外源氮素調(diào)控C/N比對杉木林凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

費(fèi)裕翀,葉義全, 2,鄭 宏,路 錦,游云飛,黃 櫻,陳愛玲,曹光球, 2,*

1 福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院, 福州 350002 2 國家林業(yè)和草原杉木工程技術(shù)研究中心, 福州 350002 3 福建省洋口國有林場, 南平 353211 4 福建農(nóng)林大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院, 福州 350002

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方重要的速生用材樹種之一,據(jù)第八次全國森林資源清查數(shù)據(jù)表明,我國杉木人工林種植面積為17×107hm2,種植面積及蓄積面積分別占人工林總面積的24%和28%,在我國森林系統(tǒng)中占據(jù)了重要地位[1- 2]。隨著林業(yè)集約生產(chǎn)水平的提高,杉木人工林獲得速生、豐產(chǎn)的同時(shí),其地力下降現(xiàn)象已成為我國杉木人工林可持續(xù)經(jīng)營的主要障礙。

凋落物的分解作為森林生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的主要途徑,是森林土壤養(yǎng)分的重要來源,加強(qiáng)有關(guān)杉木凋落物分解特性的研究對于杉木人工林地力的維持與提升具有重要意義。大量學(xué)者認(rèn)為杉木凋落物中木質(zhì)素含量較高和氮含量貧乏是導(dǎo)致其分解周期較長以及杉木人工林養(yǎng)分周轉(zhuǎn)較慢的重要原因[3],并傾向于將C/N比作為評判杉木凋落物底物質(zhì)量和預(yù)測其分解速率的重要指標(biāo)[4]。相關(guān)學(xué)者提出在凋落物分解過程中存在著某一C/N比臨界值[5- 6],當(dāng)?shù)蚵湮镒陨鞢/N比值高于這一臨界值時(shí),氮元素?zé)o法滿足微生物分解活動(dòng)的需要,阻礙了胞外酶的分泌,使得凋落物分解緩慢,這也是底物質(zhì)量較差的凋落物在分解初期常常出現(xiàn)養(yǎng)分富集現(xiàn)象的根本原因[7]。目前有關(guān)通過外源氮添加改善杉木凋落物底物質(zhì)量的研究已有較多報(bào)道[3- 4],但此類研究并未總結(jié)外源氮添加背景下,C/N比的改變影響杉木凋落物分解的現(xiàn)有規(guī)律,杉木凋落物分解的內(nèi)在機(jī)理仍有較大研究價(jià)值。

凋落物的分解包括淋洗作用、機(jī)械破碎、土壤動(dòng)物的消化、微生物對化合物的酶解等過程,但凋落物的徹底降解則是在土壤微生物酶解作用下完成[8- 9],可以認(rèn)為凋落物分解是基于細(xì)胞水平,細(xì)菌、真菌和放線菌等分解者共同參與,對凋落物中有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行酶解和礦化的過程。長期以來的研究普遍認(rèn)為相比于細(xì)菌,真菌在森林凋落物的分解過程中起著更為重要的作用,然而細(xì)菌作為土壤微生物中數(shù)量最高的群體,雖然對于新鮮凋落物的分解能力較弱,但細(xì)菌能夠以不同于其他微生物的作用方式改變著凋落物的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成,促進(jìn)真菌的定殖和土壤動(dòng)物的攝食[10- 11]。此外相比于真菌,細(xì)菌對于角質(zhì)及其他芳香族化合物具有更強(qiáng)的分解能力[12],在針葉類凋落物的分解過程中尤為重要。微生物快速的細(xì)胞分裂一方面需要大量富氮的RNA,外源氮的輸入在一定程度上增加了環(huán)境中氮的有效性,提升了微生物自身對于酶合成的能力[13]；而另一方面外源氮過量輸入可能造成環(huán)境中的氮超過土壤微生物所需的閾值,對其生命活動(dòng)產(chǎn)生抑制作用[14],并使得纖維素、木質(zhì)素與酚類物質(zhì)等有機(jī)碳化合物產(chǎn)生聚合反應(yīng),形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,難以被微生物所利用的有機(jī)物質(zhì)[15]。因此不同外源氮輸入量能夠直接或間接影響微生物結(jié)構(gòu)與功能,進(jìn)而影響森林凋落物的分解。

杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)由于林分結(jié)構(gòu)單一,普遍存在如固氮菌、纖維素分解菌以及氨化細(xì)菌等功能性微生物類群和數(shù)量退化的問題[16],而林下植被的發(fā)育演替對于人工林土壤微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)具有顯著影響[17]。通過對林下植被的撫育改善土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu),提升人工林養(yǎng)分周轉(zhuǎn)速率的內(nèi)在微生物機(jī)制目前較少有人關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),不同林下植被管理措施間的杉木人工林土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)均存在著較大差異[17-18]。通過測定不同林下植被管理措施杉木人工林中的凋落物微生物群落結(jié)構(gòu)可能更有助于深入探究C/N比調(diào)控杉木凋落物分解的內(nèi)在機(jī)制。有鑒于此,本研究以林下植被保留和林下植被去除2種林下植被管理措施下的杉木人工林為研究林分,通過施入外源氮改變杉木凋落葉的初始C/N比,觀測其在不同林分中分解300 d時(shí)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異,探討杉木凋落葉分解的內(nèi)在C/N比值機(jī)理,從而進(jìn)一步加深對杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)與反饋的認(rèn)識。

1 研究地區(qū)與研究方法

1.1 試驗(yàn)材料來源

為保證杉木凋落葉養(yǎng)分含量基本一致,試驗(yàn)材料取自福建省洋口國有林場南山管護(hù)站杉木中齡林樹體宿留枯死枝。將杉木凋落葉從收集的杉木枯死枝剝離后,帶回試驗(yàn)室自然風(fēng)干后備用。經(jīng)測定,杉木凋落葉初始全氮含量為8.1 mg/g,全碳含量為482.5 mg/g,全磷含量為0.3 mg/g,C/N比值為60.9,C/P比值為1393.2,N/P比值為23.9,全鉀含量為2.9 mg/g,全鈣含量為4.2 mg/g,全鎂含量為1.3 mg/g,全錳含量為1.2 mg/g。

1.2 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于福建省南平市順昌縣洋口國有林場南山管護(hù)站(117°92′—118°64′E,26°87′—27°13′N),系武夷山脈南部,屬低山丘陵區(qū),光照充足,雨量充沛,夏季高溫多雨,冬季溫和濕潤,屬于中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候。日照時(shí)數(shù)為1668—1972 h,無霜期254—305 d,年平均氣溫為18.6 ℃,極端最高氣溫41.4 ℃,極端最低氣溫-5.8 ℃,地區(qū)年降水量1600—1900 mm,年平均蒸發(fā)量為1308—1587 mm,相對濕度平均值為78%—82%。海拔252—339 m,平均坡度26—32°。土壤為山地紅壤,土層深度100 cm以上,土壤較肥沃。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2018年10月在福建省洋口國有林場南元管護(hù)站,根據(jù)海拔、坡度、坡向等立地條件基本一致的原則,選擇林下植被保留和林下植被去除共2種林下植被管理措施下的杉木人工林。2種林分造林時(shí)間均為1984年,種苗來源為杉木第1代種子園的優(yōu)良家系壯苗,初植密度為2505株/hm2,1997年進(jìn)行撫育間伐,間伐強(qiáng)度約為50%,保留株數(shù)為1187株/hm2。間伐后的杉木人工林采取近自然化管理,使林下植被自然演化,減少人為干擾。林下植被保留林分采取近自然化管理至今,林分密度為958 株/hm2,平均樹高22.7 m,平均胸徑31.9 cm,林下灌木層主要為粗葉榕(Ficushirta)、杜莖山(Maesajaponica)、大葉紫珠(Callicarpakochiana)和木荷(Schimasuperba)等,草本主要為薄蓋短腸蕨(Allantodiahachijoensi)、金毛狗(Cibotiumbarometz)、觀音蓮座蕨(AngiopterisfokiensisHieron)和江南短腸蕨(Allantodiametteniana)等,草本層生物量6.7 t/hm2,林下植被總蓋度92%；林下植被去除林分自2012年7月起,每年進(jìn)行1次林下植被清理,林下灌木清除采用割灌機(jī),林下草本采用鐮刀手工割除,林分密度為983 株/hm2,平均樹高22.3 m,平均胸徑30.2 cm。2018年11月在2種林分下分別設(shè)置3個(gè)20 m×20 m樣地,并在樣地的4個(gè)角均打下水泥樁以作標(biāo)記。不同林分類型土壤理化性質(zhì)見表1。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[19-20],本研究共設(shè)置具有不同C/N比的4類杉木凋落葉：C/N比值60.9(記做CK)；C/N比值40.6(記做N1,約為杉木凋落葉C/N原始值的2/3)；C/N比值30.5(記做N2,約為杉木凋落葉C/N原始值的1/2)；C/N比值20.3(記做N3,約為杉木凋落葉C/N原始值的1/3),各處理重復(fù)4次。準(zhǔn)確稱取各樣品所需的(10.000±0.005) g杉木凋落葉,將其整齊、緊湊地平鋪于牛皮紙上。選取NaNO3作為氮源,根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)以溶液形式將不同濃度的NaNO3溶液均勻噴施于葉面,待其風(fēng)干后測定C/N比值,重復(fù)幾次,直至各處理樣品的杉木凋落葉C/N比達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。將各處理的杉木凋落葉樣品分別裝入網(wǎng)眼0.5 mm、大小為20 cm×20 cm的尼龍分解袋中,于2018年12月分別放置于林下植被保留和林下植被去除共2種杉木人工林的3個(gè)預(yù)設(shè)樣地內(nèi)。放置時(shí)去除地表凋落物層,每個(gè)分解袋之間間隔50 cm,貼上標(biāo)簽,用竹釘固定四角在地表,保證分解袋緊貼表層土壤。每種處理分解袋縱向放置,處理間設(shè)置3 m的緩沖帶。

