李 斌，秦毅斌，盧冰霞，何 穎，段群棚，梁家幸，陳忠偉，周英寧，蔣冬福，盧敬專，全琛宇，許心婷，趙 碩，楊思儀，趙 平，3，趙 武

（1.廣西獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001；2.廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西 南寧 530001；3.廣西大學，廣西 南寧 530004）

2018年5月，廣西某縣某豬場突然有70多頭35日齡豬發(fā)病，病豬癥狀為消瘦、腹瀉、氣喘、腹式呼吸，其中20多頭豬病死。病死豬剖檢病變?yōu)榱馨徒Y(jié)腫大、出血；肺充血、出血，與胸膜粘連；肝充血；脾有梗死點；腎充血，表面有散在的出血點；膀胱黏膜有散在的出血點。應(yīng)用抗生素對病豬進行治療無效。該豬場將其中5頭病死豬每頭分別采取淋巴結(jié)、肺、肝、脾、腎等病料送實驗室檢測。據(jù)該豬場人員反映的病豬發(fā)病情況及病豬剖檢病變，初步懷疑該豬場所發(fā)疫病病原為豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬肺炎支原體（MHP），于是應(yīng)用本實驗室所建立的PCR/RT-PCR方法對送檢病料進行上述疑似豬病病原的檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料樣品 將該豬場送檢的5頭病死豬的淋巴結(jié)、肺、肝、脾、腎等臟器分別混合研磨，依次編號為1、2、3、4、5。

1.1.2 試驗試劑 AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自康寧生命科學（吳江）有限公司；HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；Golden Easy PCR System（含染料，雙組份）購自天根生化科技（北京）有限公司；DNA Marker DL 2 000購自Takara生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試驗儀器 杭州晶格T960梯度PCR儀；北京六一廠電泳儀。

1.1.4 檢測用PCR引物 檢測所用PCR引物見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，均用ddH2O配制成25 μmol/L工作濃度。

表1 檢測所用的PCR引物

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 分別剪取送檢5份病料的淋巴結(jié)、肺、肝、脾、腎的病變與正常交界部分，將每頭病死豬的這5種器官病料混作1份樣品進行檢測，共檢測5份樣品。將樣品充分研磨，凍融3次，10 000 r/min離心3 min，取上清液備用。

1.2.2 檢測樣品核酸的提取 取上述處理好的樣品離心上清液200 μL，按照RNA/DNA提取試劑盒說明書操作步驟，進行病毒核酸的提取，所得病毒核酸供RT或PCR檢測用。其中，應(yīng)用RT-PCR方法檢測CSFV、PRRSV；應(yīng)用PCR方法檢測PCV2、PRV、MHP。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄（RT）

（1）RT反應(yīng)體系。將樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDAN：按照HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒說明進行，采用20 μL反應(yīng)體系：5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L each）4 μL，DTT（0.1 M）2 μL，Primer Mix 2 μL，HiFiScript（200 U/μL）1 μL，RNA模板7 μL。

（2）RT反應(yīng)反應(yīng)條件。按以下程序進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：42 ℃ 50 min，4 ℃保存。

1.2.4 PCR反應(yīng) 應(yīng)用PCR檢測引物（上游引物F、下游引物R）分別對病料樣品核酸進行5種病原的PCR擴增反應(yīng)，這5種病原PCR擴增反應(yīng)同時在同一臺梯度PCR儀上進行不同退火溫度的擴增反應(yīng)。

（1）PCR反應(yīng)體系。25 μL PCR反應(yīng)體系為：雙蒸H2O 9 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（F、R）各0.5 μL，DNA模板2.5 μL。

（2）PCR反應(yīng)條件。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，梯度退火溫度：PCV2 56 ℃/CSFV 55 ℃/PRRSV 57 ℃/PRV 63 ℃/MHP 56 ℃，復(fù)性45 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.2.5 電泳觀察結(jié)果 多重PCR反應(yīng)結(jié)束，取10 μL多重PCR擴增產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電泳結(jié)束于凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 部分病料樣品及對照檢測結(jié)果

