堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)小鼠慢性移植物抗宿主病的作用及其機(jī)制

劉一嵐，帥燕蓉，鄧 銳，何光翠，繆曉娟，范方毅

（解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院血液科，四川 成都 610038）

異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是部分遺傳性疾病或血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的主要方式，其可使患者后期出現(xiàn)慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）并發(fā)癥，對(duì)患者生活質(zhì)量造成影響，嚴(yán)重者可導(dǎo)致非復(fù)發(fā)死亡[1]。近年來(lái)移植供應(yīng)源主要為外周血干細(xì)胞和非血緣供者，加之受者年齡上限提高，cGVHD 發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[2，3]，因此明確cGVHD 發(fā)病機(jī)制尤為重要。隨著發(fā)病機(jī)制研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)B 細(xì)胞受體相關(guān)的信號(hào)通路和B 淋巴細(xì)胞活化與cGVHD 相關(guān)，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）是與之相關(guān)的治療方法，其為一群多功能細(xì)胞，具有多向分化潛能和自我更新能力，在造血干細(xì)胞移植后具有調(diào)節(jié)免疫級(jí)組織修復(fù)作用，其作用機(jī)制尚不完全明確，但可知與調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞和B 細(xì)胞有關(guān)。目前MSC 來(lái)源主要為骨髓或臍帶血體外傳代培養(yǎng)，具有一定臨床療效，但需要經(jīng)過(guò)多次輸注[4，5]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）也為多功能因子，在增殖MSC 方面具有關(guān)鍵作用[6]。本研究通過(guò)建立單倍體HSCT 后cGVHD 的小鼠模型，分析bFGF 調(diào)節(jié)小鼠cGVHD的作用及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 建立單倍體HSCT 后cGVHD 的小鼠模型 購(gòu)買(mǎi)8～10 周齡雌性C57BL/6 共36 只，實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、外源性MSC 治療組和bFGF 治療組，每組12只。所有動(dòng)物均在無(wú)菌恒溫恒濕條件下飼養(yǎng)。各組老鼠均給予Co605.5 Gy 全身照射的預(yù)處理，其次經(jīng)腹腔輸注供體小鼠10×107個(gè)脾細(xì)胞/只，空白對(duì)照組輸注0.5 ml RPMI1640 培養(yǎng)液。

1.2 流式細(xì)胞術(shù)cGVHD 相關(guān)免疫細(xì)胞檢測(cè) 將獲得的淋巴細(xì)胞濃度調(diào)1×105/100 μl，吸取100 μl 細(xì)胞懸液至流式檢測(cè)管中行抗體孵化，調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞表型以CD4、CD25 標(biāo)記，4 ℃條件下孵化30 min。孵化完畢后樣品給予PBS 清洗以去除多余抗體，重懸于200 μl PBS 液中上機(jī)檢測(cè)，細(xì)胞收獲總數(shù)為1×105，收獲速度200～300 cells/s，數(shù)據(jù)由FlowJo7.6 軟件分析完成。

1.3 ELISA 酶聯(lián)免疫細(xì)胞因子檢測(cè) 血漿層稀釋2～5倍。包被：用0.05 mol/L PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10 μg/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1 ml，4 ℃過(guò)夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3 次，3 min/次。加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1 ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37 ℃孵育1 h，然后洗滌，同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔。加酶標(biāo)抗體：于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體0.1 ml。37 ℃孵育0.5～1 h，洗滌。加底物液顯色：各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB 底物溶液0.1 ml，37 ℃10 min。終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2 mol/L 硫酸0.05 ml。結(jié)果判定：測(cè)O·D 值：在ELISA 檢測(cè)儀上，于450 nm（若以ABTS 顯色，則410 nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔O·D 值，計(jì)出相應(yīng)因子（IL-10、IL-12、TGF-β、TNF-α）濃度。

1.4 觀察指標(biāo) 比較三組cGVHD 臨床表現(xiàn)和小鼠生存情況、CD4+和CD25+細(xì)胞，并觀察間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以以（）表示，采用方差分析或t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生存情況 空白對(duì)照組移植后10 d 小鼠開(kāi)始死亡，17 d 內(nèi)小鼠全部死亡；對(duì)照組移植后13 d小鼠開(kāi)始死亡，19 d 內(nèi)小鼠全部死亡；實(shí)驗(yàn)組移植后15 d 小鼠開(kāi)始死亡，其中2 只小鼠生存時(shí)間超過(guò)30 d。實(shí)驗(yàn)組小鼠生存時(shí)間多于空白對(duì)照組和對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 三組cGVHD 臨床癥狀比較 空白對(duì)照組出現(xiàn)上述癥狀于小鼠移植后8 d；對(duì)照組出現(xiàn)上述癥狀于小鼠移植后8 d；實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)上述癥狀于小鼠移植后10 d。實(shí)驗(yàn)組cGVHD 臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)間晚于對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 三組cGVHD 白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 三組移植后3 d白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；三組移植后6、9、12、14、15 d 白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組移植后下降速度較慢，空白對(duì)照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降速度較快，且移植后15 d 白細(xì)胞計(jì)數(shù)仍＞0.5×109/L，見(jiàn)表1。

2.4 三組cGVHD 體重減輕情況比較 移植后7 d，空白對(duì)照組體重減輕程度高于對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；移植后14 d，空白對(duì)照組、對(duì)照組體重減輕程度與對(duì)照組體重減輕程度高于實(shí)驗(yàn)組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但空白對(duì)照組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.5 三組IL-10、IL-12、TNF-β 和TNF-α 比較 對(duì)照組TNF-α、TNF-β 與實(shí)驗(yàn)組比較，空白對(duì)照組TNFα 與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組IL-10 和IL-12 均高于空白對(duì)照組和對(duì)照組，TNF-α 高于空白對(duì)照組，TNF-β 低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

