劉海英，甄俊琦，茹振鋼，董 娜，馮必得

(1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007； 2.河南科技學(xué)院小麥中心，河南新鄉(xiāng) 453003)

小麥(TriticumaestivumL.)在世界各地廣泛栽培[1-2]，是中國北方地區(qū)的主要食物來源[3]，河南是中國小麥的主產(chǎn)區(qū)[4]，提高河南小麥單產(chǎn)是中國糧食安全的重要保障[5]，雜種優(yōu)勢的廣泛應(yīng)用使農(nóng)作物質(zhì)量、產(chǎn)量、抗逆能力等方面均得到了顯著提高[6-7]，因此提高小麥產(chǎn)量的首選方法是培育雜交小麥[8-9]。目前，國內(nèi)在水稻[10]、玉米[11]、煙草[12]等領(lǐng)域的雜交制種研究已有報道，而對于小麥的雜交制種相關(guān)研究相對薄弱。在農(nóng)作物雜交制種技術(shù)中應(yīng)用較多的主要是兩系法(光、溫敏雄性不育)雜交制種[13-14]，小麥光溫敏雄性不育系為兩系法雜交制種提供了種質(zhì)資源[15]。

“百農(nóng)不育系”(Bai-Nong Sterility,BNS)由河南科技學(xué)院茹振鋼教授育成[16]。BNS的花粉發(fā)育在抽穗前對環(huán)境溫度十分敏感，當(dāng)日平均氣溫低于8.9 ℃時，阻礙小孢子發(fā)育，花粉敗育；當(dāng)日平均氣溫高于8.9 ℃時，小孢子育性開始發(fā)生轉(zhuǎn)化，花粉育性逐漸恢復(fù)，部分小花能夠正常結(jié)實(shí)；當(dāng)日平均氣溫高于14.4 ℃時，大部分花粉育性完全恢復(fù)，能夠正常結(jié)實(shí)。溫度是影響育性轉(zhuǎn)換的主要因素，且受隱性核基因控制[17]，因此屬溫敏型核雄性不育。BNS366是用小麥溫敏不育系BNS與鄭麥366[18]雜交后經(jīng)過飽和回交，在后代群體中選育成功的一個矮稈溫敏雄性不育系，對BNS366進(jìn)行基礎(chǔ)研究是有效利用該品系的前提。

前人在花粉育性檢測中，有些是采用的是全穗的花粉[19-20]，有些采用的是中部小穗的花粉[21]。不同取樣方法檢測到的花粉可育率是否存在顯著差異，以及與自交結(jié)實(shí)率是否一致，目前尚未見報道。因此，本試驗(yàn)以鄭麥366和BNS366為試驗(yàn)材料，設(shè)置早播和晚播兩個播期，采用全穗取粉和中部取粉兩種取樣方法制片，觀察I2-KI、醋酸洋紅、DAPI三種染色方法的染色效果和花粉育性統(tǒng)計結(jié)果的差異，以期為明確小麥小孢子發(fā)育細(xì)胞學(xué)觀察和花粉育性檢測選取合適的取樣方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

供試材料種植于河南師范大學(xué)小麥試驗(yàn)田，位于地處中原腹地的的新鄉(xiāng)市，所屬黃淮麥區(qū)(東經(jīng)113°54′，北緯35°19′，海拔76.3 m)，屬暖溫帶大陸性氣候，四季分明，適合農(nóng)作物生長。

1.2 試驗(yàn)材料

以溫敏小麥雄性不育系BNS366及其近等基因系鄭麥366為供試材料，均由河南科技學(xué)院小麥中心提供。于2017年10月11日(早播)和2017年12月2日(晚播)分兩個批次進(jìn)行播種，采用條播方式播種小麥，小區(qū)面積4.5 m2(1.5 m×3 m)，每個材料種植6行，行距20 cm，株距10 cm。單粒播種。按一般大田管理方式栽培，次年選代表型植株主莖穗進(jìn)行研究。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

