龔 俊

（重慶大學生物工程學院,重慶 400044）

目前，隨著生存環(huán)境惡化及生活壓力加大，女性卵巢癌、宮頸癌等患者數(shù)量不斷增加，男性也有一些弱精患者，針對這些患者，尤其是早期癌癥患者，治愈后仍有生育需求，保存其生育能力不失為一種好的選擇，細胞凍存技術就發(fā)揮了重要作用[1]。細胞低溫凍存是指將細胞置于零下超低溫，使其進入“休眠”狀態(tài)，從而達到長期保存細胞的目的。低溫能大幅降低細胞的新陳代謝速率，所以在液氮溫度下細胞可以安全地長久保存，保存年限更是可以長達數(shù)十年。綜上，超低溫凍存技術是目前為止細胞長期保存最可靠且有效的技術。因此細胞低溫保存技術在細胞移植和基因治療等領域具有較強應用前景。

1 細胞冷凍保存

1.1 細胞冷凍原理

低溫能抑制細胞體內(nèi)所有的生化活動，從而使生物體內(nèi)的生化反應速率降低、延長其生物活性時間。因此可以利用這一特性長時間保存生物體。一切由酶介導的生物體內(nèi)新陳代謝過程中的化學變化，均服從一些共同的生化規(guī)律。瑞典科學家S.A.Arrhenius通過研究溫度對化學反應速度的影響，得到了關系式 ：許多酶反應速率等試驗也驗證了這一關系式的正確性[2]。將活化能Ea常規(guī)范圍內(nèi)的數(shù)值代入該式，可推出化學反應速率隨溫度的降低而不斷變小，同時也能推出生物變質(zhì)速率與溫度成反比的關系[3]。

1.2 低溫損傷原理

常溫條件下，細胞內(nèi)、外的溫度和濃度均一致，處于等溫（溫度）等滲(滲透壓)狀態(tài)，而滲透性和質(zhì)膜特性對于大多數(shù)細胞低溫保存的成功與否起著決定作用[4]。根據(jù)熱傳遞原理，冷卻過程中，細胞外的溶液先被冷卻到其凝固點以下。對含水量較高的溶液，析出的固相幾乎是純冰，從而使胞外溶液濃度升高。因此，細胞內(nèi)外就存在著溫度差和濃度差，它們分別是傳熱和傳質(zhì)的驅(qū)動力[5]。

對于體積小、表面積卻很大的細胞而言，細胞膜的水滲透率很高。細胞在溫度不夠低且高濃度的溶液中經(jīng)歷的時間過長，將導致細胞的損傷以至死亡，這種損傷被稱為“溶液損傷”（“溶質(zhì)損傷”）。此外，胞內(nèi)冰的形成和再結晶也會對細胞膜造成一定程度的損傷或死亡，這種損傷被稱為“胞內(nèi)冰損傷”[6]。

1.3 細胞冷凍保存方法

機體的生化活性在低溫環(huán)境下被抑制，從而降低細胞總體活性并鈍化機體新陳代謝速率，最終達到長期儲存生物樣品的目的。但低溫本身對機體也有損傷，因此在利用低溫凍存細胞時，需先了解細胞在低溫環(huán)境中的理化性質(zhì)，也應當選擇合適的凍存保護劑和凍存方式[7]。

1.3.1 慢速冷凍法

目前，傳統(tǒng)的慢速程序化冷凍法正廣泛應用于細胞保存中。其原理是以低濃度的冷凍保護劑為輔助，在程序化冷凍儀的控制下逐漸降溫，使得冷凍保護劑在細胞充分脫水過程中，進入細胞，從而阻止胞內(nèi)冰晶產(chǎn)生，保護細胞。目前大多慢速程序化冷凍都沿用1998年Oktay等提出的經(jīng)典方案[8]，或在此經(jīng)典方案的基礎上改進。其優(yōu)點為能較好地保存細胞，復蘇后不影響細胞功能。但該方法需要的冷凍儀器昂貴且操作復雜、費時，因此開展難度大。研究人員正在積極尋找更為高效便捷的方式取代它。

