余海軍，王 茜

（天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院/天津市水生生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384）

搖蚊屬（Chironomus）隸屬于雙翅目搖蚊亞科（Diptera：Chironomidae），該屬由德國昆蟲學家Mei?gen 于1803 年建立，迄今為止全世界已記錄種類達303 種；搖蚊屬的幼蟲可以生存于各種水體（尚未污染至嚴重污染的水體），其中寬葉搖蚊亞屬（Lobochi?ronomus）在缺乏營養(yǎng)的水體中較為豐富，并且能耐受酸性環(huán)境，另一些搖蚊亞屬喜歡生長在鹽分較高的環(huán)境中，對重金屬污染具有耐受性［1］。搖蚊屬部分種類雄成蟲能引起人類過敏性疾?。宦懵对谕夂驼诋a(chǎn)卵的搖蚊屬種類可以成為新鮮水體中魚類（鱒魚）的主要食物來源；在日常生活中，某些垂釣者所用誘餌也為搖蚊屬幼蟲［2］。

搖蚊屬是搖蚊科最古老的屬之一，由于種種歷史原因，該屬的研究在世界上一直存在很大的爭議，屬內(nèi)物種的分類地位至今沒有獲得廣泛的認可。依據(jù)中國搖蚊名錄中統(tǒng)計，中國已有該屬種類共23種，其中只有13種具有明確記錄，另包括3種可疑種和7種只進行鑒定而沒有正式發(fā)表的［3］。因此，搖蚊屬的物種界定一直存在爭議［3］。隨著DNA 條形碼的提出，其通過將基因組的標準部分提取一個或幾個相對較短的基因序列，用于識別物種［4，5］；雖然使用DNA序列識別生物并不新穎［6］，但DNA 條形碼能快速且可靠地識別所有生命形式的物種層次，包括動物、植物、真菌、微生物；其在論證物種群落組成、食物鏈和種內(nèi)遺傳變異方面也有所研究［7-9］；同時也扮演著生物安全和淡水生態(tài)監(jiān)測中一個不可缺少的角色［10-13］。Lin 等［14］使用DNA 條形碼對長跗搖蚊屬（Tanytarsus）121 個形態(tài)種進行物種鑒定有效性分析，結(jié)果表明DNA 條形碼明確區(qū)分出94.6%的先前通過形態(tài)學研究分類的長跗搖蚊屬物種；Song 等［15］使用DNA 條形碼對多足搖蚊屬（Polypedilum）161 個形態(tài)種進行物種鑒定有效性分析，結(jié)果表明現(xiàn)已有研究中多足搖蚊屬94.4%的種類能有效被DNA 條形碼區(qū)分。

本研究基于編碼細胞色素C 氧化酶甲基I（COI）基因?qū)u蚊屬157 種的749 條DNA 條形碼進行分析研究，并利用相關(guān)軟件對搖蚊屬類群進行了遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，目的是探索DNA 條形碼在搖蚊屬物種界定方面的有效性，同時為完善搖蚊科DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫提供參考，以填補當前國內(nèi)該屬的研究空白。

1 材料與方法

1.1 分類抽取和收集信息

研究中695 條DNA 條形碼數(shù)據(jù)為BOID 和Gen?bank 數(shù)據(jù)庫提供，54 條為收集樣本，采集于新疆、寧夏、海南、貴州、廣西、天津、浙江等地；采集方式包括燈誘、馬氏網(wǎng)、D 型網(wǎng)、掃網(wǎng)；將采集后的幼蟲樣本保存于95%乙醇中，成蟲樣本保存于85%乙醇中，并存于4 ℃冰箱，用于后續(xù)的形態(tài)學和分子學研究。

1.2 DNA 提取和PCR 擴增

本研究通過Qiagen DNA Blood and Tissue kit 試劑盒，采用搖蚊成蟲的頭、胸部和幼蟲的腹部提取基因組DNA。提取后成蟲的頭、胸部保存到與翅、足和觸角一致的玻片標本上，用Euparal 樹膠封片，憑證標本均存于天津農(nóng)學院水產(chǎn)遺傳育種實驗室。

使用通用引物LCO1490和HCO2198擴增COI條形碼［16］。PCR 擴增反應體系為25 μL，包含12.5 μL 2×Es Taq MasterMix，上下游引物各0.625 μL，dd H2O 8.75 μL，DNA模板2.5 μL。通過Master Cycler Gradient進行擴增，擴增程序為98 ℃預變性10 s，94 ℃5 min，35個循環(huán)（94 ℃1 min，51 ℃1 min，72 ℃1 min），最后72 ℃延伸5 min；10 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送北京六合華大基因科技股份有限公司進行純化測序。

1.3 序列分析和對比

各個基因片段都采用雙向測序，根據(jù)測序公司返回的測序結(jié)果，使用軟件SeqMan 7.1.0.44 觀察峰圖質(zhì)量編輯序列［17］。將編輯好的FASTA 文件導入MEGA7.0 后選擇標準密碼子進行后續(xù)密碼子比對。