參照劉海英等[22-23]的農(nóng)藝特征判斷標(biāo)準(zhǔn)，在小孢子發(fā)育的開花期，于上午9:00-10:00，各選取10穗代表型植株主莖穗，每處理3次重復(fù)，置于FAA固定液(50%乙醇∶冰醋酸∶福爾馬林=18∶1∶1)中，0.034×105Pa抽真空30 min后在4 ℃條件下固定24 h，移除FAA固定液，經(jīng)90%-80%-70%-70%乙醇梯度置換固定液(每次置換時間均為30 min)，最后轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存?zhèn)溆?。設(shè)置全穗取粉和中部取粉兩種取樣方法制片，然后進(jìn)行后續(xù)染色觀察。全穗取粉，是從麥穗上部、中部和下部小穗的第1位小花各取1枚花藥，將3枚花藥的花粉等量混合；中部取粉，是在麥穗中部沿穗軸一側(cè)自下而上依次從3個小穗的第1位小花中各取1枚花藥的花粉等量混合。

1.4 細(xì)胞學(xué)觀察

參照劉海英等[22-23]的方法分別進(jìn)行I2-KI法、醋酸洋紅法和DAPI法染色和制片、在 Leica DMIL倒置熒光顯微鏡下(目鏡10×，物鏡20×)用白光觀察I2-KI法、醋酸洋紅法制好的片子，用紫外光觀察DAPI法制好的片子，每張片子觀察5個視野，并進(jìn)行花粉育性統(tǒng)計。

1.5 套袋自交結(jié)實(shí)率調(diào)查統(tǒng)計

于抽穗后開花前各隨機(jī)選取10個麥穗分別套袋，成熟期參照張思妮等[20]的方法調(diào)查和統(tǒng)計自交結(jié)實(shí)率。

結(jié)實(shí)率(國內(nèi)法)=(有效小穗基部兩側(cè)小花結(jié)實(shí)數(shù)/有效小穗基部小花總數(shù))×100%；

結(jié)實(shí)率(國際法)=(有效小穗結(jié)實(shí)數(shù)/有效小穗數(shù)×2)×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣方法所取花粉粒的染色結(jié)果

2.1.1 I2-KI法染色結(jié)果

由圖1可知，早播和晚播鄭麥366中部取粉和全穗取粉時，花粉粒絕大多數(shù)均呈飽滿圓形，I2-KI法染色后，顏色均勻且為深色，表現(xiàn)為正?？捎?/p>

早播BNS366在兩種取樣方法下，花粉粒形狀均不規(guī)則，且I2-KI染色結(jié)果為不正常深褐色，為典敗型花粉；晚播BNS366在兩種取樣方法下，花粉粒形狀均為圓形，少數(shù)花粉粒I2-KI染色不正常，為圓敗型敗育，其余花粉粒為I2-KI染色正常且為深色的正常可育型。不同取樣方法下，BNS366和鄭麥366的花粉粒染色結(jié)果差異 不大。

2.1.2 醋酸洋紅法染色結(jié)果

由圖2可知，早播鄭麥366中部取粉時，花粉粒能看到細(xì)長拉伸呈魚尾狀精核，醋酸洋紅法染色后，顏色為粉紅色，絕大多數(shù)為正?？捎ǚ?，花粉育性表現(xiàn)與全穗取粉時相比更加清晰；全穗取粉時，花粉粒絕大多數(shù)呈飽滿圓形，醋酸洋紅法染色后，顏色為紫紅色，表現(xiàn)為正常可育。晚播鄭麥366中部取粉時，花粉粒絕大多數(shù)為飽滿圓形，醋酸洋紅法染色后，顏色為暗紫色且分布均勻，達(dá)到正?？捎隣顟B(tài)；全穗取粉時，花粉?；ǚ塾员憩F(xiàn)與中部取粉相似，能看到細(xì)長拉伸呈魚尾狀精核，醋酸洋紅法染色后，顏色為紫紅色，同樣絕大多數(shù)為正常可育花粉。早播BNS366在兩種取樣方法下，花粉粒小孢子內(nèi)均無內(nèi)容物，為典敗型花粉；晚播BNS366在兩種取樣方法下，花粉粒形狀均為圓形，醋酸洋紅染色后，顏色均偏紫紅色，少數(shù)花粉粒為醋酸洋紅染色不正常，為圓敗型敗育，其余花粉粒為醋酸洋紅染色正常且能看到細(xì)長拉伸呈魚尾狀精核的正?？捎汀２煌臃椒ㄏ?，醋酸洋紅法染色后，鄭麥366和BNS366的花粉粒形態(tài)差異不大，因烤片因素，顏色略有差異。

