肖生鴻，鄧倩儀，黃潔婷，賴少娟，黃真池

(嶺南師范學院 生命科學與技術學院，廣東 湛江 524048)

近年來，土壤重金屬污染日趨嚴重，重金屬對植物生長發(fā)育的影響已經引起了廣泛關注[1]。重金屬脅迫引起植物細胞中保護酶的活性和抗氧化劑含量的改變，如超氧化物歧化酶(SOD)，過氧化氫酶(CAT)，過氧化物酶(POD)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等活性的改變和還原型谷胱甘肽(GSH)、苯丙氨酸等含量的變化[2]，打破活性氧(reactive oxygen species ,ROS)代謝平衡，引起ROS大量爆發(fā)[3]。脅迫條件下植物的抗氧化能力升高可增強重金屬抗性[4]。逆境下植物的基因表達會發(fā)生變化，啟動或加強與逆境相適應的基因表達，合成脅迫蛋白以增強抗性[5]。

地殼中Hg2+的平均含量為0.08 mg/kg，我國南方土壤Hg2+含量較低，一般非污染土壤表土含Hg2+不超過0.04 mg/kg，但受污染的土壤中Hg2+含量可能高得多[6]。Hg2+是植物的非必需元素，具有持久性、易遷移性、高度的生物富集性、強毒性等特性。當濃度超過防御體系的飽和程度后，汞離子會通過不同途徑干擾和破壞細胞的正常代謝[7]，改變生理生化進程，影響植物生長發(fā)育。

桉樹屬桃金娘科(Myrtaceae)，包括杯果木屬(Angophora)、傘房屬(Corymbia)和桉樹屬(Eucalyptus)[8]。桉樹具有耐干旱和瘦瘠，輪伐期短，用途廣泛，經濟效益高等諸多優(yōu)點，被公認為三大人工林樹種之一[9]。據國家林草局第九次全國森林資源清查結果，截至2018年，全國桉樹面積為546萬hm2。我國年產桉樹木材3 000萬m3以上，被廣泛用做鋸材、膠合板材、造船材和紙漿材等[10-11]。桉樹產業(yè)在維護國家木材安全，促進國民經濟發(fā)展，發(fā)揮生態(tài)防護作用，幫助農村脫貧致富等方面貢獻巨大。

隨著桉樹木材需求的不斷增加，桉樹栽種面積需更快地擴大。但桉樹起源于熱帶，大部分樹種不能承受我國長江以北的低溫環(huán)境[12]。我國南方省份礦區(qū)的重金屬污染形勢嚴峻，主要是Cd、Pb、As、Cr、Hg等重金屬污染，生態(tài)風險嚴重[13]。研究重金屬脅迫對桉樹生長發(fā)育的影響和相關機理，可為在我國南方重金屬污染礦區(qū)栽種桉樹復綠和生態(tài)修復提供參考。目前已有學者對桉樹在重金屬脅迫下的表面毒性效應、耐性機制等研究上作了相關的探討。游秀花等[14]報道，不同質量分數的Cu、Zn、Cd對我國南方重要造林樹種鄧恩桉、本沁桉、巨桉與直桿藍桉的種子發(fā)芽與根伸長均存在抑制效應。韋月越等[15]研究發(fā)現，根部的滯留作用、根部的吸收限制、細胞壁固持作用及可溶組分的區(qū)隔化作用，是桉樹耐受污染土壤中Cu和Cd的主要機制。但有關汞脅迫對桉樹生長代謝影響的研究鮮有報道。本研究探討汞脅迫對桉樹保護酶活性及基因表達的影響，旨在為桉樹重金屬抗性生理的研究積累資料。

1 材料與方法

廣林9號桉(GL9:Eucalyptusgrandis×Eucalyptusurophylla)3月齡的無性系幼苗，栽種于250 mL輕型基質(泥炭土∶蛭石=1∶1)，緩苗5 d期間澆透1 g/L復合肥。緩苗后取長勢基本一致的盆栽苗，隨機分為3組，每組12盆，每天早晚用50 mL HgCl2溶液澆灌處理，濃度分別為25、50、75 μmol/L，對應低、中、高濃度。對照組(CK)澆等量自來水。澆灌處理15 d后測量株高并采集自頂芽下第4片展開的成熟葉片，去中脈后用于生理指標測定。

葉綠素質量分數測定：隨機在同組植株中的4株任取1片自頂芽下第4片展開的成熟葉片，去中脈，等質量混合并剪成細絲。稱取100 mg細絲置于具塞試管，加10 mL 95%乙醇，暗處26℃浸泡24 h。測A649、A665，將值代入公式Cchl(mg/L)=6.63A665+18.08A649計算葉綠素濃度，求出葉綠素質量分數。

