李竹，夏冰，汪家文，樂翠云，王承飛，丁九陽，汪元河

(貴州醫(yī)科大學(xué) 法醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004)

酒精濫用可導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變，進(jìn)而產(chǎn)生認(rèn)知及記憶障礙[1]。研究表明，高濃度酒精(25%)可明顯損傷小鼠空間記憶及記憶鞏固能力，主要機(jī)制為酒精可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子CREB蛋白磷酸化從而抑制記憶鞏固能力[2]。突觸是神經(jīng)系統(tǒng)中信息傳遞的重要結(jié)構(gòu)，其形態(tài)及功能直接影響著神經(jīng)元的信號傳遞過程，參與記憶的形成、鞏固及消退的調(diào)節(jié)過程[3]。大腦內(nèi)突觸的數(shù)量及形態(tài)是一個動態(tài)的過程，外源性及內(nèi)源性刺激維持著突觸形態(tài)和功能的動態(tài)平衡，稱為突觸可塑性[4]。酒精可使突觸形成障礙以及突觸丟失，主要機(jī)制為酒精可活化小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬突觸[5]。有學(xué)者在酗酒死者腦中檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞趨化因子的升高，以及小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增多[6]。樹突棘可分為成熟樹突棘與幼稚樹突棘兩類，前者包括樹樁狀樹突棘及蘑菇狀樹突棘，后者包括細(xì)絲狀樹突棘等[7]，高濃度酒精可使樹突棘數(shù)量明顯減少，而低濃度酒精引起樹突棘總量的變化。Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是一種小GTP酶，在記憶形成及提取過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，Rac1可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重塑來影響突觸形態(tài)和功能可塑性，因此被稱為突塑可塑性的分子開關(guān)[8]。學(xué)習(xí)記憶可誘導(dǎo)新的記憶形成，同時，也可以通過激活Rac1負(fù)向調(diào)控已存儲記憶[9]。酒精是否影響Rac1水平及樹突棘可塑性的研究未見報(bào)道，本文擬通過給予小鼠低濃度酒精(20%)制作亞急性模型，同時給予Rac1抑制劑干預(yù)，觀察酒精對樹突棘形態(tài)可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 C57BL/6雄性小鼠(SPF級，4周齡)15只，購自陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCXK(渝)2017-0032]。動物飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)動物中心，小鼠自由飲水及食物，12 h燈光光照/黑暗循環(huán)，環(huán)境溫度(22±3)℃、濕度45%～55%。

1.1.2試劑及藥品 β-actin (K200058M，北京索萊寶科技有限公司)，Synatophysin抗體(PA1-1043，美國Thermofisher Scientific公司)，Synapsin I抗體(A6442，美國Thermofisher Scientific)，PSD95(MA1-045，美國Thermofisher Scientific)，螢光黃(L0144，美國Sigma-Aldrich公司)。

1.1.3儀器 蔡司顯微鏡(LSM900，德國蔡司公司)，電泳儀(DYCP-31DN，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司)，ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tannon-5200，上海天能有限公司)，全自動膜片鉗系統(tǒng)(NPC-16,德國Nanion公司)，Morris水迷宮分析系統(tǒng)(XR-XM101，上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 15只4周齡野生型雄性小鼠隨機(jī)分成對照組(Control,Con組)、單純酒精處理組(Ethanol，Et組，小鼠腹腔注射20%乙醇2 mL/kg、每天1次、持續(xù)2周)及EHOP016治療組(Et+EHOP016組，小鼠腹腔注射20%乙醇2 mL/kg后、立即灌胃EHOP016 10 mL/kg、持續(xù)2周)。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 各組小鼠乙醇等藥物處理的最后5 d，開始Morris水迷宮檢測(平臺置于第3象限)，實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)練小鼠尋找平臺，若小鼠60 s內(nèi)未找到平臺、則引導(dǎo)其至平臺并停留30 s；將小鼠面壁由第1象限放入水迷宮中，觀察小鼠站上平臺時間、記錄為逃避潛伏期，同時記錄小鼠在60 s內(nèi)穿越平臺次數(shù)、以及平臺象限停留時間。

1.2.3樹突棘形態(tài)觀察 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后8 h，苯巴比妥麻醉小鼠后打開胸腔，蠕動泵針入左心室灌注生理鹽水3 min，待肝臟顏色變淡后將腦組織取出，置于4% 多聚甲醛內(nèi)固定48 h；振動切片機(jī)切片(40 μm)，利用膜片鉗系統(tǒng)玻璃電極將螢光黃注射入海馬錐體層細(xì)胞胞體內(nèi)(電流鉗制在1～3 nA,持續(xù)注射20 min)，直到所有樹突均顯示后撤除電極；封片后在共聚焦顯微鏡下觀察樹突棘形態(tài)。