2.1.3 DAPI法染色結(jié)果

由圖3可知，早播鄭麥366在兩種取樣方法下，花粉粒絕大多數(shù)均呈飽滿圓形，可觀察到明顯的發(fā)白發(fā)亮的細(xì)長拉伸呈魚尾狀精核，與醋酸洋紅法染色結(jié)果相比，DAPI法染色后，清晰度更高，表現(xiàn)為正常可育；晚播鄭麥366在兩種取樣方法下，花粉粒絕大多數(shù)為飽滿圓形，可觀察到明顯的魚尾狀精核，除極個別不育外，絕大多數(shù)為正?？捎?。早播BNS366在兩種取樣方法下，花粉粒小孢子內(nèi)均無內(nèi)容物，為典敗型花粉；晚播BNS366在兩種取樣方法下，花粉粒絕大多數(shù)為圓形，除個別花粉粒內(nèi)無發(fā)光亮核外，其余花粉粒均為DAPI染色正常且能看到一個圓形營養(yǎng)核和兩個梭型精核的正常可育型。不同取樣方法下，DAPI法染色后，鄭麥366和BNS366的花粉粒形態(tài)指示高度相似，對細(xì)胞核指示均清晰。以上結(jié)果說明，兩種取樣方法對細(xì)胞核發(fā)育狀態(tài)觀察無明顯區(qū)別。

2.2 花粉育性與自交結(jié)實(shí)率比較

2.2.1 不同取樣方法下I2-KI法染色后花粉可育率統(tǒng)計結(jié)果比較

由表1可知，I2-KI法染色后，兩個播期的鄭麥366和BNS366花粉可育率在不同取樣方法下均無顯著差異，除早播BNS366花粉可育率和自交結(jié)實(shí)率均為零外，早播和晚播鄭麥366以及晚播BNS366國際法自交結(jié)實(shí)率與花粉可育率均無顯著差異，國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率極顯著低于花粉可育率和國際法自交結(jié)實(shí)率。

2.2.2 不同取樣方法下醋酸洋紅法染色后花粉可育率統(tǒng)計結(jié)果比較

由表2可知，醋酸洋紅法染色后，兩個播期的鄭麥366和BNS366花粉可育率在不同取樣方法下均無顯著差異；早播鄭麥366花粉可育率與國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率無顯著差異，均顯著或極顯著低于國際法自交結(jié)實(shí)率；早播BNS366花粉可育率和自交結(jié)實(shí)率均為零；晚播鄭麥366和BNS366國際法自交結(jié)實(shí)率與花粉可育率均無顯著差異，國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率極顯著低于其花粉可育率。

表1 不同取樣方法下I2-KI法染色后小麥花粉可育率與其自交結(jié)實(shí)率之間的差異Table 1 Differences of pollen fertility rates and self seedsetting rate collected with different sampling methods stained by I2-KI %

表2 不同取樣方法下醋酸洋紅法染色后小麥花粉可育率與其自交結(jié)實(shí)率之間的差異Table 2 Differences of pollen fertility rates and self seedsetting rate collected with different sampling methods stained by aceto carmine %

2.2.3 不同取樣方法下DAPI法染色后花粉可育率統(tǒng)計結(jié)果比較

由表3可知，DAPI法染色后，兩個播期的鄭麥366和BNS366花粉可育率在不同取樣方法下均無顯著差異，除早播BNS366花粉可育率和自交結(jié)實(shí)率均為零外，早播和晚播鄭麥366以及晚播BN366國際法自交結(jié)實(shí)率與花粉可育率均無顯著差異，國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率極顯著低于花粉可育率和國際法自交結(jié)實(shí)率。