1.3.2 玻璃化冷凍法

玻璃化冷凍法又叫快速冷凍法，其原理為溶液的固化，使用的高濃度冷凍保護劑經(jīng)快速降溫由液態(tài)直接轉(zhuǎn)化為無結晶的玻璃化狀態(tài)。這種方法能有效減少胞內(nèi)外冰晶的產(chǎn)生，故更適合冷凍結構較為復雜的組織，如卵巢等[9]。隨著玻璃化冷凍技術的一步步優(yōu)化，1985年Rall等率先成功運用玻璃化冷凍法對小鼠胚胎進行了冷凍[10]。此后，其越來越廣泛應用于其他哺乳動物如馬、山羊、綿羊等。玻璃化冷凍法操作簡單、方便省時，但是高濃度的冷凍保護劑無疑對細胞產(chǎn)生更大的毒性危害。

1.3.3 干燥冷凍法

干燥冷凍法利用冰升華的方式使細胞內(nèi)的水分快速移除，從而抑制胞內(nèi)生化反應。此方法能在4 ℃乃至常溫下長期儲存精子，極大縮減保存成本。冷凍后的精子會喪失活力，但保留受精能力和自身DNA完整性。卵胞漿內(nèi)單精子注射技術的發(fā)展使得精卵結合不再受精子活力的影響，無疑推進了干燥冷凍法的發(fā)展。Olaciregui等已將其成功運用于動物精子的冷凍[11]，但干燥冷凍法對精子超微結構的影響還有待研究。

有研究[12-13]認為，慢速程序化冷凍法采用的CPA濃度較低、毒性較小，利于保存細胞活性；也有研究表明，玻璃化冷凍法使細胞內(nèi)外的水直接轉(zhuǎn)化為“玻璃化”狀態(tài)，減少冰晶，更有利于保存細胞形態(tài)[14]。綜上，究竟哪種方法更有利于保存細胞還存在爭議。不同比較角度可能導致得出的結論大相徑庭[15]。

2 冷凍保存對細胞的影響

2.1 低溫保護劑類型影響

生物組織中包含很多以電解質(zhì)水溶液形式存在的水。水溶液的凍結對生物體是致命的，所以要事先加入冷凍保護劑（cryoprotective agent,CPA）。常用的CPA分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。CPA可以通過降低細胞滲透性脫水、阻止冰晶形成、延緩凍結過程、增強樣品低溫耐受性等來減少低溫保存過程中冷凍對生物樣品的損傷[16]。雖然CPA在一定程度上能減少生物樣品在低溫保存中的損傷，但其本身也具有生物毒性，濃度過高的CPA自然而然會對細胞造成毒性損傷[17-18]。因此，開發(fā)高效無毒的低溫冷凍保護劑意義重大。

2.1.1 滲透性低溫保護劑

滲透性低溫冷凍保護劑分子量較小，可以通過滲透擴散的方式進出細胞，起到調(diào)節(jié)滲透壓并減輕胞內(nèi)冰晶損傷的作用。但此類保護劑一般都具有毒性，常用的主要有乙二醇、二甲基亞砜、甘油等，其中甘油對于大多數(shù)細胞滲透性都很低，應用較為有限。乙二醇具有較強滲透性且兼具低毒性[19]，而二甲基亞砜玻璃化能力較強但細胞復蘇時難以徹底清除。因此，目前的冷凍保護劑多選用乙二醇和二甲基亞砜的混合液，以獲得作用效果最好、毒性最低的冷凍保護液，使效果增強且毒性降低[20]。

2.1.2 非滲透性低溫保護劑

非滲透性保護劑分子量較大，必須采用輔助手段才能進出細胞，具有低毒性，能促進細胞外液形成玻璃化。主要包括蔗糖、海藻糖、聚蔗糖、葡聚糖和聚乙烯吡咯烷酮等，主要與滲透性低溫保護劑協(xié)同使用。此外，通過添加牛血清白蛋白等一些生物活性物質(zhì)，能夠起到穩(wěn)定細胞膜、阻止卵母細胞在冷凍過程中透明帶硬化的作用[21]。