用MEGA7.0 軟件分析對比后，對各樣本堿基的組成、簡約信息位點、變異位點（Variable sites）、保守位點、自裔位點、平均堿基含量、遺傳距離和堿基轉(zhuǎn)換與顛換比值進行統(tǒng)計。選用Kimura-2-parameter（K2P）分子進化模型，節(jié)點處置信度為1 000，其他設(shè)置均為默認值，建立鄰接樹。

利用ABGD 軟件分析mOTU 的數(shù)量［18］：將編輯好的FASTA 文件在線提交到ABGD 網(wǎng)站（http：//ww?wabi.snv.jussieu.fr/public/abgd/），選擇K2P 模型，種內(nèi)差異先驗值P 為0.001～0.100，相對gap 寬度值X 為1.0，其余參數(shù)設(shè)置為默認值［15］。本研究的54 條DNA 序列及其相關(guān)信息均已上傳BOLD（http：//www.boldsystems.org）數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列特征

研究共獲得搖蚊屬749 條DNA 條形碼，其中實驗 室 獲 得54 條DNA 條 形 碼，695 條 來 自BOID 和Genbank 數(shù)據(jù)庫，所有序列的長度均為658 bp，各堿基的平均含量分別為A=26.56%，T=37.67%，C=18.82%，G=16.92%，序列存在堿基的偏倚性，C+G的含量顯著低于A+T 的含量，特別是第三核酸位點A+T 的含量為85.15%。通過比對序列得出，信息位點有244個，占37.08%；變異位點有261 個，占39.67%。大部分的變異位點都集中在第三核酸位點，其比例為78.16%，表明在第三核酸位點上的堿基進化速率快。

2.2 遺傳距離

在DNA 條形碼研究中，種內(nèi)與種間遺傳距離的差異是一項非常重要的指標，當種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，就會形成一個明顯的空白區(qū)［15，19］。

實驗室共獲得54 條DNA 條形碼，形態(tài)鑒定約為12 種。結(jié)合BOID 和Genbank 數(shù)據(jù)庫已下載的數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計共獲得形態(tài)種約50 種。在MEGA 7.0軟件中，對所有形態(tài)種進行分組，即60 個組。種內(nèi)遺傳距離為0～7.21%，平均值為1.10%；種間遺傳距離為0.2%～19.4%，平均值為14.25%；種間平均遺傳距離是種內(nèi)平均遺傳距離的12.95 倍，因此本研究的749 條形碼數(shù)據(jù)存在明顯的空白區(qū)。

Hebert 等［5］通過對無脊椎動物及脊椎動物11門13 320 個物種進行了DNA 條形碼的研究，并提出了種間平均遺傳距離大于種內(nèi)平均遺傳距離的10 倍作為區(qū)分物種的標準；隨著DNA 條形碼的深入研究，不同領(lǐng)域的學者對該標準進行了驗證，在搖蚊科不同類群中也出現(xiàn)了相應的研究，詳細結(jié)果見表1。

表1 搖蚊科不同類群遺傳距離比較

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果

本研究采用DNA 條形碼分析中最常用的鄰接法，基于54 條DNA 條形碼明顯分離出13 個分類操作單元，代表搖蚊亞科中12 個已命名的物種，結(jié)果顯示DNA 條形碼的鑒別結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致（圖1）。

圖1 54 條DNA 條形碼鄰接樹

2.4 ABGD 評估結(jié)果

ABGD 在線軟件通過比較種內(nèi)和種間的遺傳距離，當種間最小遺傳距離大于種內(nèi)最大遺傳距離時則出現(xiàn)空白區(qū)，DNA 條形碼空白區(qū)的存在很容易將物種分開（圖2）。

圖2 749條DNA條形碼基于K2P模型得到的遺傳距離分類

基于ABGD 在線軟件評估搖蚊亞科OTUs 的數(shù)量，即通過設(shè)定不同的閾值P，得到不同的OTUs 數(shù)量；隨著P 增大，OTUs 的數(shù)量減少（圖3）。當P 為0.002 637 時，749 條DNA 條形碼被分為104 OTUs；P 為0.026 827 時，被分為61 OTUs。即OTUs 的置信區(qū)間可為61～104，ABGD 所評估的OTUs 的數(shù)量略大于形態(tài)評估的種類。當P 為0.037 276 時，被分為58 OTUs，最為接近鄰接樹法評估的分子操作單元數(shù)量，因此ABGD 方法評估749 條搖蚊亞科DNA條形碼的遺傳距離閾值為3%～4%。

圖3 ABGD 在線評估OTUs的數(shù)量隨P 的變化

3 討論

目前為止，DNA 條形碼技術(shù)存在5 種分析方法，即遺傳距離的分析、遺傳相似度的分析、系統(tǒng)發(fā)育樹的分析、序列特征的分析和統(tǒng)計分類法的分析［21］，而在搖蚊DNA 條形碼研究中，主要是基于遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育樹的分析［22-28］。