以上結(jié)果表明，不同取樣位置下，三種染色處理對小麥花粉育性統(tǒng)計結(jié)果無實(shí)質(zhì)性影響。醋酸洋紅法染色后，早播鄭麥366花粉可育率與國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率無顯著差異，均顯著或極顯著低于國際法自交結(jié)實(shí)率；另外，醋酸洋紅法染色后，晚播BNS366國際法自交結(jié)實(shí)率與國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率無顯著差異；早播BNS366花粉可育率和自交結(jié)實(shí)率在三種染色方法后均為零，除了這三種情況之外，國際法自交結(jié)實(shí)率與花粉可育率均無顯著差異，國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率均顯著或極顯著低于花粉可育率和國際法自交結(jié)實(shí)率。

表3 不同取樣方法下DAPI法染色后小麥花粉可育率與其自交結(jié)實(shí)率之間的差異Table 3 Differences of pollen fertility rates and self seedsetting rate collected with different sampling methods stained by DAPI %

3 討 論

前人在開展BNS育性相關(guān)研究時，常涉及花粉可育率或敗育率和自交結(jié)實(shí)率的檢測，不同報道中具體方法存在差異。周美蘭等[24]從全穗隨機(jī)選取穎花，取其中花藥進(jìn)行花粉敗育率檢測。秦志英等[25]從主莖穗中部小花中取花藥進(jìn)行花粉可育率檢測，采用國際法統(tǒng)計自交結(jié)實(shí)率。張保雷等[26]和馬小飛等[27]采用國內(nèi)法和國際法統(tǒng)計自交結(jié)實(shí)率，一般國際法自交結(jié)實(shí)率較高，但二者之間未進(jìn)行差異分析。劉海英等[23]采用I2-KI法染色后檢測花粉可育率，采用國內(nèi)法統(tǒng)計自交結(jié)實(shí)率，發(fā)現(xiàn)前者數(shù)值偏高，差異達(dá)到極顯著水平。選擇來自全穗或來自小麥穗中部的花粉，在花粉可育率檢測結(jié)果方面究竟是否存在差異，與國際法和國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率之間吻合度如何，目前相關(guān)研究報道較少。

本研究結(jié)果顯示，全穗取粉和中部取粉對小麥花粉粒形態(tài)及其細(xì)胞核發(fā)育狀態(tài)基本一致；其花粉育性統(tǒng)計結(jié)果也無顯著差異，除早播BNS366花粉可育率(全穗取粉和中部取粉)和自交結(jié)實(shí)率(國際法和國內(nèi)法)均為零以外，其他播期材料花粉可育率一般與國際法自交結(jié)實(shí)率無顯著差異，顯著高于國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率(除早播鄭麥366小麥花粉醋酸洋紅法染色后)。在進(jìn)行花粉育性檢測時，中部取粉可以節(jié)約固定、置換和保存樣品所需試劑以及勞動量，并降低勞動復(fù)雜程度；全穗取粉花粉可育率和自交結(jié)實(shí)率數(shù)據(jù)均來自全穗，二者從試驗(yàn)材料角度分析吻合度更高；全穗取粉或中部取粉用于雜交小麥?zhǔn)诜蹠r理論上差異不大，在實(shí)際工作中可根據(jù)需要自由選擇。

國際法自交結(jié)實(shí)率(除早播BNS366)明顯高于國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率，從國際法、國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率的計算公式中可以看出，使用國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率計算時，統(tǒng)計的是每小穗基部兩朵小花的結(jié)實(shí)數(shù)，而國際法自交結(jié)實(shí)率是將所有穗粒數(shù)全部統(tǒng)計在內(nèi)，這可能是國際法的自交結(jié)實(shí)率偏高的主要原因。困惑之處在于，花粉育性檢測用的花藥均來自于小穗基部的1、2位小花，與國內(nèi)法自交結(jié)實(shí)率的樣品來源部位相同，但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，這兩組數(shù)據(jù)并不一致，三種染色方法不同取樣方法下花粉可育率均高于國內(nèi)法，大多數(shù)與國際法自交結(jié)實(shí)率無顯著差異，表明本試驗(yàn)所檢測到的花粉可育率存在偏高現(xiàn)象，對此尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，中部取粉和全穗取粉對花粉育性檢測結(jié)果無實(shí)質(zhì)性影響，一般可以用來預(yù)測國際法自交結(jié)實(shí)率；中部取粉較為簡便，全穗取粉科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)程度較高，在實(shí)際工作中可根據(jù)需要自由 選擇。