許 慧， 高慧娟， 蔡雨衡， 蘇可欣， 劉浩杰， 程 凱

(湖北工業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院/河湖生態(tài)修復(fù)與藻類利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430068)

自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌(Autotrophic ammonia oxidizing bacteria，AOB)通過將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝氮，在氮循環(huán)中起重要作用[1-2].但由于AOB生長緩慢，代時(shí)長達(dá)8～14 h[3-10]，且受外界環(huán)境影響較大，因此氨氧化被認(rèn)為是硝化反應(yīng)的限速步驟[1-2].盡管AOB在絕大多數(shù)污水處理設(shè)施中的脫氮能力微弱，但其氨氧化能力突出，所積累的亞硝氮更是實(shí)施新型生物脫氮工藝(如厭氧氨氧化和短程反硝化等)的必要前提.

溫度是影響AOB代謝的重要的因素，多數(shù)AOB的適宜溫度不高于35 ℃[11-16]，僅有少量報(bào)道指出在溫泉、堆肥和原油中存在能適應(yīng)高溫的AOB[17-20]：Chikako和Elena分別從堆肥和溫泉中獲得了能夠在50 ℃和55 ℃生長的AOB富集物[17-18]；Hui等也發(fā)現(xiàn)55～75 ℃的地下原油中所具有的氨氧化活性與耐熱AOB有關(guān)[20].但迄今為止，對耐熱AOB純菌種的報(bào)道僅有2例：Jones等在河口分離得到了一株AOB，其在40 ℃時(shí)的氨氧化活性最高[21]；Yoshikane等人則從熱電廠活性污泥中分離得到了一株在48 ℃仍具有氨氧化活性的AOB[22].

目前國內(nèi)對于耐熱AOB的研究還很少，僅王艷等人“初步”鑒定了一株在50 ℃固體培養(yǎng)條件下生長的AOB，但該菌在液體培養(yǎng)基中的氨氧化活性非常微弱[23].顯然，高溫條件下的活性不穩(wěn)定是導(dǎo)致難以分離耐熱AOB的主要原因[22].考慮到印染等行業(yè)和低緯度地區(qū)夏季均存在高溫污水脫氨的需求[13]，因此值得深入研究在高溫條件下具有穩(wěn)定氨氧化活性且生長較快的AOB.

本文分離得到了一種在高溫條件下性狀穩(wěn)定的AOB富集物，研究了其最適生長溫度，測試了其在不同溫度下對不同污水的氨氧化效果，為該類型AOB的深入理論研究和實(shí)際工程應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

培養(yǎng)基參考Bollmann和Koops等的方法配制[24-25]，為無機(jī)自養(yǎng)培養(yǎng)基，其固體培養(yǎng)基為另加0.9%的瓊脂糖，在121 ℃濕熱滅菌20 min后備用.

1.2 富集培養(yǎng)和分離純化

生活污水采自湖北大學(xué)，按1%的比例接種于培養(yǎng)基中，27 ℃，160 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng).每7 d檢測亞硝氮積累情況，將陽性培養(yǎng)液按1%轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)3輪.再將陽性富集液涂布平板，27 ℃培養(yǎng)，由于AOB(屬于自養(yǎng)微生物)生長緩慢，需培養(yǎng)20 d后挑取單菌落進(jìn)行振蕩擴(kuò)培.

1.3 PCR與測序

使用HiPure Soil DNA Kit B試劑盒提取樣品DNA，使用Qubit? dsDNA HS Assay Kit檢測DNA濃度.16S rDNA的V3-V4 區(qū)的PCR擴(kuò)增采用上游引物5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′和下游引物5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′[26].反應(yīng)體系25 μL：TransStart Buffer 2.5 μL，dNTP混合液2 μL，上下游引物各1 μL，TransStart Taq DNA 0.5 μL，模板2 μL，超純水16 μL.反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 °C變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，72℃最終延伸5 min，24個循環(huán).PCR產(chǎn)物由江蘇金唯智生物科技有限公司高通量測序.

amoA基因的PCR擴(kuò)增采用的引物為amoA-1F-GGGGTTTCTACTGGTGGT和amoA-2R-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC[27].反應(yīng)體系50 μL：2×San Taq PCR Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板4 μL，超純水17 μL.反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，54 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35循環(huán).PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)有限公司測序.