表1 樣地的土壤理化性質(zhì)(0—20 cm)

分解袋放置300 d后進(jìn)行取樣,每個(gè)樣地每個(gè)處理各取4袋,取樣時(shí)戴一次性手套,每個(gè)分解袋均單獨(dú)裝入自封袋中,其中3袋用刷子清除凋落葉所附著的沙土和植物根系等雜質(zhì),于烘箱中80 ℃烘干至恒質(zhì)量,稱重后用粉碎機(jī)研磨過0.25 mm篩,用于測定凋落葉化學(xué)性質(zhì)。各處理杉木凋落葉化學(xué)性質(zhì)見表2。另1袋置于小型便攜冰柜中帶回試驗(yàn)室,用經(jīng)酒精消毒的剪刀將凋落葉剪碎裝入自封袋置于-80 ℃冰箱中保存,用于微生物群落多樣性的測定。

表2 凋落葉分解300 d后化學(xué)性質(zhì)(n=3)

1.4 杉木凋落葉干質(zhì)量剩余率和化學(xué)性質(zhì)測定

干質(zhì)量計(jì)算公式為y=1-(W0-Wt)/W0×100%y=1-(W0-Wt)/W0×100%,W0為凋落葉分解初始干質(zhì)量(g),Wt為分解t時(shí)間后剩余的凋落葉干質(zhì)量。全氮和全碳含量采用全自動(dòng)碳氮分析儀(Elemental Analyzer Vario ELIII,德國)測定。全磷含量測定采用堿熔-鉬銻抗比色法,全鉀含量測定采用堿熔-火焰光度法,全鈣和全鎂含量測定采用EDTA絡(luò)合滴定法,全錳含量測定采用原子吸收分光光度法,以上分析方法參考文獻(xiàn)[21]。

1.5 杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性測定

采用Mobio公司的PowerSoil DNA Isolation Kit微生物總DNA提取試劑盒提取杉木凋落葉總DNA。對提取后的DNA產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,合格DNA稀釋至1 ng/μL保存于-80 ℃用于PCR擴(kuò)增。采用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rRNA的V3+V4區(qū),引物序列為341F：CCTACGGGNGGCWGCAG和806R：GGACTACHVGGGTATCTAAT。PCR反應(yīng)體系：2.5 μL細(xì)菌模板DNA(5 ng/μL),上游引物和下游引物各5 μL(引物濃度1 μmol/μL),12.5 μL 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min,隨后98 ℃變性10 s,62 ℃退火30 s,68 ℃延伸30 s,共27個(gè)循環(huán)后68 ℃延伸10 min。對擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收,使用QuantiFluorTM熒光計(jì)進(jìn)行定量。將純化的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行等量混合,連接測序接頭,使用New England Biolabs公司的NEB Next?UltraTMDNA Library Prep Kit for Illumina建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測,合格后使用Hiseq2500(Illumina,SanDiego,CA,USA)的PE250模式上機(jī)測序。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用FLASH軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾和雙端序列的拼接,得到有效數(shù)據(jù)[22]。采用Uparse軟件,對相似度≥97%的序列歸為1個(gè)操作分類單元即OTU(Operational taxonomic unit)[23]并利用Greengene數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋。運(yùn)用Qiime軟件對所得優(yōu)質(zhì)序列進(jìn)行OTU聚類和物種分類分析,對OTUs進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析。運(yùn)用R軟件進(jìn)行聚類分析、典范對應(yīng)分析和方差分解分析。運(yùn)用Lefse 1.0軟件對組間差異進(jìn)行分析。運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及Person相關(guān)性分析,使用由Origin 10.5和Exce1 2016軟件處理進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 分解300 d后杉木凋落葉干質(zhì)量剩余率

由表3可知,外源氮的輸入對于杉木凋落葉的分解具有低促高抑的作用。除N3處理,林下植被保留林分下的杉木凋落葉干質(zhì)量剩余率均低于林下植被去除林分,可見林下植被保留管理措施更有利于杉木凋落葉的分解。但相比于林下植被去除林分,過低的初始C/N比對于林下植被保留林分中杉木凋落葉分解的抑制作用則更為明顯。