酶活性測定：稱取0.2 g葉片(每個處理3次重復)，加100 mg PVPP，4 mL酶提取液(50 mmol/L pH 7.0 Tris-HCl緩沖液，1 mmol/L EDTA，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L β-巰基乙醇)，冰浴勻漿后，將勻漿液4℃，8 000 r/min離心10 min，所得上清即為粗酶液。POD活性，CAT活性，GPX活性測定參考文獻[16]的方法，MDA質量摩爾濃度的測定采用硫代巴比妥酸顯色法[17]。

RNA提取和反轉錄：稱取50 mg的去中脈葉片，于液氮中研磨至細粉，加入1 mL RNAiso-mate for Plant Tissue勻漿。按RNAiso Plus試劑說明書步驟提取總RNA，并用Nanodrop 2000c檢測總RNA的質量和濃度。反轉錄按文獻[18]的方法進行，得到初始cDNA，備用。所有試劑均是寶生物工程(大連)有限公司產品。

目的基因選擇及引物設計：根據The RedoxiBase (http://peroxibase.toulouse.inra.fr/)和Phytozome 12(https://phytozome.jgi.doe.gov/)數據庫中POD、CAT、GPX3類保護酶基因的序列，用Primer3plus軟件設計qPCR引物。經qPCR預試驗從POD、CAT、GPX3類基因中篩選出9個(每類3個)特異性好，擴增效率高的基因作目的基因。內參基因RTEF和3類9個保護酶基因的編號和引物序列見表1。

qPCR擴增：qPCR反應儀器為CFX-96 Touch (Bio-Rad)；反應體系25 μL，分別是SYBR PremixTaqTMⅡ 12.5 μL，10 μmol/L Primer F和Primer R各1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA模板2 μL。按文獻[15]的方法進行qPCR。用2-ΔΔCt法[19]計算基因相對表達量。

表1 內參基因和3類9個保護酶基因的編號和引物序列Table 1 Number and primer sequence of internal reference gene and three types of nine protective enzyme genes

2 結果與分析

2.1 Hg2+脅迫下廣林9號桉株高、葉綠素質量分數、MDA含量和3種保護酶活性變化

Hg2+脅迫下，廣林9號桉株高略有下降，葉綠素質量分數變化不明顯，各濃度處理與對照間均無顯著性差異。隨著Hg2+濃度增大，廣林9號桉MDA含量明顯升高(表2)。75 μmol/L Hg2+處理后MDA含量高達27.88 nmol/g，是50 μmol/L Hg2+處理后MDA含量的2.3倍，是對照的3.35倍。Hg2+脅迫影響廣林9號桉保護酶的活性(表2)。與對照相比：不同濃度Hg2+處理后的廣林9號桉GPX活性均降低；POD活性變化無顯著差異，呈低濃度下活性升高，高濃度時活性降低的趨勢；50 μmol/L Hg2+處理后，CAT活性降低，為對照的80.10%。表2結果說明汞脅迫對桉樹植株生理指標的影響與濃度有關，不同種類的保護酶活性受Hg2+脅迫的影響不盡相同。Hg2+脅迫影響保護酶活性，打破ROS代謝平衡，引起膜脂過氧化，導致MDA積累。

表2 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號桉株高、葉綠素質量分數、MDA含量和3種保護酶活性變化Table 2 Changes of plant height,chlorophyll content,MDA content and three protective enzymes activities of GL9 under the stress of different Hg2+concentrations

2.2 Hg2+脅迫下廣林9號桉POD類基因的轉錄水平變化

Hg2+脅迫下，POD1基因的轉錄被顯著抑制(表3)。隨Hg2+脅迫強度的增加，POD2轉錄水平呈先下降后上升的趨勢。低、中、高濃度Hg2+脅迫下，POD3基因對應的相對表達量分別為6.81、3.19、2.31。隨著濃度增大，Hg2+對POD3基因誘導表達作用減弱，反映Hg2+濃度越大，毒害作用越大。Hg2+脅迫下不同POD基因的轉錄變化不同可能與基因產物在細胞中的定位及主要生理作用有關。

表3 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號桉3個POD基因轉錄水平變化Table 3 Transcriptional level changes of three POD genes of GL9 under the stress of different Hg2+ concentrations

2.3 Hg2+脅迫下廣林9號桉CAT類基因的轉錄水平變化

Hg2+脅迫下，CAT1基因和CAT3基因的轉錄被顯著抑制，且表現為Hg2+濃度增大，抑制作用增強(表4)，進一步說明Hg2+毒性強弱與濃度密切相關。Hg2+脅迫增強了CAT2基因的轉錄，但隨著Hg2+濃度增大，誘導作用減弱。CAT2基因的轉錄水平升高有利于CAT酶活性的升高，減少汞脅迫引起的H2O2積累，減輕膜脂過氧化的傷害。

表4 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號桉3個CAT基因轉錄水平變化Table 4 Transcriptional level changes of three CAT genes of GL9 under the stress of different Hg2+ concentrations