上述測序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫 Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對后，再采用MEGA5.1的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.4 溫度對富集培養(yǎng)物生長的影響

1.4.1 在培養(yǎng)基中的測試 將菌液按5%的體積比接入100 mL培養(yǎng)基中，于39 ℃，160 r·min-1搖床培養(yǎng)，每24 h取樣1 mL測定亞硝氮濃度，當(dāng)亞硝氮積累速度達(dá)到50～100 mg·L-1·d-1時(shí)，將其作為接種液.將接種液按3%的體積比接種至1 300 mL培養(yǎng)基中后，再將其分裝至250 mL錐形瓶中(每瓶100 mL)，分別在34 ℃、37 ℃、40 ℃和43 ℃條件下，160 r·min-1搖床培養(yǎng)，每24 h取樣1 mL測定亞硝氮濃度(ρ，mg·L-1)，并據(jù)此計(jì)算比生長速度(μ，h-1)和代時(shí)(T，h)[3，11]：μ=(lnvn-lnvn-1)/24，其中vn為亞硝氮積累速度(mg·L-1·h-1)，其計(jì)算方法為vn=(ρt-ρt-1)/24；T=ln2/μ.

1.4.2 在垃圾滲濾液中的測試 污水為來自湖南某垃圾填埋場的垃圾滲濾液，其氨氮濃度約為400 mg·L-1.將前述1.4.1中的接種液按2%的體積比接種至1 000 mL垃圾滲濾液中，再將其分裝至250 mL錐形瓶中(每瓶100 mL)，分別在37 ℃、40 ℃和43 ℃條件下，160 r·min-1搖床培養(yǎng)，每12 h取樣測定亞硝氮濃度，對照組不接菌.

1.5 鹽度對脫氨活性的影響

向5個500 mL的錐形瓶各分裝300 mL無NaCl的培養(yǎng)基，分別加0.75 g，1.5 g，3 g，6 g和12 g的NaCl(鹽度分別為0.25%，0.5%，1%，2%，4%)，再用1 mol·L-1的鹽酸/碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.8.將調(diào)好pH的培養(yǎng)基分裝至250 mL錐形瓶中(每瓶100 mL)，按1%體積比接種菌液，27 ℃，160 r·min-1搖床培養(yǎng)至48 h取樣1 mL測氨氮，并計(jì)算相對脫氨效率(以脫氨量最大組的相對脫氨效率計(jì)為100%).

1.6 亞硝氮濃度對脫氨活性的影響

1.7 在低氨地表水中的脫氨效果

地表水來源為武漢市蘆灣湖(富營養(yǎng)化湖泊)、武泰閘(黑臭河道)和南湖港(富營養(yǎng)化河道)，向100 mL各來源的地表水接種對數(shù)期的SN-6使其初始氨氮去除速率達(dá)到約0.1 mg·L-1·h-1，對照組不接菌，150 r·min-1搖床培養(yǎng)，為了有效模擬地表水的實(shí)際情況，將培養(yǎng)溫度設(shè)為27 ℃，每天測氨氮和亞硝氮濃度.

1.8 數(shù)據(jù)分析方法

氨氮的測量使用納氏試劑分光光度法[28]，亞硝氮的測量使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法[28]；所有試驗(yàn)均設(shè)三平行，用Origin 2017 作圖，圖中的誤差量均用SE表示；用SPSS 24進(jìn)行方差分析(多重比較采用LSD法)，對于部分不服從正態(tài)分布或方差齊性的數(shù)據(jù)，經(jīng)對數(shù)或者平方轉(zhuǎn)化后再進(jìn)行方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 富集物中的AOB種屬

經(jīng)16S rDNA高通量測序，發(fā)現(xiàn)本富集物中僅含一種AOB，其在總菌中的豐度為75%，其16S rDNA序列(Genbank序列號為MN396244，其進(jìn)化樹見圖1a)與Nitrosomonasnitrosa Nm 90的同源性最高(Identity為100%)，故命名為N.nitrosaSN-6.類似的，其amoA基因序列(Genbank序列號為MN397165，其進(jìn)化樹見圖1b)與N.nitrosaNm 90的同源性也高達(dá)100%.

圖1 基于部分16S rDNA序列(a)和amoA基因序列(b)的N. nitrosa SN-6的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of N. nitrosa SN-6 based on its partial 16S rDNA (a) and amoA gene (b) sequence

2.2 溫度對生長的影響

在培養(yǎng)基中，如圖2(a)，37 ℃和40 ℃更有利于亞硝氮的積累.方差分析也表明，溫度對亞硝氮濃度有顯著性影響(P<0.05)：48 h時(shí)，40 ℃的亞硝氮濃度顯著高于34 ℃、37 ℃和43 ℃(P<0.05)；72 h時(shí)，40 ℃的亞硝氮濃度顯著高于34 ℃和43 ℃，37 ℃的亞硝氮濃度也顯著高于43 ℃(P<0.05).此外，各溫度組的最大比生長速率和最短代時(shí)均出現(xiàn)在24 h～48 h，如圖2(b)，且43℃的最短代時(shí)明顯比34 ℃、37 ℃和40 ℃更長，說明最適生長溫度為34 ℃～40 ℃，方差分析也表明，溫度對能夠顯著影響最大比增長速率和最短代時(shí)(P<0.05).