表3 杉木凋落葉分解300 d后干質(zhì)量剩余率/%

2.2 杉木凋落葉細(xì)菌多樣性指數(shù)

去除掉低質(zhì)量的序列后,樣本平均序列條數(shù)為92549,將所有序列按97%的相似度進(jìn)行OTU分類,所得的OTU總數(shù)為86427個(gè),平均每個(gè)樣品的OTU數(shù)目是3601個(gè),結(jié)合表4中的Goods_coverage指數(shù),可認(rèn)為測序深度增加已不影響物種多樣性,測序量足夠,雖仍有少量微生物種群未被發(fā)現(xiàn),但所得數(shù)據(jù)已基本反映凋杉木落葉中微生物群落結(jié)構(gòu)組成,置信度較高。由表4可知,外源氮的輸入對于杉木凋落葉細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)普遍具有低促高抑的效應(yīng),一定范圍內(nèi)初始C/N比的降低有利于提升杉木凋落葉細(xì)菌群落多樣性。就林分差異而言,林下植被保留林分中杉木凋落葉細(xì)菌群落的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均高于林下植被去除林分中相同處理,表明林下植被保留林分中杉木凋落葉細(xì)菌群落多樣性指數(shù)高于林下植被去除林分。但方差分析表明,不同處理間杉木凋落葉的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)差異普遍未達(dá)顯著水平,不同初始C/N比對同一地區(qū)同一樹種凋落葉的細(xì)菌群落多樣性影響較小。

2.3 杉木凋落葉細(xì)菌聚類分析

基于OTU列表的物種豐度信息,開展聚類(PCoA,Principal co-ordinates analysis),利用降維的思想研究樣本的組成距離關(guān)系,分析結(jié)果中,樣品組成越相似,反映在PCoA圖中的距離越近。如圖1所示,林下植被保留林分中除N1處理下的杉木凋落葉各樣品的聚集效應(yīng)較差,其他處理下的各樣品聚集效應(yīng)較好,其中CK和N3處理下的杉木凋落葉樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有聚集效應(yīng),而與N2處理下的樣品圍繞第一主成分基本分開,表明兩者間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近,與N2處理細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。林下植被去除林分中各處理下的杉木凋落葉聚集效應(yīng)總體較好,除N1和N2處理下的杉木凋落葉樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有聚集效應(yīng),兩者間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相近,其他處理下的樣品則總體呈分離效應(yīng),各處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。采用Anosim檢驗(yàn)(表5)對組間細(xì)菌群落相似度進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn),結(jié)果表明各處理間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)普遍存在顯著差異。

表4 杉木凋落葉細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

圖1 杉木凋落葉細(xì)菌群落聚類圖Fig.1 Clustering of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters

表5 組間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異Anosim顯著性檢驗(yàn)

2.4 杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

由圖2可知,在細(xì)菌門分類水平上相對豐度前十的細(xì)菌種群為：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、裝甲菌門(Armatimonadetes)和厚壁菌門(Firmicutes)。變形菌門、放線菌門和浮霉菌門的相對豐度在各樣品中均大于10%,為主要優(yōu)勢種群,其中林下植被保留林分中杉木凋落葉的放線菌、綠彎菌和芽單胞菌相對豐度均高于林下植被去除林分中相同處理,浮霉菌則相反。由圖3可知,在細(xì)菌屬分類水平上相對豐度前十的細(xì)菌種群為：慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、嗜酸棲熱菌屬(Acidothermus)、Singulisphaera屬、出芽菌屬(Gemmata)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、Jatrophihabitans屬、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)和動(dòng)孢囊菌屬(Kineosporia)。就林分差異而言,林下植被保留林分中杉木凋落葉Singulisphaera屬和Jatrophihabitans屬的相對豐度總體低于林下植被去除林分中相同處理。

圖2 杉木凋落葉細(xì)菌群落物種分布堆疊圖(門) Fig.2 Stacking diagram of species distribution of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters (Phylum)

圖3 杉木凋落葉細(xì)菌群落物種分布堆疊圖(屬) Fig.3 Stacking diagram of species distribution of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters (Genus)

為進(jìn)一步探究各處理下的杉木凋落葉具有指示作用的微生物種群,本研究通過LEFse分析組間種群差異,以LDA柱狀圖(默認(rèn)閾值：LDA>2)以及進(jìn)化分支圖進(jìn)行顯示。由圖4可知,林下保留林分中N3處理下的杉木凋落葉無顯著差異細(xì)菌種群；CK處理下相對豐度顯著較高的細(xì)菌種群數(shù)最多,主要為變形菌門中的多類細(xì)菌,如伯克氏菌屬(Paucimonas)、Kaistia屬、玫瑰球菌屬(Roseococcus)、Methylophaga屬、Aetherobacter屬等,此外藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、放線菌門以及擬桿菌門中同樣存在多類細(xì)菌種群相對豐度顯著較高；與CK處理相似,N1處理下相對豐度顯著較高的細(xì)菌種群同樣主要為變形菌和放線菌門中的多類細(xì)菌,如紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、Rhizobiale屬,小月菌屬(Microlunatus)和中村氏菌屬(Nakamurella)等；N2處理下相對豐度顯著較高的細(xì)菌種群僅有酸桿菌門中的Terracidiphilus屬。