1.2.4海馬Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1-三磷酸鳥苷(Rac1-GTP)、Ras相關(guān)的C3肉毒桿菌毒素底物1總蛋白(Total Rac1)、突觸素I(Synapsin I)、突觸體素(Synatophysin)和突觸后致密蛋白95(PSD95)表達(dá) 分離小鼠海馬組織，提取總蛋白后經(jīng)PAGE膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，再與Synapsin I、Synatophysin、PSD95、Rac1、Rac1-GTP及β-actin 抗體(1 ∶3 000稀釋)4 ℃孵育過夜；二抗室溫孵育1 h后滴加ECL發(fā)光液顯影，以β-actin值作為上樣控制，Image J軟件測量灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 酒精對小鼠海馬組織Rac1蛋白激活、樹突棘數(shù)量及記憶功能的影響

給予小鼠酒精處理2周后，Western blot結(jié)果顯示，兩組小鼠海馬組織Rac1總蛋白水平無差異，而Et組海馬組織激活型Rac1蛋白Rac1-GTP水平較Con組升高(P<0.05)；Synapsin I及Snyatophysin蛋白表達(dá)量較Con組降低(P<0.05，圖1)。Et組海馬區(qū)域樹突棘總數(shù)量較Con組明顯降低，主要表現(xiàn)為蘑菇型及樹樁狀樹突棘數(shù)量較Con組降低，而細(xì)絲狀樹突棘數(shù)量則無明顯差異(圖1)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Et組小鼠60 s內(nèi)平臺穿越次數(shù)及平臺象限停留時間較Con組減少(P<0.05，圖1)。

注：A為Western blot檢測Rac1-GTP、Total Rac1水平；B、C為Rac1-GTP、Total Rac1蛋白水平統(tǒng)計(jì)分析；D為螢光黃注射部位，黑框?yàn)楹ｑR神經(jīng)元錐體層細(xì)胞所在區(qū)域；E為小鼠海馬組織神經(jīng)元樹突棘熒光圖，Bar=1 mm；F為小鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元樹突棘總數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；G為小鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元各類樹突棘數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；H為小鼠水迷宮軌跡示意圖；I為小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺次數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；J為小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)平臺象限停留時間統(tǒng)計(jì)分析；K為小鼠海馬組織突觸相關(guān)蛋白Synapsin I及Snyatophysin免疫印跡示意圖及統(tǒng)計(jì)分析；(1)與Con組比較，P<0.05。圖1 酒精對小鼠海馬組織Rac1蛋白激活、樹突棘數(shù)量及記憶的影響Fig.1 Effects of ethanol on the number and memory of mice hippocampal dendritic spines activated by Rac1 protein

2.2 抑制Rac1激活對小鼠記憶的影響

給予Rac1抑制劑EPOH016后，Rac1-GTP表達(dá)量較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A、圖2B)。水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：Et組小鼠在第2、3、4及5天逃避潛伏期較Con組明顯升高(P<0.05)，給予EPOH016可明顯緩解Et導(dǎo)致的逃避潛伏期的升高；Et組小鼠穿越平臺次數(shù)及平臺象限停留時間較Con組減少(P<0.05)，而EPOH016可明顯逆轉(zhuǎn)Et導(dǎo)致的小鼠穿越平臺次數(shù)及平臺象限停留時間的減少(P<0.05)，同時EPOH016可緩解Et導(dǎo)致的小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的增高(P<0.05，圖2C～圖2F)。

注：A為Western blot檢測Rac1-GTP表達(dá)水平；B為Rac1-GTP表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)分析；C為小鼠水迷宮軌跡示意圖；D為小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期；E為小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)穿越平臺次數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；F為小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)平臺象限停留時間統(tǒng)計(jì)分析；(1)與Saline組比較，P<0.05；(2)與Et組比較，P<0.05。圖2 抑制Rac1激活對小鼠記憶的影響Fig.2 Effects of inhibition of Rac1 activation on memory in mice

2.3 抑制Rac1對小鼠樹突形態(tài)可塑性及突觸相關(guān)蛋白的影響

給予Rac1抑制劑EHOP016后，結(jié)果顯示EHOP016可逆轉(zhuǎn)Et誘導(dǎo)的樹突棘總數(shù)量、蘑菇狀及樹樁樣樹突棘的數(shù)量的丟失(P<0.05)，而對細(xì)絲狀樹突棘無影響(圖3A～圖3C)。Western blot結(jié)果顯示，酒精可導(dǎo)致突觸相關(guān)蛋白Synapsin I、Snyatophysin及PSD95水平下降(P<0.05)，而EHOP016可緩解Et導(dǎo)致的突觸相關(guān)蛋白Synapsin I、Snyatophysin及PSD95水平的降低(P<0.05，圖3D～圖3G)。