圖2 不同溫度條件下培養(yǎng)基中的亞硝氮積累情況(a)及最大比生長速度和最短代時(shí)(b)Fig.2 The accumulation of (a) and the maximum specific growth rate and the minimum generation time (b) at different temperatures in media

當(dāng)處理垃圾滲濾液時(shí)，各對照組幾乎不積累亞硝氮，而各試驗(yàn)組不但亞硝氮積累明顯，而且氨氮降幅高于對照組，pH也顯著低于對照組(P<0.05)，均說明富集培養(yǎng)物是試驗(yàn)組氨氧化的主要原因(圖3).特別是，至24 h，40 ℃實(shí)驗(yàn)組的亞硝氮積累量和氨氮去除量均為最高，pH則最低(P<0.05)，均說明40 ℃為最適氨氧化溫度，這與培養(yǎng)基中測試的結(jié)果是一致的.此外，根據(jù)亞硝氮積累量計(jì)算了各溫度下的代時(shí)，也發(fā)現(xiàn)40 ℃時(shí)的代時(shí)(5.9±0.1 h) 與37 ℃(6.5±1.6 h)無顯著差異(P>0.05)，但顯著小于43 ℃(6.6±0.2 h)(P<0.05)，而，說明SN-6在垃圾滲濾液中的最適生長溫度為37 ℃～40 ℃，這也與培養(yǎng)基中獲得的結(jié)果基本吻合.

2.3 鹽度耐受性

由圖4可見，鹽度對脫氨活性有顯著性影響(P<0.05).其中鹽度0.5%時(shí)的相對脫氨效率最高(P<0.05，其氨氮降幅為52 mg·L-1)，而脫氨活性的最適鹽度為0.5%，半數(shù)抑制鹽度略高于1%，而最大耐受鹽度則大于4%.

圖4 不同鹽度下的相對脫氨效率Fig.4 Relative removal efficiency of ammonia nitrogen at different salinities

2.4 亞硝氮耐受性

由圖5可見，無亞硝氮組的相對脫氨效率最高(P<0.05，其氨氮降幅為108 mg·L-1)，脫氨活性的半數(shù)抑制亞硝氮濃度約為850 mg·L-1，完全抑制亞硝氮濃度則約為2 200 mg·L-1.

圖5 不同亞硝氮濃度下的相對脫氨效率Fig.5 Relative removal efficiency of ammonia nitrogen at different nitrite concentrations

2.5 在不同類型的低氨地表水中的脫氨效果

由圖6a可見，武漢市蘆灣湖、武泰閘和南湖港地表水中的氨氮濃度分別為5.0、15.4和22.6 mg·L-1，經(jīng)SN-6在27 ℃處理3 d后的氨氮去除速率分別可達(dá)98%、93%和98%，均明顯高于各對照組(均小于2%，P<0.05)，說明SN-6能夠使污染地表水中的氨氮濃度從Ⅴ類/劣V類標(biāo)準(zhǔn)迅速提升至Ⅱ類.此外，試驗(yàn)期間的亞硝氮積累量與氨氮去除量基本相當(dāng)，如圖6，說明氨氧化是SN-6在低氨地表水中的主要脫氨方式.

圖6 在不同類型低氨地表水中的脫氨效果(a)和亞硝氮積累效果(b)Fig.6 NH3-N removal effect (a) and accumulation effect (b) in different types of low-NH3-N ground water

3 討論

由于N.nitrosaSN-6與N.nitrosaNm 90的16S rDNA序列及amoA基因序列的相似度均高達(dá)100%，考慮到N.nitrosaNm 90與已知的耐熱AOB純菌株Nitrosomonassp. JPCCT2的16S rDNA序列的相似度也為100%[22]，說明N.nitrosaSN-6與耐熱的Nitrosomonassp. JPCCT2的進(jìn)化關(guān)系較近.

從氨氧化活性上看(表1)，以往報(bào)道的耐熱AOB及其富集培養(yǎng)物的耐熱范圍為45 ℃～60 ℃，氨氮去除速率為1.2 mg·L-1·d-1～19.78 mg·L-1·d-1，而本文的AOB富集物的耐熱上限至少達(dá)到了43 ℃，且在37 ℃～40℃時(shí)能夠達(dá)到129 mg·L-1·d-1的最大亞硝氮積累速率，明顯高于以往的報(bào)道.

