蔡亞玲，廖加美，彭俊超，高 月，王萬(wàn)林，易 瓊，王 魯*

1貴州大學(xué)藥學(xué)院；2西南特色藥用生物資源開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心，貴陽(yáng) 550025

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC為菊科艾納香屬草本植物，有著溫中活血、祛風(fēng)除濕、緩解傷寒感冒、殺菌止癢、預(yù)防關(guān)節(jié)發(fā)炎等功效[1-3]。艾納香油作為艾納香提取艾片的附屬產(chǎn)品，文獻(xiàn)報(bào)道艾納香中有143個(gè)化合物[4]，實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)GC-MS檢測(cè)鑒定出有39個(gè)揮發(fā)性的化合物，也報(bào)道艾納香油在抗炎方面有著很好的藥理活性[5]，但其抗炎藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)艾納香油GC-MS檢測(cè)出的含量較高揮發(fā)性的化合物抗炎藥理學(xué)活性進(jìn)行篩選，并研究其對(duì)巨噬細(xì)胞炎性因子的影響，評(píng)價(jià)其抗炎效果，為艾納香油的深度開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，同時(shí)為中藥抗炎作用的研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物及主要試劑

(-)-龍腦、樟腦、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯、黃木素(Absin)；α-蒎烯、(+)-α-蒎烯、(-)-α-蒎烯、β-蒎烯、氧化石竹烯、α-胡蘿卜烯(上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；愈創(chuàng)木酚、β-丁香酚、1-辛烯-3-醇(Sigma)；槲皮素由貴州省生化工程中心分離鑒定，所有化合物純度≥98%。硫酸特布他林片(terbutaline)(阿斯利康制藥有限公司，批號(hào)：H32022694)；醋酸地塞米松(DEX)(遂成藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：H41021038)；硫酸阿托品(湖北興華制藥有限公司，批號(hào)：20170602)；馬來(lái)酸氯苯那敏、組胺(阿拉丁試劑公司)；弗氏完全佐劑(FCA)(Sigma)；DMEM高糖培養(yǎng)基、FBS(Gibco)；LPS(Sigma，血清型O11:B4)；PGE2、TNF-α、IL-1β和LTB4 Elisa試劑盒(武漢基因美生物公司)；NO、iNOS Elisa試劑盒(南京建成生物工程研究所)；卵清蛋白(OVA)、MTT(Solarbio)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀(jì)生物技術(shù)公司)；RNAprep Pure Cell/Bacteria Kit、FastKing RT Kit(With gDNase)(天根生物技術(shù)公司)；PowerUp SYBR Green Master mix(Thermo Scientific)；10×RIPA buffer和蛋白磷酸化一抗NF-κB-p65(Cell Signaling Technology)；NF-κB-p65、β-actin、山羊抗兔抗體和山羊抗鼠抗體(ImmunoWay Biotechnology Company)；Tyrode 臺(tái)氏液所需藥品試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

PHJ-1多功能恒溫離體腸管及平滑肌實(shí)驗(yàn)槽(成都儀器廠)；MADLAB-4C/501H型生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；MultiskanGo型全波段酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher scientific公司)；qTOWER實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、多功能凝膠成像系統(tǒng)(德國(guó)Jena公司)；小型垂直電泳系統(tǒng)、T100TMThermal Cycler溫度梯度PCR儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)。

1.3 動(dòng)物和細(xì)胞

SPF標(biāo)準(zhǔn)SD大鼠(250±20 g)及昆明小鼠(體重18±2 g)、健康清潔級(jí)成年豚鼠(體重180±10 g)(動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(渝)2018-0001)來(lái)源重慶騰鑫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，清潔級(jí)飼養(yǎng)于普通實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)(2006)》規(guī)定。小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 艾納香油中對(duì)慢反應(yīng)物質(zhì)(SRS-A)生成抑制和受體阻斷的化合物篩選