2.4 Hg2+脅迫下廣林9號桉GPX類基因的轉錄水平變化

低濃度Hg2+處理誘導GPX1和GPX2的轉錄水平升高。當Hg2+濃度升高到50 μmol/L或75 μmol/L時，毒性增強，對GPX1基因的誘導作用減弱，對GPX2基因的轉錄表現為抑制。用低，中，高濃度的Hg2+處理后，均明顯抑制了GPX3的轉錄表達，其相對表達量分別為0.14、0.07、0.05(表5)。GPX類基因的轉錄水平與Hg2+濃度密切相關，不同Hg2+濃度下基因表達變化與酶活性變化相同。試驗檢測的9個基因中，GPX3基因的轉錄受汞脅迫的抑制最顯著。其相對轉錄水平高低可作為評估桉樹受汞脅迫毒害程度的重要參考。Hg2+脅迫下GPX3基因表達變化程度也可作為篩選Hg2+脅迫耐受品種的指標。

表5 不同濃度Hg2+脅迫下廣林9號桉3個GPX基因轉錄水平變化Table 5 Transcriptional level changes of three GPX genes of GL9 under the stress of different Hg2+ concentrations

3 結論與討論

Hg2+是毒性最強的重金屬元素之一，有較高的擴散性和脂溶性，能改變細胞膜的透性，對蛋白質的巰基、核酸中的磷酸基具有高親和力。當植物體內汞積累到一定程度后，就會破壞細胞的結構和功能，抑制酶的活性，影響蛋白質合成，對植物細胞的生理活動和生化反應造成傷害[20-21]。

MDA是膜脂過氧化作用的重要產物之一，是反映細胞膜脂過氧化程度的重要指標[22]。當植物受到脅迫時，質膜的組成和完整性遭到破壞，細胞內產生大量的ROS，引起膜質的過氧化，使得MDA的含量大幅度地上升。為了減輕ROS傷害，植物體內應激產生保護作用，激活抗氧化系統。因此在一定程度上MDA含量的高低可以表示植物體內自由基的量態(tài)和植物對逆境條件反應的強度[23]。本研究表明，Hg2+脅迫可以促進MDA的產生，且隨著處理濃度的增加，MDA含量的上升幅度越大。高濃度Hg2+處理后，MDA含量高達27.88 nmol/g，是對照的3.35倍，說明細胞內的自由基積累量增多，膜脂過氧化作用增強，生物膜結構受到損傷。

Hg2+脅迫影響基因的表達。Hedenreich 等[28]發(fā)現Hg2+誘導的編碼蛋白質的基因參與葉綠素合成、細胞壁代謝、P450介導的次生代謝物的生物合成。水稻中過表達OsTCTP基因增強了抗氧化酶的活性，降低Hg2+誘導的活性氧，從而減輕ROS的傷害，提高水稻對Hg2+脅迫的耐受性；敲除OsTCTP基因則有相反的結果[29]。汞脅迫下豌豆根中POD基因明顯上調[30]。本研究中，POD3、CAT2和GPX1的轉錄均上調。在逆境下，植物的抗氧化酶含量因氧化損傷而減少，通過誘導抗逆相關基因表達上調，可以緩解脅迫造成的傷害。低濃度Hg2+處理后POD3、CAT2、GPX1的相對表達量分別為6.81、4.58和2.56；高濃度Hg2+處理后POD3，CAT2，GPX1的相對表達量分別為2.31、2.02和1.08，表明低濃度下的基因轉錄上調更顯著。低濃度Hg2+誘導累積的少量活性氧可能作為細胞中的信號轉導分子參與細胞抗氧化應答，誘導POD3、CAT2、GPX1的應激性轉錄上調，維持活性氧代謝平衡，減輕Hg2+毒害。但在高濃度的Hg2+脅迫下，抗氧化系統無法清除由Hg2+脅迫引起的嚴重氧化應激，活性氧積累過多，導致抗氧化系統受損，從而不同程度地降低抗氧化酶基因的轉錄表達水平[31]。Hg2+脅迫使廣林9號桉的其他6個保護酶基因轉錄總體呈下調趨勢，但也表現為低濃度處理高于高濃度處理。

Hg2+脅迫影響保護酶活性，打破ROS代謝平衡，引起膜脂過氧化，導致MDA積累。POD、CAT、GPX 3類保護酶活性受Hg2+脅迫的影響不盡相同。Hg2+脅迫下保護酶基因的表達變化各不相同。檢測的9個基因中，6個基因的轉錄受Hg2+脅迫抑制，POD3、CAT2、GPX1 3個基因受Hg2+脅迫誘導，且均表現出隨Hg2+濃度增大誘導作用減弱的趨勢。Hg2+脅迫對GPX3基因轉錄的抑制最顯著，檢測其轉錄水平可評估毒害程度，或作為篩選汞脅迫耐受品種的指標。本試驗為桉樹重金屬抗性生理的研究積累了資料，可為在我國南方重金屬污染礦區(qū)栽種桉樹復綠和生態(tài)修復提供參考。