陸 健，張佳佳，周國勤，王佩佩，慶 輝

(南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，又名加州鱸，原產(chǎn)于北美洲的淡水河流和湖泊中，目前已在廣東、江蘇和浙江等地大規(guī)模養(yǎng)殖，成為中國南方地區(qū)淡水人工養(yǎng)殖的主養(yǎng)品種之一[1-3]。已有研究表明大口黑鱸的最適生長(zhǎng)溫度為20～30 ℃，且在超過36 ℃的水環(huán)境中無法生存[4]。但是近年來，由于全球氣候日益惡化，夏季連續(xù)高溫、極端天氣頻有發(fā)生，同時(shí)常伴有病害發(fā)生，這影響了鱸產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年我國鱸的產(chǎn)量由2017年45萬噸減少為42萬噸[5]。大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”是2019 年經(jīng)全國水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定通過的新品種，具有生長(zhǎng)速度快、飼料利用率高及適應(yīng)攝食人工配合飼料等優(yōu)點(diǎn)[6,7]。大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”作為水產(chǎn)領(lǐng)域的新星，目前已在兩廣和江浙地區(qū)廣泛推廣，將來還會(huì)迎來更加廣闊的養(yǎng)殖前景。關(guān)于大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”的生物學(xué)特性以及抗逆性研究鮮有報(bào)道，因此有必要加強(qiáng)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”的生存溫度等相關(guān)生物學(xué)研究，探究其在高溫脅迫下的生理變化機(jī)制，以及在高溫等惡劣環(huán)境下的生存狀態(tài)。

細(xì)胞凋亡(apoptosis)是一種高度調(diào)節(jié)的程序性細(xì)胞死亡[8,9]。研究認(rèn)為細(xì)胞調(diào)亡包括內(nèi)源途徑(線粒體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路)和外源途徑(死亡受體通路)[10-11]。但是所有通路的最終途徑都是半胱氨酸蛋白酶(Caspase)的激活，所以Caspase家族在細(xì)胞凋亡中扮演著舉足輕重的角色[12-15]。同時(shí)，肝臟是維持生命活動(dòng)和物質(zhì)代謝的重要器官，參與魚類體內(nèi)多種物質(zhì)的合成、貯存、代謝、轉(zhuǎn)化和分解[16]。因此，本研究以“優(yōu)鱸3號(hào)”為研究對(duì)象，探究了其在極度高溫脅迫下肝臟細(xì)胞凋亡相關(guān)酶活性和基因表達(dá)，旨在為 “優(yōu)鱸3號(hào)”應(yīng)對(duì)高溫脅迫的機(jī)制和健康高效養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，促進(jìn)大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)升級(jí)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)處理

試驗(yàn)所用大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”幼魚,體質(zhì)量(9.87±1.2)g，體長(zhǎng)(7.9±0.4) cm,均來自江蘇南京帥豐飼料有限公司，將試驗(yàn)用魚暫養(yǎng)于有生物過濾水再循環(huán)系統(tǒng)(配備有冷卻和加熱功能，流速為5 L/min，光照時(shí)間為14 h)的水族箱中。每天投喂兩次(8:00～9:00和20:00～21:00)江蘇南京帥豐飼料有限公司大口黑鱸配合飼料。整個(gè)暫養(yǎng)和試驗(yàn)期間水中溶氧高于5 mg/L，氨氮與亞硝酸鹽低于0.01 mg/L，試驗(yàn)前禁食24 h，試驗(yàn)期間不投喂。

將各組幼魚在25 ℃水溫下暫養(yǎng)15 d后，對(duì)照組水溫保持在該溫度下恒定。試驗(yàn)組按水溫31、34、37 ℃設(shè)置，每個(gè)溫度包括三個(gè)平行組，每個(gè)平行組30尾幼魚，將暫養(yǎng)幼魚迅速轉(zhuǎn)入事先預(yù)調(diào)好水溫的水循環(huán)缸中，并于1、3、6、12、24和48 h取6尾幼魚的肝臟組織于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示37 ℃組大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”的死亡率較高，48 h小于50%，則認(rèn)為37 ℃為極限高溫，測(cè)定在37 ℃下細(xì)胞凋亡相關(guān)酶活性和基因的表達(dá)。

1.2 酶活性測(cè)定

酶活性測(cè)定均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒：Caspase-3(批號(hào)：G015-1-3)，Caspase-9(批號(hào)：G018-1-3)，準(zhǔn)確稱取50 mg肝組織，加入50 μL試劑盒中的裂解液，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取少量樣品用Bradford法測(cè)蛋白濃度，之后測(cè)定Caspase-3和Caspase-9酶活性，取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值。

1.3 組織RNA提取與cDNA合成

組織RNA的提取采用高純總RNA快速抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，RP1202)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量(電壓120 V，電流165 mA，時(shí)間25 min)，用Nanodrop 檢測(cè) RNA 的純度(OD260/280)和濃度。根據(jù)HiScript?Reverse Transcriptase的說明(Vazyme，R123-01)進(jìn)行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。