基于遺傳距離的分析，即通過計算DNA 條形碼序列的遺傳距離，從而實現(xiàn)物種的區(qū)分，主要分析方法包括DNA 條形碼間隙和遺傳距離閾值分析［21］。DNA 條形碼間隙的一項非常重要指標是種內(nèi)與種間遺傳距離的差異，當種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離，就會形成一個明顯的空白區(qū)。本研究中種內(nèi)平均遺傳為距離為1.10%，種間平均遺傳距離為14.25%，后者大約是前者的12.95 倍，形成了空白區(qū)。遺傳距離閾值是指物種在能形成空白區(qū)的前提下，使用物種種間遺傳距離與參比的遺傳距離閾值進行對比，當種間遺傳距離大于參比的閾值，則可以將物種區(qū)分為不同物種。閾值法在DNA 條形碼的物種鑒定中起著不可替代的作用，然而隨著DNA 條形碼的研究不斷出現(xiàn)，有學者發(fā)現(xiàn)不同物種DNA 條形碼的閾值各不相同，沒有一個統(tǒng)一的標準閾值［29］。BOLD 數(shù)據(jù)庫最初將遺傳距離1%作為生物物種的劃分閾值，由于其閾值寬泛，在一定程度上造成了物種的鑒別過度，導致同種異名的出現(xiàn)，為了不使物種混亂，近年來BOLD 系統(tǒng)默認鑒別閾值為3%［30］；Meier 等［31］在對449 個雙翅目昆蟲物種的研究中，發(fā)現(xiàn)在物種劃分時，其遺傳距離大于3%；He?bert 等［5］以3%作為閾值對200 個鱗翅目昆蟲物種進行鑒別；蜉蝣目［32-34］、襀翅目和毛翅目［35，36］的物種以2%的閾值就能將物種區(qū)分開。本試驗研究的物種隸屬于雙翅目，通過使用ABGD 方法評估得到的遺傳距離閾值為3%～4%，與Meier 等［31］的研究相符，且與搖蚊亞科中其他屬研究的閾值差異不大，Song 等［15］區(qū)分多足搖蚊屬的遺傳距離閾值為5%～8%，Lin 等［14］區(qū)分長跗搖蚊屬的遺傳距離閾值為4%～5%。本研究是分析搖蚊屬物種的DNA 條形碼，其屬于搖蚊亞科中比較大的屬級之一，屬內(nèi)物種的豐富度極高，但由于時間有限，加之中國地大物博，從而不能完全覆蓋已記錄所有物種和一些隱種；為此還需要更深入的研究，才能達到對中國地區(qū)搖蚊屬遺傳距離的準確界定。

系統(tǒng)發(fā)育樹能直觀地反映物種之間的親緣關(guān)系，本研究采用的是鄰接樹法，其基于遺傳距離和最小進化原理，通過自舉檢驗法進行聚類，并通過統(tǒng)計給定樹分支的可信度，得出最優(yōu)樹［37］。在鄰接樹中，基于54 條來自實驗室的DNA 條形碼明顯分離出12 個物種，與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，匹配率達92.3%；通過結(jié)合BOID 和Genbank 數(shù)據(jù)庫中的695條DNA 條形碼，分離出50 個形態(tài)種，其中發(fā)現(xiàn)本試驗數(shù)據(jù)Chironomus pseudothummi 與參比數(shù)據(jù)Chi?ronomus sp.TE11 聚為一支（圖4），由于數(shù)據(jù)庫中參比數(shù)據(jù)Chironomus sp.TE11 不能提供證據(jù)標本與本研究比較，將基于本研究的數(shù)據(jù)將參比數(shù)據(jù)Chi?ronomus sp.TE11 修 改 為Chironomus pseudothummi，并將相關(guān)信息上傳至BOLD 數(shù)據(jù)庫。

圖4 Chironomus pseudothummi 類群鄰接樹

4 結(jié)論

本研究通過采集中國地區(qū)的搖蚊屬昆蟲12 種54 個樣本，結(jié)合BOID 和Genbank 數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)數(shù)據(jù)，共計749 條DNA 條形碼，運用ABDG 法分析該數(shù)據(jù)集遺傳距離，結(jié)果顯示種內(nèi)與種間存在一個明顯的空白區(qū)；基于鄰接樹結(jié)果得出數(shù)據(jù)集分離出50 個物種，與傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定一致，匹配率高達92.3%，并修正數(shù)據(jù)庫中Chironomus sp.TE11 為Chironomus pseudothummi，證明DNA 條形碼能有效鑒別搖蚊屬昆蟲。本研究的數(shù)據(jù)均已上傳中國DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，在豐富中國搖蚊科數(shù)據(jù)庫的同時，也為探索DNA 條形碼在搖蚊昆蟲中鑒別的有效性提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。