圖4 林下植被保留措施下基于分類等級樹的組間細(xì)菌種群差異展示圖Fig.4 A diagram of bacterial population differences between groups based on taxonomic tree under undergrowth vegetation preservationA, Terracidiphilus; b, Hevea_brasiliensis_phytoplasma; c, 中村氏菌屬 Nakamurella; d, 中村氏菌科 Nakamurellaceae; e, 小月菌屬 Microlunatus; f: Solirubrobacter; g, Solirubrobacteraceae; h, 纖維素降解菌屬 Chryseolinea; i, Vampirovibrionales; j, A0839; k: BCf3_20; l, 紅假單胞菌屬 Rhodopseudomonas; m, Kaistia; n, 玫瑰球菌屬 Roseococcus; o, 玫瑰單胞菌屬 Roseomonas; p, 伯克氏菌屬 Paucimonas; q, Bdellovibrio_sp_ETB; r, Aetherobacter; s, Methylophaga

圖5 林下植被去除措施下基于分類等級樹的組間細(xì)菌種群差異展示圖Fig.5 A diagram of bacterial population differences between groups based on taxonomic tree under undergrowth vegetation removalA, Saccharibacteria; b, Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11; c, Phytoplasma_sp_RYL_GD; d, 鏈球菌屬 Streptococcus; e, Rhodopila_globiformis

由圖5可知,林下植被去除林分中,CK處理下的杉木凋落葉無顯著差異細(xì)菌種群；N1處理下相對豐度顯著較高的細(xì)菌種群為鏈球菌屬(Streptococcus)和Rhodopila_globiformis,分別從屬于厚壁菌門和變形菌門的紅球狀菌屬(Rhodopila)；N2處理下相對豐度顯著較高的細(xì)菌種群為Phytoplasma_sp_RYL_GD和Saccharibacteria門,Phytoplasma_sp_RYL_GD從屬于放線菌門沼桿菌屬(Patulibacter)；N3處理下相對豐度顯著較高的細(xì)菌種群為Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11,Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11從屬于酸桿菌門Acidicapsa屬。

2.5 杉木凋落葉化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌多樣性指數(shù)的相關(guān)分析

由表6可知,杉木凋落葉C/P比值與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈顯著正相關(guān)；鉀含量與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)和呈顯著負(fù)相關(guān),與Goods_coverage指數(shù)呈顯著正相關(guān)；鈣含量與Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)呈極顯著正相關(guān)；鎂含量與Ace指數(shù)呈顯著正相關(guān),與Goods_coverage指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)；錳含量與Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。

表6 杉木人工林凋落葉化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌群落多樣性的相關(guān)性

2.6 杉木凋落葉化學(xué)性質(zhì)與主要細(xì)菌種群相對豐度的相關(guān)分析

由圖6可知,在門分類水平,變形菌相對豐度與杉木凋落葉全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān),與C/N比值呈極顯著正相關(guān),與C/P比值呈顯著正相關(guān)；放線菌相對豐度與全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān),與C/N和C/P比值呈極顯著負(fù)相關(guān)；浮霉菌相對豐度與全鎂含量呈顯著正相關(guān)；酸桿菌相對豐度與N/P比值呈顯著正相關(guān)；擬桿菌門相對豐度與全碳含量、C/N比值和C/P比值呈極顯著正相關(guān),與全氮含量和全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)；綠彎菌相對豐度與全鎂含量呈顯著負(fù)相關(guān)；疣微菌相對豐度與全碳含量和C/N比值呈顯著正相關(guān)；芽單胞菌相對豐度與全錳含量呈顯著正相關(guān)；裝甲菌相對豐度與全氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān),與C/N比值呈顯著正相關(guān)?？梢娫陂T分類水平,杉木凋落葉C/N比值與主要細(xì)菌種群相對豐度的相關(guān)性最高。