實(shí)驗(yàn)前將吐溫-80與化合物1∶1混勻、加入三蒸水形成乳化液，參考文獻(xiàn)[6]，OVA致敏豚鼠，制備SRS-A，腸管離體固定，組胺定標(biāo)，待腸管收縮穩(wěn)定后加入SRS-A及受試藥液，只加SRS-A為模型組，特步他林為陽(yáng)性對(duì)照組，槲皮素為天然藥物陽(yáng)性對(duì)照組[7]，加50%吐溫-80為溶劑組，記錄豚鼠回腸活動(dòng)曲線，每組重復(fù)3次，計(jì)算其平均收縮幅度。受試藥物的藥效用回腸收縮幅度抑制率表示，SRS-A生成抑制率=(空白組-藥物組)/空白組×100%。

腸管處理同上，組胺定標(biāo)后，各組分別加入Tyrode液(空白組)、50%吐溫-80(溶劑組)、各藥物(藥物組)、特布他林液(陽(yáng)性組)300 μL，記錄各組藥物作用后的腸管因空白組SRS-A引起的回腸收縮高度，與組胺引起回腸收縮的高度進(jìn)行計(jì)量換算，計(jì)算出SRS-A的生成抑制率。每組重復(fù)3次，用熱Tyrode液洗脫3次后再進(jìn)行其他組測(cè)試。SRS-A受體拮抗率=(空白組-藥物組)/空白組×100%。

2.2 目標(biāo)化合物小鼠急性毒性試驗(yàn)及對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響

根據(jù)“2.1”篩選結(jié)果，篩定5個(gè)化合物，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定100%致死量和0%致死量后，設(shè)劑量間距為0.75，按急性毒性試驗(yàn)要求進(jìn)行，灌胃給藥1次，劑量為0.2 mL/20 g體重，14天內(nèi)觀察記錄小鼠死亡數(shù)量及毒性反應(yīng)。參考文獻(xiàn)[5]將96只昆明小鼠隨機(jī)分成8組(詳見(jiàn)表3)進(jìn)行小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)。化合物用量選用急性毒性實(shí)驗(yàn)的LD50值的1/20[8]，地塞米松[9](0.02 g/kg)為陽(yáng)性對(duì)照組。耳廓腫脹抑制率=(溶劑組平均腫脹度-試驗(yàn)組平均腫脹度)/溶劑組平均腫脹度×100%。

2.3 目標(biāo)化合物對(duì)大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎的影響

將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組(詳見(jiàn)圖1)。參考文獻(xiàn)[10]并進(jìn)行調(diào)整，用0.1 mL FCA注入左腳掌皮層下致炎，空白組注入0.1 mL 0.9%氯化鈉，造模前記錄原始足厚度，造模第4天開(kāi)始測(cè)量足腫脹，同時(shí)開(kāi)始灌胃給藥1 mL/只，藥物按“2.1”方法配制，用量0.18 g/kg，連續(xù)灌胃10天，每3天測(cè)量一次足腫脹厚度，記錄大鼠足掌腫脹程度。

2.4 目標(biāo)化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)NO、iNOS、LTB4和PGE2的影響

先將RAW264.7細(xì)胞100 μL接種于96孔板中

表1 qPCR 引物序列及退火溫度

(6×105個(gè)/mL)，采用MTT法檢測(cè)不同濃度化合物對(duì)細(xì)胞的毒性，確定用藥濃度。又將RAW264.7細(xì)胞500 μL接種于24孔板中(6×105個(gè)/mL)，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，設(shè)立空白組、模型組(500 ng/mL LPS)、給藥組(500 ng/mL LPS+40、80、120 μg/mL各化合物)，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集各孔細(xì)胞上清液，根據(jù)各ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行操作，檢測(cè)細(xì)胞分泌NO、iNOS、LTB4和PGE2的含量。

2.5 目標(biāo)化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白的TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP、p65 mRNA表達(dá)的影響