1.4 熒光定量PCR

參考樊佳佳等[17]以18s基因?yàn)閮?nèi)參基因，Caspase-3和Caspase-9引物序列來自Yu等[18]參考斑馬魚(Daniorerio，NCBI：NC_007135.7)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus，NCBI：NC_031982.2)、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus，NCBI：NC_030438.1)、尖吻鱸(LatesCalcarifer，NCBI：NW_017363888.1)的BCL-2基因的 cDNA 序列，在同源保守區(qū)內(nèi)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因特異性上下游引物，參考引物序列詳見表1。用SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)試劑盒(Vazyme，Q341-02/03)在ABI熒光定量PCR儀擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2 μL cDNA模板(5 ng/μL)，4 μL的上、下游引物(10 μmol/L)，10 μL 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix(High ROX Premixed)。擴(kuò)增條件為95 ℃ 10 min； 40個(gè)循環(huán)的條件是95 ℃ 10 s，58 ℃ 60 s，熔解曲線60 ℃→95 ℃，每15 s升溫0.3 ℃。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

表1 引物信息Tab.1 The information of the primers

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

通過計(jì)算OD誘導(dǎo)劑/OD陰性對(duì)照的倍數(shù)來表示酶的相對(duì)活化程度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示，所有數(shù)據(jù)均用 SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD多重比較檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)處理和檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異顯著(* )，P<0.01表示差異極顯著(**)，用Origin 8.6 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 極度高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟凋亡相關(guān)酶活性的影響

在大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟中，相較于對(duì)照組，37 ℃高溫脅迫后，Caspase3和Caspase9酶活均顯著升高 (圖1和圖2)，且隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，在48 h達(dá)到峰值，極顯著高于對(duì)照組，Caspase3為對(duì)照組的5.05倍，Caspase9為對(duì)照組的4.82倍。

圖1 高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟Caspase 3活性的影響Fig.1 The effects of high-temperature stress on Caspase 3 activities in liver of M.salmoides “youlu No.3”

圖2 高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟Caspase 9活性的影響Fig.2 The effects of high-temperature stress on Caspase 9 activities in liver of M.salmoides “youlu No.3”

2.2 極度高溫脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

37 ℃高溫脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟Caspase3和Caspase9的表達(dá)量相較于對(duì)照組均呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢(shì)(圖3和圖4)。Caspase3從3 h時(shí)顯著升高，在6 h的表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照組的23.67倍，隨之下降至24 h依舊顯著高于對(duì)照組，48 h與對(duì)照組無顯著性差異。Caspase 9的表達(dá)量相較于對(duì)照組從1 h時(shí)顯著升高，在6 h的表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照組的27.88倍,隨之下降至24 h依舊顯著高于對(duì)照組，48 h與對(duì)照組無顯著性差異。極度高溫脅迫下大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟BCL-2的表達(dá)量1 h達(dá)到峰值，顯著高于對(duì)照組，之后顯著下降至48 h時(shí)BCL-2的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.04倍 (圖5)。

圖3 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟Caspase3 mRNA 表達(dá)量的影響Fig.3 The effects of high-temperature stress on the relative expression of liver Caspase3 mRNA of M.salmoides “youlu No.3”

圖4 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟Caspase9 mRNA 表達(dá)量的影響Fig.4 The effects of high-temperature stress on the relative expression of liver Caspase9 mRNA of M.salmoides “youlu No.3”

圖5 溫度脅迫對(duì)大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”肝臟BCL-2 mRNA 表達(dá)量的影響Fig.5 The effects of high-temperature stress on the relative expression of liver BCL-2 mRNA of M.salmoides “youlu No.3”