2.6 三組CD4+和CD25+細(xì)胞比較 實(shí)驗(yàn)組CD4+和CD25+細(xì)胞水平高于空白對(duì)照組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

2.7 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) 間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，移植后14 d，對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞無(wú)法集落和繼續(xù)生長(zhǎng)，而實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)大量細(xì)胞集落且良好生長(zhǎng)，光鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀且貼壁，細(xì)胞核緊密團(tuán)結(jié)，見(jiàn)圖1。

3 討論

cGVHD 為HSCT 治療后嚴(yán)重并發(fā)癥，其對(duì)患者生命和健康造成較大威脅，如何預(yù)防和治療cGVHD成為臨床研究熱點(diǎn)和重要課題[7]。目前，細(xì)胞療法為預(yù)防和治療cGVHD 常用方法，其中MSC 最受關(guān)注。研究證實(shí)[8]，MSC 因?qū)γ庖吖δ芎驮煅?xì)胞增殖、分化及成熟具有調(diào)節(jié)作用，可有效預(yù)防急性移植物抗宿主?。╝GVHD），但是否對(duì)cGVHD 有效尚不可知。另研究發(fā)現(xiàn)[9-11]，MSC 可以抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)絲裂原，升高CD8+和CD28-調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞亞群比例，促進(jìn)CD5+調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞增殖且抑制其凋亡，提高IL-10 分泌水平，降低血清B 細(xì)胞表面受體的表達(dá)和B 細(xì)胞激活因子（BAFF）水平，誘導(dǎo)免疫耐受。李瀟等[12]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞在cGVHD 的發(fā)病中起重要作用。bFGF 為廣譜的有絲分裂原，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞等多種起源于中胚層、神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增殖分化起刺激和調(diào)節(jié)作用[13，14]，還可促進(jìn)血管生成和神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，協(xié)同其他造血生長(zhǎng)因子共同促進(jìn)造血細(xì)胞體外克隆形成。

表1 三組cGVHD 白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（，×109/L）

表1 三組cGVHD 白細(xì)胞計(jì)數(shù)比較（，×109/L）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較，bP＜0.05

表2 三組cGVHD 體重減輕情況比較（，g）

表2 三組cGVHD 體重減輕情況比較（，g）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，bP＜0.05

表3 三組IL-10、IL-12、TGF-β 和TNF-α 比較（）

表3 三組IL-10、IL-12、TGF-β 和TNF-α 比較（）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，bP＜0.05

表4 三組CD4+和CD25+細(xì)胞比較（，%）

表4 三組CD4+和CD25+細(xì)胞比較（，%）

注：與對(duì)照組相比，aP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組相比，bP＜0.05

圖1 經(jīng)bFGF 處理的小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

本研究通過(guò)建立單倍體HSCT 后cGVHD 的小鼠模型，將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、對(duì)照組（外源性MSC 治療組）和實(shí)驗(yàn)組（bFGF 治療組）并觀察各組小鼠生存情況和cGVHD 臨床表現(xiàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組小鼠生存時(shí)間多于空白對(duì)照組和對(duì)照組，cGVHD臨床癥狀出現(xiàn)時(shí)間晚于對(duì)照組和空白對(duì)照組，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組移植后下降速度較慢，空白對(duì)照組白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降速度較快，且移植后15 d 時(shí)白細(xì)胞計(jì)數(shù)仍＞0.5×109/L，提示注射適量bFGF 對(duì)cGVHD 發(fā)生起一定延緩作用，對(duì)cGVHD 臨床癥狀發(fā)生起明顯減輕作用，可延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，減少預(yù)處理的損害[15-17]。此外，本研究通過(guò)對(duì)MSC 培養(yǎng)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后實(shí)驗(yàn)組見(jiàn)大量細(xì)胞集落且良好生長(zhǎng)，光鏡下見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀且貼壁，細(xì)胞核緊密團(tuán)結(jié)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)的細(xì)胞為MSC，具備較強(qiáng)的誘導(dǎo)分化能力。本研究發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組CD4+和CD25+細(xì)胞水平高于空白對(duì)照組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組IL-10 和IL-12 均高于空白對(duì)照組和對(duì)照組，TNF-α 高于空白對(duì)照組，TNF-β 低于空白對(duì)照組（P＜0.05），提示bFGF 通過(guò)增加CD4+和CD25+細(xì)胞調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞分泌、促進(jìn)IL-10、IL-12 和TNF-α 分泌和減少TNF-β 分泌，從而對(duì)GVHD 發(fā)生起延緩作用，證實(shí)bFGF 可延緩GVHD 發(fā)生時(shí)間，穩(wěn)定造血微環(huán)境，減輕預(yù)處理的損傷作用，延長(zhǎng)小鼠的生存時(shí)間，減輕GVHD 嚴(yán)重程度，促進(jìn)MSC 體內(nèi)增殖和活性[18-20]。

綜上所述，bFGF 對(duì)cGVHD 具有調(diào)節(jié)作用，其通過(guò)促進(jìn)單倍體HSCT 供者來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)增殖，使調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性B 細(xì)胞和骨髓來(lái)源的抑制細(xì)胞增殖，從而調(diào)節(jié)cGVHD，延緩其發(fā)生。