RAW264.7細(xì)胞2 mL接種于6孔板中(6×105個(gè)/mL)，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，組別設(shè)置同“2.4”，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，按文獻(xiàn)[5]進(jìn)行RT-qPCR方法進(jìn)行，引物均由Invitrogen公司合成，引物序列及退火溫度詳見(jiàn)表1。以GAPDH為內(nèi)參基因，結(jié)果用Ct值表示，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2.6 目標(biāo)化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子p65蛋白表達(dá)水平的影響

細(xì)胞處理及組別設(shè)置同“2.4”方法，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，參考文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)p65蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，ImageJ軟件分析條帶灰度值計(jì)算蛋白表達(dá)量。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1 艾納香油中部分化合物對(duì)SRS-A生成抑制和受體阻斷的篩選結(jié)果

水浴槽體系中離體豚鼠腸管在0.1%的藥物濃度下，與空白組相比，特布他林、槲皮素、(-)-龍腦、(-)-芳樟醇顯著抑制SRS-A的生成(P<0.01)。特布他林、槲皮素、(-)-龍腦、(-)-α-蒎烯、(-)-芳樟醇對(duì)SRS-A的受體有顯著拮抗抑制作用(P<0.01)。樟腦，反式-石竹烯，1-辛烯-3-醇對(duì)SRS-A的生成有抑制作用，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，而有文獻(xiàn)報(bào)道[12,13]樟腦，反式-石竹烯具有抗炎作用，因此需做進(jìn)一步驗(yàn)證。綜合以上結(jié)果，對(duì)(-)-龍腦、(-)-α-蒎烯、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯、樟腦做進(jìn)一步篩選，結(jié)果詳見(jiàn)表2。

3.2 目標(biāo)化合物的小鼠急性毒性及對(duì)小鼠耳廓腫脹的影響結(jié)果

根據(jù)“3.1”篩選出的結(jié)果，進(jìn)行化合物小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，各化合物半數(shù)致死量(LD50)詳見(jiàn)表3，毒性大小依次是：(-)-α-蒎烯>(-)-龍腦>樟腦>(-)-芳樟醇>反式-石竹烯。按LD50值的1/20用藥，從表3中可看出，與空白組相比，陽(yáng)性藥物DEX以及反式-石竹烯、(-)-芳樟醇組均能顯著或極顯著抑制因二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹(P<0.05，P<0.01)；(-)-龍腦的抑制率達(dá)到9.02%，與空白組相比雖無(wú)顯著差異(P>0.05)，但相較于樟腦和(-)-α-蒎烯也表現(xiàn)出更好的抑制作用，且在SAS-R生成抑制和受體拮抗試驗(yàn)中抑制率分別達(dá)到32.64%，47.3%，表現(xiàn)出很好的抗炎作用。綜合以上結(jié)果，對(duì)(-)-龍腦、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯做進(jìn)一步篩選。

表3 目標(biāo)化合物的小鼠急性毒性及耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 目標(biāo)化合物對(duì)大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎的影響結(jié)果

根據(jù)“3.2”的結(jié)果，我們篩選取(-)-芳樟醇、(-)-龍腦、反式-石竹烯3個(gè)化合物進(jìn)行研究。由圖1所示，在相同用藥量下，(-)-芳樟醇和反式-石竹烯組均能顯著或極顯著降低FCA誘發(fā)的大鼠足趾腫脹(P<0.05，P<0.01)，其中(-)-芳樟醇效果略好于陽(yáng)性藥物DEX組，(-)-龍腦在9～17天時(shí)顯著降低大鼠足趾腫脹(P<0.05)，但是在21～29天時(shí)與模型組相比，差異不顯著(P>0.05)。

圖1 大鼠佐劑關(guān)節(jié)炎足趾腫脹情況Fig.1 Toe swelling in rats with adjuvant s,n=10)注：與空白組比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.001；與FCA組比較，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。Note:Compared with control,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.001;Compared with FCA,*P< 0.05,**P< 0.01,***P< 0.001.