2.1.3 抗凍蛋白低溫保護劑

鑒于傳統(tǒng)冷凍保護劑存在明顯的毒性問題，人們嘗試尋找天然物質(zhì)來代替有機溶劑充當保護劑的角色，抗凍蛋白就是其中的代表?？箖龅鞍装l(fā)現(xiàn)于南極的魚類中，這類魚生活在零下溫度的極地海洋。但是抗凍蛋白作為一種生物來源的外源物，用于人體時易引起免疫排斥反應。加之其分離較難，目前難以廣泛應用[22]。

2.2 冷凍解凍速率影響

2.2.1 冷卻速率

冷凍過程中，細胞受到損傷的主要溫度為0 ℃和-60 ℃[23]。細胞外液在-5 ℃到-10 ℃之間時形成冰晶，但細胞內(nèi)的水還未達到結晶程度。這時如果冷凍速率很高，細胞內(nèi)的水不能完全滲出，形成冰晶，會導致細胞受到機械損傷；如果冷凍速率很低，細胞中大部分水分滲出，細胞內(nèi)溶質(zhì)濃縮，細胞持續(xù)處于高滲狀態(tài)，持續(xù)收縮，使細胞器和細胞膜受損。此外，離子平衡在高滲環(huán)境下會被打破，從而使細胞在解凍過程中極易超過等滲體積形成腫脹[24]。因此，過高或過低的冷凍速率都可能導致細胞受到冷凍損傷，只有尋找到合適的冷卻速率才能達到相對平衡點，從而減輕胞內(nèi)冰晶對細胞的損傷。

2.2.2 解凍速率

凍存過程會對細胞造成機械損傷，解凍過程依然避免不了冰晶的形成，造成細胞損傷。解凍速率的快慢主要通過水浴溫度來調(diào)節(jié)。在解凍細胞的早期研究中，科學家采用在37 ℃的水浴中解凍12 s～30 s，或置于5 ℃的水浴中解凍2 min，比較發(fā)現(xiàn)快速解凍優(yōu)于慢速解凍[25]。研究表明低解凍速率會導致胞內(nèi)再結晶，且由于進入胞內(nèi)的滲透保護劑移除速率較慢，加劇胞內(nèi)外滲透壓的形成，使水分快速滲入細胞，最終破壞其質(zhì)膜結構。因此，解凍過程中細胞內(nèi)外滲透壓的平衡點，對找到最佳的解凍速率至關重要。

3 細胞冷凍保存的應用與存在問題

3.1 卵母細胞

低溫保存卵母細胞會對其造成冰晶損傷、毒性損傷及滲透損傷，這將阻止細胞解凍后的質(zhì)量提升。凍存成熟卵母細胞的主要問題是紡錘體對低溫及冷凍保護劑有很強的敏感性，極易在凍融過程中受到損傷。未成熟卵母細胞卻能較好地規(guī)避這一問題，其不具備紡錘體結構，避免了因紡錘體結構受到影響而導致的遺傳物質(zhì)受損等問題的產(chǎn)生。但未成熟卵母細胞凍融后的體外培養(yǎng)技術并不成熟，解凍后在體外難發(fā)育為優(yōu)質(zhì)成熟卵母細胞，面臨的受精差等問題還亟待解決[26]。

目前有學者提出將微流控法添加-去除保護劑分別與冷凍載體配合使用，選用透明陶瓷和玻璃制作集成一體化芯片冷凍保存豬卵母細胞，發(fā)現(xiàn)凍后質(zhì)量得到提高。這或許能為卵母細胞的低溫保存提供一個新的思路[27]。