在屬分類水平,嗜酸棲熱菌相對豐度與杉木凋落葉全碳含量和C/N比值呈極顯著負(fù)相關(guān),與全氮含量呈顯著正相關(guān),與全鉀含量呈極顯著正相關(guān)；Singulisphaera屬相對豐度與全鎂含量呈極顯著正相關(guān)；鞘氨醇單胞菌相對豐度與全碳含量和C/N比值呈極顯著正相關(guān),與全氮含量和呈顯著負(fù)相關(guān),與全鉀含量呈極顯著負(fù)相關(guān)；Jatrophihabitans屬相對豐度與全碳含呈極顯著負(fù)相關(guān),與C/N和C/P比值呈顯著負(fù)相關(guān),與全鎂含量呈極顯著正相關(guān)；游動(dòng)放線菌相對豐度與全錳含量呈顯著正相關(guān)；沼桿菌相對豐度與全碳含量和C/N比值呈顯著正相關(guān),與全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)；Acidicapsa屬相對豐度與全鎂含量呈顯著正相關(guān)；Terracidiphilus屬相對豐度與全碳含量呈顯著負(fù)相關(guān),與C/N比值呈極顯著負(fù)相關(guān),與全鉀含量呈極顯著正相關(guān)；紅球狀菌相對豐度與N/P比值呈顯著正相關(guān)；蛭弧菌(Bdellovibrio)相對豐度與全碳含量和C/N比值呈極顯著正相關(guān),與C/P和N/P比值呈顯著正相關(guān),與全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)；中村氏菌相對豐度與全鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)；小月菌屬相對豐度與杉木凋落葉全錳含量呈顯著正相關(guān)；Aetherobacter屬相對豐度與全磷含量呈顯著正相關(guān),與全錳含量呈極顯著正相關(guān)?？梢娫趯俜诸愃?杉木凋落葉全碳含量、C/N比值和全鉀含量與主要細(xì)菌種群相對豐度的相關(guān)性最高。

圖6 杉木凋落葉化學(xué)性質(zhì)與主要細(xì)菌種群相關(guān)性熱圖Fig.7 Heat map of correlation between main bacterial population and chemical properties of Cunninghamia lanceolata littersTC, 全碳 Total carbon; TN, 全氮 Total nitrogen; TP, 全磷 Total phosphorus; C/N, 碳氮比 C/N ratio; C/P, 碳磷比 C/P ratio; N/P, 氮磷比 N/P ratio; TK, 全鉀 Total potassium; TCa, 全鈣 Total calcium; TMg, 全鎂 Total magnesium; TMn, 全錳 Total manganese, * P<0.05, ** P<0.01

2.7 杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響因子分析

本研究使用了典范對應(yīng)分析(CCA,Canonical correspondence analysis)和方差分解分析(VPA,Variance partitioning analysis)研究杉木凋落葉化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌群落之間關(guān)系。由圖7可知,在門分類水平上第一主坐標(biāo)軸解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)30.7%的變異,第二主坐標(biāo)解釋了23.9%的變異,除全鈣含量外,其余指標(biāo)與杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異均具有較高的相關(guān)性,全碳含量、全氮含量,C/N比值、C/P比值、N/P比值、全鉀含量、全鎂含量和全錳含量對門分類水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的解釋度分別為：9.8%、6.2%、2.2%、20.9%、17.2%、4.8%、3.6%、3.5%和1.8%。屬分類水平上,第一主坐標(biāo)軸解釋了細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)44.1%的變異,第二主坐標(biāo)解釋了31.3%的變異,其中杉木凋落葉全碳含量、全氮含量,C/N比值、C/P比值、全鉀含量和全鎂含量與杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的相關(guān)性較高,以上指標(biāo)對屬分類水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的解釋度分別為：11.0%、7.5%、12.8%、5.1%、16.1%和0.3%。

圖7 杉木凋落葉細(xì)菌種群典范對應(yīng)分析Fig.7 Canonical correspondence analysis of bacterial community of Cunninghamia lanceolata litters

3 討論

3.1 不同初始C/N比杉木凋落葉分解300 d后細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的差異