圖2 (-)-芳樟醇、反式-石竹烯、(-)-龍腦對(duì)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生LTB4、PGE2、iNOS、NO的影響Fig.2 Effects of (-)-linalool,trans-caryophyllene and (-)-borneol on the production of LTB4,PGE2,iNOS and NO in RAW 264.7 s,n=3)注：A：空白對(duì)照組；B：LPS組；C：化合物40 μg/mL組；D：化合物80 μg/mL組；E：化合物120 μg/mL組；與空白組比較，*P< 0.01，**P< 0.01，***P< 0.001；與LPS組比較，#P< 0.05，##P< 0.01，###P< 0.01；下同。Note:A:Control;B:LPS group;C:Compound 40 μg/mL group;D:Compound 80 μ g/mL group;E:Compound 120 μ g/mL group;Compared with control,*P< 0.01,**P< 0.001,***P< 0.001;Compared with LPS group,#P< 0.05,##P< 0.01,###P< 0.01;The same below.

圖3 (-)-芳樟醇、反式-石竹烯、(-)-龍腦對(duì)RAW 264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of (-)-linalool,trans-caryophyllene and (-)-borneol on the expression of TNF-α,IL-1β,COX-2,5-LOX and FLAP mRNA in RAW 264.7 s,n=3)

3.4 目標(biāo)化合物對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)NO、iNOS、LTB4和PGE2的影響結(jié)果

細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，在24 h內(nèi)(-)-芳樟醇、(-)-龍腦、反式-石竹烯三個(gè)化合物在0～500 μg/mL濃度范圍下對(duì)加與不加LPS(500 ng/mL)培養(yǎng)情況下都不影響RAW264.7細(xì)胞活力。與空白組相比，LPS能極顯著引起RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)PGE2、LTB4、NO、iNOS(P<0.01)。在一定濃度作用下，(-)-芳樟醇、反式-石竹烯能劑量依賴(lài)性的抑制LPS誘導(dǎo)的PGE2、LTB4、iNOS的釋放(P<0.05，P<0.01)；(-)-芳樟醇能劑量依賴(lài)性的抑制LPS誘導(dǎo)NO的分泌(P<0.05，P<0.01)，反式-石竹烯不能顯著抑制NO的分泌(P>0.05)；(-)-龍腦能劑量依耐性抑制iNOS、NO的釋放(P<0.05，P<0.01)，也能抑制PGE2、LTB4的釋放(P<0.05，P<0.01)，但劑量依耐性不好，結(jié)果如圖2所示。

3.5 目標(biāo)化合物對(duì)LPS致RAW264.7細(xì)胞炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表達(dá)的影響結(jié)果

與空白組相比，LPS能顯著增加RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP等炎癥相關(guān)因子的mRNA表達(dá)(P<0.01，P<0.001)；(-)-芳樟醇、反式-石竹烯能劑量依賴(lài)性的抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)；(-)-龍腦也能抑制TNF-α、IL-1β、COX-2、5-LOX、FLAP mRNA表達(dá)(P<0.05，P<0.01)，但不呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性抑制作用，結(jié)果如圖3所示。

3.6 目標(biāo)化合物對(duì)LPS致RAW264.7細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子p65表達(dá)水平的影響結(jié)果

與空白組相比，LPS能極顯著增加p65 mRNA和蛋白的表達(dá)以及p65磷酸化(P<0.01)；(-)-芳樟醇、反式-石竹烯均能劑量依賴(lài)性的抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的p65 mRNA和蛋白的表達(dá)以及p65磷酸化(P<0.05，P<0.01)；(-)-龍腦的低、中劑量能抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的p65 mRNA和蛋白的表達(dá)以及p65磷酸化，但不呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性抑制作用，甚至高劑量能促進(jìn)p65的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。