表1 不同耐熱亞硝化單胞菌在培養(yǎng)基中的氨氧化活性和生長的比較Tab.1 Comparison of ammonia-oxidizing activity and growth of different heat-resistant Nitrosomonas strains in culture media

相較于對氨氧化活性的研究，前人對耐熱AOB生長的研究則更少(表1)：Nitrosomonassp. JPCCT2的耐高溫上限雖高達(dá)48 ℃，但其最適生長溫度僅為28 ℃，且在高溫下的生長極其緩慢(如其在37 ℃時(shí)的最短代時(shí)長達(dá)7.5 d)[22].相比之下，本研究AOB富集物在37 ℃時(shí)的最大比增長速度為2.73 d-1，最短代時(shí)低至約6.1 h，說明本AOB富集物在高溫條件下的生長速度更快.

此外，即便是與常溫型的AOB相比，本富集培養(yǎng)物的代時(shí)也更短.如Nitrosomonasmobilis[3]在27 ℃的代時(shí)為10～14 h，Nitrosovibrioeuropaea[4]在27 ℃的代時(shí)為10～14 h，Nitrosospira[4]在27 ℃的代時(shí)為20～21 h，而Nitrosovibriotenuis[5]在25 ℃～30 ℃的代時(shí)為12～13 h，N.eutrophaCZ-4[10]在31 ℃的代時(shí)為8.2 h.而本AOB富集物在培養(yǎng)基中，34 ℃～40 ℃區(qū)間的最短代時(shí)均小于7.5 h；在垃圾滲濾液中，37 ℃～43 ℃區(qū)間的最短代時(shí)也均小于7 h，都明顯比已知的AOB[3-10]生長更快.

本富集培養(yǎng)物脫氨活性的半數(shù)抑制鹽度略高于1%，最大耐受鹽度則大于4%.相比之下，N.europaea19718[25]的最大耐受鹽度為2.3%，N.mobilisMs1[3]和Nitrosomonassp. JPCCT2[22]的半數(shù)抑制鹽度分別為1.46%和1.8%.而張宇坤等人對AOB富集培養(yǎng)物的研究也表明，當(dāng)鹽度為0.25%和3%時(shí)，氨氧化活性分別下降了6.6%和79.2%[29]，此結(jié)果與本文的鹽度抑制效應(yīng)基本相當(dāng).

本富集培養(yǎng)物脫氨活性的半數(shù)抑制亞硝氮濃度約為850 mg·L-1，完全抑制亞硝氮濃度則約為2 200 mg·L-1.考慮到游離亞硝酸(Free nitrite acid，F(xiàn)NA)是亞硝氮致毒的主要成分[6，30]，相應(yīng)的半數(shù)/完全抑制FNA濃度分別為0.095 mg·L-1和0.243 mg·L-1，高于N.europaea19718[30]、N.eutrophaC91[6]及Nitrosomonassp. AL212[31]的最大FNA耐受濃度，而與N.mobilisMs1[3]及N.eutrophaCZ-4[10]相當(dāng)，僅略低于N. stercoris KYUHI-S[32].較強(qiáng)的耐鹽能力和耐FNA能力將有助于擴(kuò)展SN-6的應(yīng)用范圍，也可能是該菌在垃圾滲濾液中脫氨效果明顯且生長迅速的原因.

在低氨地表水中，接種本富集培養(yǎng)物后，僅需72 h即可使超過22 mg·L-1的氨氮降至低于1.5 mg·L-1.類似的，當(dāng)采用低氨親和力較高的N.eutrophaCZ-4處理黑河水時(shí)，當(dāng)其脫氨速度達(dá)到0.09 mg·L-1·h-1后，約需42 h使氨氮從14 mg·L-1降至約3 mg·L-1[10]，說明SN-6同樣也具有較高的氨親和力.需要注意是，盡快通常認(rèn)為氨氧化是硝化過程的限速步驟(而不是亞硝氮氧化)，但也應(yīng)避免由于過量使用氨氧化菌而導(dǎo)致地表水大量積累的亞硝氮的情況，可以采取的措施包括嚴(yán)格控制氨氧化菌的投加量、輔助投加亞硝氮氧化菌等.

4 結(jié)論

本研究獲得的耐熱AOB富集物中的優(yōu)勢AOB菌種為N.nitrosaSN-6，其最適生長溫度為37～40 ℃(最短代時(shí)約為6 h)，最高耐受溫度不低于43 ℃，既能夠在高溫垃圾滲濾液中快速生長并脫氨，也能夠在3 d內(nèi)使污染地表水中的氨氮從5～23 mg·L-1降至不超過1.5 mg·L-1.