受底物質(zhì)量限制,杉木凋落物分解緩慢,周轉(zhuǎn)期普遍需要4—5年[24],本研究表明一定范圍內(nèi),初始C/N比的降低有利于杉木凋落葉的分解。由于固氮菌與纖維素分解菌存在著互生關(guān)系,后者為前者提供豐富的碳源,前者為后者提供氮元素[25],可見本研究中適量的外源氮輸入能夠提升凋落物質(zhì)量水平,滿足了分解者生命活動(dòng)所需的氮,從而加速了杉木凋落葉的分解。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為相比于真菌,細(xì)菌在凋落物分解后期起著更為主要的作用[26-27],但本研究Anosim檢驗(yàn)顯示,具有不同初始C/N比值的杉木凋落葉在分解300 d時(shí)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)已然具有明顯差異。分解300 d時(shí),變形菌門、放線菌門和浮霉菌門的相對豐度在各處理杉木凋落葉中相對豐度均大于10%,為主要優(yōu)勢種群,這與相關(guān)研究結(jié)果基本一致[28]。變形菌門和放線菌門是森林凋落物分解轉(zhuǎn)化的主要種群,2門細(xì)菌中多類細(xì)菌種群屬于腐生菌,參與纖維素和木質(zhì)素的分解[29-30],LEFse分析表明,變形菌門和放線菌門中多類細(xì)菌種群相對豐度在不同處理間的杉木凋落葉中具有顯著差異,且兩者相對豐度與杉木凋落葉C/N比值具有顯著相關(guān)關(guān)系。這可能表明變形菌門和放線菌門是杉木凋落葉在外源氮素調(diào)控下所影響的重要細(xì)菌門類,杉木凋落葉的初始C/N比影響著變形菌門和放線菌門的生長繁殖,進(jìn)而作用于杉木凋落葉分解。值得注意的是本研究結(jié)果表明,外源氮的輸入對于杉木凋落葉中變形菌門相對豐度具有低促高抑的作用,相關(guān)性分析則表明變形菌相對豐度與C/N比呈極顯著正相關(guān),而相關(guān)研究認(rèn)為變形菌門是一類富營養(yǎng)型菌[28]?？梢姰?dāng)C/N比過低時(shí)將導(dǎo)致其相對豐度的降低,這同樣可能是N3處理下的杉木凋落葉干質(zhì)量剩余率較高的重要原因。根據(jù)本課題組對該試驗(yàn)林分的土壤細(xì)菌的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)[17],相比于該林分土壤,杉木凋落葉中的浮霉菌門、擬桿菌門、裝甲菌門相對豐度顯著上升,產(chǎn)生該差異的原因可能是由于取樣時(shí)間的不同所導(dǎo)致,但更有可能是該幾門細(xì)菌直接或協(xié)同其他微生物種群參與了對杉木凋落葉的分解。細(xì)菌作為異養(yǎng)生物,由于其分解利用所喜好的有機(jī)化合物類型的差異,相比于土壤,參與纖維素和木質(zhì)素分解的細(xì)菌種群可能在杉木凋落葉中大量聚集生長,相對豐度明顯上升。而已有研究證實(shí)浮霉菌門和裝甲菌門具有降解多環(huán)芳烴類化合物的作用,促進(jìn)有機(jī)碳的礦化[31-32],擬桿菌門則具有直接參與木質(zhì)纖維素的降解[33]。在屬分類水平上,也同樣證實(shí)慢生根瘤菌屬、嗜酸棲熱菌屬、出芽菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等多類細(xì)菌為土壤中參與碳氮循環(huán)的重要細(xì)菌種群[34-37]。由于不同的樹種凋落物中所含碳源類型的不同,穩(wěn)定的林分環(huán)境驅(qū)使著土壤微生物集群定向進(jìn)化,形成所謂的主場效應(yīng)[28],故而杉木凋落葉實(shí)際上起到了細(xì)菌的培養(yǎng)基質(zhì)的作用,基本可認(rèn)定以上細(xì)菌是該地區(qū)杉木人工林生態(tài)系統(tǒng)主導(dǎo)凋落物分解的主要細(xì)菌種群。

外源氮的輸入對于杉木凋落葉細(xì)菌群落多樣性具有低促高抑的效應(yīng),外源氮的輸入為細(xì)菌提供了富營養(yǎng)生境,有利于杉木凋落葉的細(xì)菌群落多樣性的提升。但當(dāng)C/N比過低時(shí),將使得某些專性細(xì)菌大量繁殖,致使杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性下降。例如LEFse分析中就發(fā)現(xiàn)林下植被去除林分中N3處理下的杉木凋落葉中酸桿菌門中的Acidobacteriaceae_bacterium_SK_11,以及林下植被保留林分中N2處理下的酸桿菌門的Terracidiphilus屬的相對豐度顯著上升。酸桿菌屬嗜酸性細(xì)菌[38],這可能指示著外源氮的過量輸入導(dǎo)致細(xì)菌所處生境酸化,不利于其他細(xì)菌種群生存繁殖。就林分差異而言,林下植被保留林分中杉木凋落葉細(xì)菌群落的多樣性指數(shù)均高于林下植被去除林分中相同處理。Benizri等[39]研究表明,微生物多樣性與林內(nèi)物種多樣性呈顯著正相關(guān),杉木人工林群落結(jié)構(gòu)單一,豐富多樣的林下植被使得杉木人工林森林生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)趨于復(fù)雜,環(huán)境趨于異質(zhì)化,并有利于土壤中養(yǎng)分的積累,細(xì)菌種群也隨之增多。由于研究普遍認(rèn)為,微生物種群多樣性的提高有利于提升林分抗逆性和養(yǎng)分周轉(zhuǎn)能力[16],故而林下植被保留管理措施可能更有利于杉木人工林凋落物的分解。但值得注意的是,相比于林下植被去除林分,過低的初始C/N比對于林下植被保留林分中杉木凋落葉分解的抑制作用更為明顯,這可能與外源氮對于杉木凋落葉分解的調(diào)控作用受林分環(huán)境影響有關(guān)。與林下植被去除林分相比,林下植被保留林分中土壤氮含量較高,環(huán)境中氮的含量更易超過土壤微生物所需的閾值,細(xì)菌種群多樣性下降,進(jìn)而導(dǎo)致分解速率變緩。