3 討論

本研究用20%濃度酒精給予小鼠連續(xù)處理2周，制作酒精亞急性模型，觀察到酒精可明顯損傷小鼠記憶能力，并可使背側(cè)海馬組織突觸相關(guān)蛋白明顯減少。本研究所用酒精濃度較其它研究中所使用的酒精濃度稍低，因濃度過高酒精腹腔注射會損傷腹腔臟器漿膜層，故本研究選擇了較為溫和的濃度為20%的酒精[10]。海馬結(jié)構(gòu)是短期記憶形成的主要腦區(qū)，短期記憶一般在背側(cè)海馬儲存并鞏固，而長期記憶的形成及鞏固則由背側(cè)海馬轉(zhuǎn)移至前額葉皮層[11]。因此，本研究選擇了背側(cè)海馬作為主要觀察區(qū)域，在短期內(nèi)(5 d)訓(xùn)練小鼠在Morris水迷宮尋找平臺，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與Louisa等[12]研究一致，酒精可明顯降低小鼠記憶能力。

注：A為小鼠海馬組織神經(jīng)元樹突棘熒光圖，Bar=1 mm；B為小鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元樹突棘總數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；C為小鼠海馬區(qū)域神經(jīng)元各類樹突棘數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；D為Western blot檢測突觸相關(guān)蛋白Synapsin I、Snyatophysin及PSD95水平；E為Synapsin I相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析；F為Snyatophysin相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析；G為PSD95蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析；(1)與Et組比較，P<0.05。圖3 抑制Rac1對小鼠突觸形態(tài)可塑性及突觸相關(guān)蛋白的影響Fig.3 Effects of Rac1 inhibition on synaptic morphologic plasticity and synaptic related proteins in mice

本研究發(fā)現(xiàn)，在給予小鼠酒精處理后，Rac1蛋白被激活，表現(xiàn)為Rac1-GTP水平升高，同時伴有記憶行為的損傷；而當(dāng)給予Rac1的抑制劑時，小鼠記憶得到明顯改善，表明酒精導(dǎo)致的小鼠空間記憶損害是Rac1依賴的過程。有研究表明，在小鼠背側(cè)海馬腦區(qū)抑制Rac1蛋白的表達(dá)可緩解酒精導(dǎo)致的記憶損害[13-15]。此外，在阿茲海默病小鼠模型中，抑制Rac1的激活也可緩解淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的記憶損害[16-18]。值得注意的是，Rac1在不同腦區(qū)的功能不盡相同，Rac1的激活參與背側(cè)海馬腦區(qū)短期記憶的消退，而在杏仁核區(qū)域Rac1的功能則完全相反，Rac1激活在杏仁核參與短期記憶的形成及鞏固過程[19-20]。這些均與本研究結(jié)果一致，表明Rac1可參與病理性的記憶損傷過程。

樹突棘的形態(tài)可塑性是突觸可塑性的表現(xiàn)形式，記憶的形成和鞏固一般伴隨成熟樹突棘數(shù)量的增加，而記憶的消退則伴有成熟樹突棘的丟失[21-22]。在本研究中，酒精可使蘑菇狀以及樹樁樣等成熟樹突棘數(shù)量的減少，而對幼稚型樹突棘即細(xì)絲狀樹突棘無影響，表明酒精可能是通過調(diào)節(jié)成熟樹突棘的數(shù)量來誘導(dǎo)記憶損傷。當(dāng)給予Rac1抑制劑時，小鼠海馬區(qū)域成熟樹突棘的數(shù)量較酒精處理組明顯增加，表明Rac1可通過調(diào)節(jié)成熟樹突棘的數(shù)量來影響記憶的過程。

綜上所述，酒精可激活Rac1、上調(diào)Rac1-GTP水平，導(dǎo)致成熟型樹突棘數(shù)量減少、突觸可塑性病理改變，最終導(dǎo)致記憶損傷；而抑制Rac1激活可明顯緩解酒精導(dǎo)致的記憶損害。因此，抑制Rac1可作為酒精導(dǎo)致記憶損傷的潛在靶點(diǎn)，為臨床上開發(fā)Rac1抑制劑治療酒精導(dǎo)致的記憶損害提供了研究基礎(chǔ)。