卵母細胞冷凍保存技術避免了與未來使用相關的潛在問題，儲存女性生殖潛能可為那些生育能力受到細胞毒性治療威脅的婦女提供未來受孕的機會，因此更普遍地被接受。該技術的進步，特別是玻璃化的臨床應用，已經(jīng)顯著地改善了成熟卵母細胞冷凍保存的效果，這與胚胎冷凍保存的結果相當[28]。當玻璃化人卵母細胞產(chǎn)生有活力的囊胚時，活產(chǎn)成功與新鮮卵母細胞相當[29]。卵母細胞質(zhì)主要通過縫隙連接和顆粒細胞進行胞間交流從而加速胞質(zhì)成熟[30]，這一渠道極其脆弱，在凍融過程中很容易遭到破壞。所以在凍存以前，應當先采用IVM技術對未成熟卵母細胞進行培養(yǎng)，直至其成熟。雖然此種凍存方法已有多篇報道，但成功案例較少[31]，亟待進一步優(yōu)化。

宿主的客觀因素(年齡、供卵者和非供卵者卵母細胞質(zhì)量等)、冷凍方法的選擇、冷凍設備的質(zhì)量等都可以影響卵母細胞冷凍保存成功率[32]。加強對卵母細胞的凍存技術研究，有助于幫助因患卵巢早衰等生育疾病的婦女解決生育問題，對家庭及社會具有重要的研究意義。

3.2 精子細胞

精子目前為止是最常見的干燥細胞類型，主要來自小鼠和公牛。已經(jīng)應用了多種干燥方法，其中冷凍干燥占主導地位。迄今為止，小鼠精子、大鼠精子、倉鼠精子、兔精子及馬精子均已產(chǎn)生后代。超低溫保存的發(fā)展沒有超出大多數(shù)水生物種的探索性研究的地位，缺乏廣泛的應用。對于大多數(shù)水生物種來說，除了精子或體細胞之外，生物材料并沒有被全面地儲存起來，以代表和保存每個物種的廣泛的遺傳多樣性[33]。干燥的細胞在復水后大多不能恢復生物活性[34]。凍存人類精子的方法比較多，但常規(guī)方法均不利于精子量較少的樣本保存，精液標本在冷凍之前需加入冷凍保護劑，稀釋后精子密度急劇下降，加大凍融后尋找到合適的精子難度[35]。解凍后，精子標本需要經(jīng)過洗滌處理去除冷凍保護劑，這將進一步丟失更多的精子。但當以空卵透明帶為精子凍貯載體，再把精子顯微注射入其內(nèi)能較好凍存較少數(shù)量的精子[36]。另外，有研究表明，MQ秸稈與GEYC聯(lián)合作為低溫保護劑有利于低計數(shù)精液的低溫保存[37]。也有相關實驗證明冷凍前的梯度準備在冷凍前和融化后均能產(chǎn)生具有更好的活力的冷凍活體，更有利于精子的冷凍保存[38]。此外，未成熟精子體外培養(yǎng)技術及精原干細胞移植技術尚未成熟，因此臨床實踐中未廣泛開展。

3.3 組織、胚胎和幼蟲

胚胎冷凍保存有可能成為保護瀕危動物品種的有價值的工具[39]。由于過度捕撈，可食用的紅海膽、白鰭豚的自然種群正在減少。該物種的胚胎和幼蟲對于監(jiān)測海洋污染非常有用，因此有必要保護胚胎和幼蟲，以促進其在水產(chǎn)養(yǎng)殖和環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測的不同領域的使用[40]。癌癥或其他疾病的化療和放射治療可導致永久性不孕。雖然青春期和成年男性在治療之前可以選擇冷凍保存精子，但對于尚未產(chǎn)生精子的青春期前男孩來說，這并不是一個可以實施的選擇，人睪丸組織低溫保存技術的研究就很有必要[41]。目前有關研究都已經(jīng)取得一定進展，但凍后存活率和解凍后活性依然不盡如人意，有待進一步研究。

4 結論

低溫保存雖已取得了明顯的效益，但仍是遠未了結的課題。近年來，人們對低溫保存的興趣和研究成果急劇增加。目前能實現(xiàn)低溫保存的生物體，大多數(shù)是簡單的細胞，所謂組織保存，也是保存其中最主要的細胞。對干細胞的低溫保存也并非輕而易舉?？傊€需更進一步地研究低溫損傷機理，研發(fā)新的技術，探索新的保存程序，從而實現(xiàn)對更復雜的細胞、組織和器官實現(xiàn)低溫保存。