杉木人工林目前面臨著土壤質(zhì)量下降、生產(chǎn)力降低、連栽更新障礙等困境,如何認(rèn)識杉木人工林土壤中的微生物差異和功能并在經(jīng)營管理中加以利用就顯得尤為重要。未來有必要采用功能基因組學(xué)技術(shù)在獲取微生物群落結(jié)構(gòu)信息的同時(shí),對其中有機(jī)碳降解以及氮磷循環(huán)等功能基因的多樣性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,從而對外源氮素調(diào)控下杉木凋落葉內(nèi)在的微生物分解機(jī)制有著更進(jìn)一步的研究。此外,由于杉木凋落葉周轉(zhuǎn)期較久,加之不同的微生物種群對于凋落物中碳源選擇能力的差異,不同分解階段微生物群落結(jié)構(gòu)有所不同,杉木凋落葉中的微生物群落結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步的跟蹤測定。

3.2 細(xì)菌群落多樣性與杉木凋落葉化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系

相關(guān)性分析表明在門和屬分類水平,均發(fā)現(xiàn)杉木凋落葉C/N比與主要細(xì)菌種群相對豐度的相關(guān)性最為緊密,表明對于細(xì)菌多類種群而言,適宜的碳氮計(jì)量比例對其具有重要意義。而鈣元素和鎂元素含量與杉木凋落葉細(xì)菌群落多樣性具有顯著相關(guān)性,表明除了碳、氮、磷以外,鈣、鎂等元素同樣是影響細(xì)菌群落多樣性的重要因子,其含量的提高可為更多的細(xì)菌生長提供有利的環(huán)境條件。典范對應(yīng)分析和方差分解分析表明,在門分類水平杉木凋落葉C/P比值和N/P比值對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布變異具有較高解釋度,在屬分類水平杉木凋落葉鉀含量對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布變異具有較高解釋度。驅(qū)動(dòng)生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中微生物的分解活動(dòng)需要多種化學(xué)元素以及適應(yīng)的養(yǎng)分計(jì)量比例,而磷元素和鉀元素同樣在其中發(fā)揮了重要作用[40-41]。通過對該林分土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的進(jìn)行測定,結(jié)果也同樣表明土壤全磷含量對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響顯著[17],本研究區(qū)地處亞熱帶,土壤多呈酸性反應(yīng),淋溶作用強(qiáng)烈,磷元素和鉀元素相對耗竭,在碳源和氮源充沛的條件下,兩者可能是該生態(tài)系統(tǒng)中影響杉木凋落葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異更為重要的限制因子。此外較多細(xì)菌種群相對豐度與鎂元素和錳元素含量呈顯著正相關(guān),如Singulisphaera屬、Jatrophihabitans屬、小月菌屬和Aetherobacter屬等。由于亞熱帶地區(qū)高溫多雨易造成土壤中鎂和錳的淋溶的缺乏,尤其主導(dǎo)木質(zhì)素分解的錳過氧化物酶本身就是一類需要錳元素參與合成的土壤胞外酶,而相關(guān)研究表明大約需要25種化學(xué)元素才能驅(qū)動(dòng)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中的樹木生長、分解、微生物繁殖[42],在未來的研究中其他中微量元素在凋落物分解過程中的重要作用應(yīng)加以重視。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn),凋落物的分解速率不僅受底物質(zhì)量的限制,與所在分解環(huán)境也密切相關(guān),在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)對林分環(huán)境,尤其是表層土壤中的化學(xué)元素含量需加以考量。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測序技術(shù),對不同林分環(huán)境中,不同C/N比杉木凋落葉分解300 d時(shí)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定,揭示了杉木人工林養(yǎng)分周轉(zhuǎn)的內(nèi)在微生物機(jī)理。結(jié)果表明變形菌門、放線菌門和浮霉菌門為本研究區(qū)分解杉木凋落葉主要細(xì)菌種群,杉木凋落葉初始C/N比值降低改變了變形菌門、放線菌門和酸桿菌門等細(xì)菌門中的多類細(xì)菌的相對豐度,進(jìn)而調(diào)控了杉木凋落葉的分解。林下植被保留措施下的杉木人工林杉木凋落葉細(xì)菌群落多樣性更高,更有利于杉木凋落葉的分解。

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