2.2 送檢病料5種病原的檢測結(jié)果

在檢測的5份病料樣品中，CSFV、PRRSV二重感染率為60%（3/5），PCV2、CSFV、PRRSV三重感染率為20%（1/5），見表2。

表2 5份病料檢測5種病原的檢測結(jié)果

3 討論與分析

3.1 本次檢測針對不同的DNA/RNA病原，應(yīng)用DNA/RNA核酸抽提試劑盒一次同時提取病料樣品的總核酸（DNA/RNA）；應(yīng)用相同的PCR/RT反應(yīng)體系；應(yīng)用除了不同病原對應(yīng)不同退火溫度之外，其余均相同的PCR反應(yīng)條件。這種方便快捷的核酸提取方法及梯度退火溫度PCR檢測方法非常適合獸醫(yī)臨床病料樣品中多種病原混合感染的快速檢測。這種在同一臺梯度PCR儀上應(yīng)用不同退火溫度同時擴增檢測多種病原核酸的PCR檢測方法，較之在同一PCR反應(yīng)管中應(yīng)用不同引物的多重PCR檢測方法要簡便易行，方法設(shè)計、優(yōu)化難度低[1-2]。

本次檢測針對P CV2、C SF V、PR R SV、PRV、MHP這5種常見豬病病原分別設(shè)計合成5對P CR擴增引物，根據(jù)5對引物不同的退火溫度，在同一臺梯度PCR儀上同時進行5份送檢病料中的5種病原共25個樣品的檢測，結(jié)果檢測出二重感染（CSFV+PRRSV）、三重感染（PCV2+CSFV+PRRSV）的病料。

3.2 本次檢測的5份病料樣品中，CSFV、PRRSV二重感染率為60%（3/5），PCV2、CSFV、PRRSV三重感染率為20%（1/5），說明該送檢豬場豬只存在混合感染情況。目前豬病多發(fā)，其中混合感染病例較為常見，尤其是PCV2、CSFV、PRRSV等常見病原混合感染的豬病時有報道[3-9]。所以在防制單一豬病的同時要注意多重混合感染豬病的防制，豬場要應(yīng)用多種疫苗或多聯(lián)疫苗對多種豬病進行同時免疫預(yù)防。

3.3 根據(jù)檢測結(jié)果，建議送檢豬場采取如下防制措施：1）PCV2、PRRS均為豬免疫抑制性疫病，若發(fā)生這兩種豬病，將會破壞病豬的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫功能障礙，致使病豬機體免疫系統(tǒng)對疫苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)水平下降，從而導(dǎo)致疫苗的免疫保護效果不理想，例如，豬只免疫力低下，造成免疫過的豬群發(fā)生非典型豬瘟[10]。這對豬場的危害尤為嚴重，所以要重點加強對PCV2、PRRS這兩種豬免疫抑制性疫病的監(jiān)測與防控。2）本次檢測所用PRRSV引物根據(jù)PRRSV的Nsp基因設(shè)計，可以鑒別區(qū)分PRRSV經(jīng)典毒株（預(yù)期擴增片段大小為320 bp）和PRRSV高致病變異毒株（預(yù)期擴增片段大小為230 bp），此次所檢病料樣品的PRRSV PCR擴增產(chǎn)物大小為230 bp，所以可以推斷該送檢豬場所發(fā)PRRS疫病是由PRRSV高致病變異毒株導(dǎo)致的。我國已發(fā)現(xiàn)PRRSV Nsp2的變異主要表現(xiàn)在氨基酸的缺失[11-14]，此次發(fā)現(xiàn)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征就是由Nsp2缺失30個氨基酸的變異株引起的。PRRSV的基因容易發(fā)生變異，從而導(dǎo)致疫苗免疫失敗，所以建議送檢豬場對本場病豬的PRRSV進行基因測序，然后將測序結(jié)果序列與NCBI GenBank網(wǎng)站上的PRRSV參考毒株的相應(yīng)基因序列進行遺傳進化同源性比對，然后選擇同源性最為接近的廠家PRRSV毒株疫苗進行免疫，以確保疫苗免疫的有效性。