身分泌的化感物質(zhì)也有關(guān)系。

從狐尾藻附著細(xì)菌的屬水平來看，norank_c__Subgroup_6 ( 酸 桿 菌 門 )、Cyanobi -um_PCC-6307、norank_f__Chitinophagaceae（擬桿菌門 ）、norank_f__Steroidobacteraceae、norank_c__Gracilibacteria這5屬在絲狀藻生長旺盛組豐度較高，而在單獨(dú)生長的狐尾藻組豐度很低或者幾乎不存在。norank_c__Subgroup_6屬于酸桿菌門，是根際土壤中唯一的潛在宿主，norank_f__Chitinophagaceae屬于擬桿菌門，其與多環(huán)芳烴類物質(zhì)芘在水中的消散呈正相關(guān)關(guān)系。

本研究中，絲狀藻生長旺盛組細(xì)菌群落組成較多樣且細(xì)菌豐富度高，我們猜測(cè)，這是由于穗花狐尾藻會(huì)分泌化感物質(zhì)，如花青素、酚類等物質(zhì)，絲狀藻附著在其表面會(huì)影響這些化學(xué)物質(zhì)的分泌，從而導(dǎo)致狐尾藻表面細(xì)菌表現(xiàn)出多樣性，即絲狀藻的大量附著會(huì)對(duì)沉水植物的生物膜造成影響。

水體中的浮游細(xì)菌會(huì)沉積在沉水植物表面，也是沉水植物附生細(xì)菌的重要來源，而且沉水植物的附生細(xì)菌也可能懸浮在水體中，水體中浮游細(xì)菌的組成與沉水植物表面附著細(xì)菌組成非常相似，只是在屬或種的水平上有所不同。任麗娟[9]等研究表明變形菌門、藍(lán)細(xì)菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門5個(gè)門類是湖泊水體中最主要的細(xì)菌門類，與沉水植物表面附著細(xì)菌主要門類組成相似，在本研究中，浮游細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門類是相同的，主要是變形菌門、放線菌門，其中狐尾藻單獨(dú)生長組水體的浮游細(xì)菌中擬桿菌門豐度高于絲狀藻生長旺盛的處理組。有研究表明水體營養(yǎng)鹽水平越高，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為多 樣[10]，與本研究結(jié)果一致。在細(xì)菌屬水平，絲狀藻生長旺盛的處理組水柱中浮游細(xì)菌種類更為豐富，但是兩組浮游細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)和Chao指數(shù)沒有顯著性差異，表明兩組中浮游細(xì)菌群落組成無明顯差異。

4 結(jié)論

絲狀藻附著在穗花狐尾藻表面，影響其表面細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，絲狀藻生長旺盛的處理組，穗花狐尾藻附著細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成更為多樣，豐度更高，而水柱中浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成無明顯變化。