3 討論

溫度是影響魚類生存的重要環(huán)境因子之一，主要對(duì)魚類代謝反應(yīng)起調(diào)控作用，進(jìn)而能夠影響魚類的生理健康[19]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族是直接導(dǎo)致凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細(xì)胞凋亡機(jī)制中居核心地位[14]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，作為凋亡的“起始者”[20]，Caspase9 的表達(dá)量和酶活力在37 ℃高溫脅迫后出現(xiàn)增加。作為凋亡的“執(zhí)行者”[21]，Caspase3在正常條件下是以休眠的酶原形式存在于正常細(xì)胞中，當(dāng)其受到凋亡信號(hào)刺激后可以裂解特異性的蛋白質(zhì)底物導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[14,22]。本試驗(yàn)的結(jié)果顯示，Caspase3的表達(dá)趨勢(shì)與 Caspase9幾乎是一致的，只是Caspase3顯著變化的時(shí)間稍晚于Caspase9，表明起始子Caspases9 水解激活了處于細(xì)胞調(diào)亡關(guān)鍵地位的Caspase3，而使調(diào)亡開啟。同樣的，當(dāng)斑馬魚[23]在39 ℃高溫脅迫后，Caspase活性增加，相似的情況也在大西洋鮭魚(Salmosalar)[24]、日本牙鲆(Paralichthysolivaceus)[25]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[11]中發(fā)現(xiàn)，表明短期的急性升溫應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)受到損傷，觸發(fā)激活凋亡相關(guān)系列基因的變化，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，清除受損的細(xì)胞，來維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[26]。但是隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)Caspase3和Caspase9均出現(xiàn)一定的下降，同時(shí)肝臟組織損傷較為明顯，肝細(xì)胞排列無序、較多肝細(xì)胞均出現(xiàn)空泡化、細(xì)胞間界限雜亂模糊、細(xì)胞核萎縮，嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)溶解，表現(xiàn)為細(xì)胞壞死[26]，然而草魚腎細(xì)胞在連續(xù)40高溫脅迫24 h則表現(xiàn)出胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞凋亡率持續(xù)上升，表明細(xì)胞凋亡還在持續(xù)進(jìn)行[11]，造成這種情況的原因可能是連續(xù)的高溫刺激致使大口黑鱸肝臟失去自我調(diào)節(jié)能力，體內(nèi)平衡被打破，最終導(dǎo)致Caspase表達(dá)量降低，造成細(xì)胞凋亡的過程中Caspase和ATP的減少，從而發(fā)展成為不可逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞壞死，最后直至魚體死亡[11]。值得注意的是，在高溫脅迫后Caspase3和Caspase9在mRNA和酶活水平的變化并不一致，原因可能是長(zhǎng)時(shí)間脅迫后導(dǎo)致總蛋白質(zhì)濃度下降，從而使得基因表達(dá)下調(diào)[27]。另一方面，酶活屬于蛋白質(zhì)的水平，基因從mRNA 水平到蛋白質(zhì)水平，需要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯兩大程序，期間還有蛋白質(zhì)的修飾等程序的啟動(dòng)，因此相對(duì) mRNA 水平，基因在蛋白質(zhì)水平的表達(dá)具有滯后性[28]。

BCL-2是BCL-2蛋白家族中主要的抑制調(diào)亡蛋白的代表，可以抑制細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡提高細(xì)胞的存活率[11]。關(guān)于高溫脅迫后魚類BCL-2基因的研究報(bào)道較少，而在其他外源性刺激研究報(bào)道較多。在低氧4天(0.5 mg/L)的鯉(Cyprinuscarpio)的肝臟中檢測(cè)到BCL-2的表達(dá)量增加[29]，鎘脅迫后草魚肝臟BCL-2的表達(dá)量先升高再下降[30]，我們的試驗(yàn)結(jié)果顯示，BCL-2的表達(dá)量在37℃高溫脅迫后1h出現(xiàn)峰值，表明BCL-2在抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮作用。在脅迫6 h后BCL-2的表達(dá)量顯著降低，原因可能是高溫破壞了線粒體膜導(dǎo)致蛋白減少，細(xì)胞色素C釋放到胞外激活開啟了依賴于BAX的凋亡通路，使得BAX大量表達(dá)，致使BAX-BCL-2 異源二聚體被BAX-BAX同源二聚體取代，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[31-32]。前期Caspase3和Caspase9基因表達(dá)量上升也可以印證這一點(diǎn)。同樣的，高溫誘導(dǎo)后尼羅羅非魚性腺細(xì)胞抑凋亡基因BCL-2持續(xù)下調(diào)，且在誘導(dǎo)后18天仍然能檢測(cè)到下調(diào)，說明抑凋亡基因可抑制細(xì)胞的凋亡[28]。另一方面，不少學(xué)者認(rèn)為BCL-2可以通過發(fā)揮抗氧化作用來抑制凋亡的發(fā)生[11,12,33]。確實(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，在高溫脅迫后短時(shí)間內(nèi)優(yōu)鱸3號(hào)的SOD活力相較于對(duì)照組顯著升高[34]，這可能是機(jī)體在進(jìn)行自我調(diào)節(jié)和自我保護(hù)來獲得生存。當(dāng)脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至48 h時(shí)，BCL-2的表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.04倍，原因可能是脅迫時(shí)間較長(zhǎng)，超過魚體正常自我調(diào)節(jié)范圍，大量的 ROS 在細(xì)胞內(nèi)堆積，造成細(xì)胞氧化損傷最終導(dǎo)致BCL-2表達(dá)量顯著降低，同時(shí)48 h時(shí)37 ℃組的存活率僅為50%也印證了這一點(diǎn)。因此，37 ℃可能已經(jīng)成為大口黑鱸“優(yōu)鱸3號(hào)”的極限溫度，在日常養(yǎng)殖生產(chǎn)中，需要密切關(guān)注池塘溫度的變化，減少溫度應(yīng)激，增加魚體免疫力，同時(shí)做好應(yīng)對(duì)高溫天氣的防護(hù)措施。