圖4 (-)-芳樟醇、反式-石竹烯、(-)-龍腦對(duì)RAW 264.7細(xì)胞p65 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of (-)-linalool,trans-caryophyllene and (-)-borneol on mRNA and protein expression of p65 in RAW 264.7 s,n=3)

4 討論

文獻(xiàn)及相關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道[4]艾納香中有143個(gè)化合物，主要集中在揮發(fā)油和黃酮類(lèi)成分上，有：L-龍腦、樟腦、α-蒎烯、β-石竹烯、石竹烯氧化物、芳樟醇等，實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)GC-MS檢測(cè)鑒定出艾納香油中有39個(gè)揮發(fā)性成分，為了探明這些成分是否具有抗炎活性，作者選取含量在1%以上的14個(gè)揮發(fā)性的化合物進(jìn)行抗炎活性研究。SRS-A是含多種LTs的復(fù)合物，屬于花生四烯煙酸(AA)代謝中的脂氧化酶次級(jí)產(chǎn)物，可導(dǎo)致支氣管炎、肺氣腫以及肺源性心臟病等呼吸系統(tǒng)疾病[14]，SRS-A生成抑制劑和受體阻斷劑的研究已成為尋找新型抗炎免疫藥的重要方向，因此作者通過(guò)離體致敏豚鼠回腸試驗(yàn)初步篩選到(-)-龍腦、(-)-α-蒎烯、(-)-芳樟醇、反式-石竹烯、樟腦等5個(gè)具有抗炎潛質(zhì)的化合物。再采用動(dòng)物急性和慢性炎癥模型，進(jìn)一步篩選到(-)-芳樟醇、反式-石竹烯(-)-龍腦3個(gè)艾納香油的重要的抗炎活性成分。至于本研究未涉及，且文獻(xiàn)未報(bào)道的艾納香油中其他化合物中是否也具有抗炎活性，這有待進(jìn)一步深入研究。

AA作為機(jī)體內(nèi)常見(jiàn)脂肪酸的重要物質(zhì)，其代謝途徑主要以COX途徑為主，其次是LOX途徑，能促進(jìn)PG和LTs的釋放，其中12-LOX則能催化iNOS誘導(dǎo)NO生成[15]，F(xiàn)LAP是作為細(xì)胞膜的組合蛋白，介導(dǎo)著LOX的傳遞[16]，它們?cè)谘装Y過(guò)程中都起著炎癥介質(zhì)作用，抑制上述產(chǎn)物可減少炎癥發(fā)生。NF-κB作為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)傳導(dǎo)因子，在炎癥細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起中心作用，它可以誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β等)的基因表達(dá)，使炎性反應(yīng)級(jí)聯(lián)放大[17]。NF-κB-p65是NF-κB信號(hào)通路中的核心蛋白，過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致NF-κB-p65的表達(dá)增加。本文結(jié)果表明，(-)-芳樟醇、反式-石竹烯對(duì)這些炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子有抑制作用，(-)-龍腦對(duì)它們也表現(xiàn)出抑制作用，但劑量依耐性不好。有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道了它們對(duì)COX-2、iNOS、NO、PGE2這些炎癥介質(zhì)的抑制作用[13,18,19]，而對(duì)5-LOX、FLAP、LTB4的研究則較少，因此本研究也對(duì)豐富它們的抗炎機(jī)制提供了數(shù)據(jù)。綜上結(jié)果提示，(-)-芳樟醇、反式-石竹烯是艾納香油中的重要抗炎物質(zhì)。

致謝：感謝國(guó)家自然科學(xué)基金對(duì)本項(xiàng)目的支持，感謝貴州大學(xué)為我們提供科學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái)以及良好的學(xué)習(xí)環(huán)境，感謝我的導(dǎo)師王魯教授,易瓊師姐、廖加美、彭俊超、高月、王萬(wàn)林(貴州大學(xué)，西南特色藥用生物資源開(kāi)發(fā)利用教育部工程研究中心)等同學(xué)對(duì)本研究的悉心指導(dǎo)和幫助。