楊道麗，成元華

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 病理科，貴州 貴陽 550004)

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，具有高侵襲性和高死亡率的特點[1]。結(jié)腸癌在青少年群體患病率呈逐年上升趨勢[2]。96序列相似的家庭成員B(family with sequence similarity 96，member B，F(xiàn)AM96B)基因位于人類16號染色體，包含4個外顯子，編碼163個氨基酸。FAM96B蛋白能與鐵硫(Fe/S)輔助因子結(jié)合參與鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)，F(xiàn)e/S蛋白在DNA復(fù)制、修復(fù)、染色體分離及核糖體蛋白翻譯過程中起重要作用[3-4]。研究認(rèn)為，F(xiàn)AM96B是一種新型潛在的抑癌基因，與消化道惡性腫瘤(如：胃癌及肝癌)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-6]。FAM96B蛋白能增加細(xì)胞的增殖潛能、導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、啟動DNA損傷修復(fù)并維持基因組穩(wěn)定性[7-8]。研究表明，F(xiàn)AM96B蛋白能調(diào)節(jié)T細(xì)胞因子(T cell factor 4，TCF4)的表達，進而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移形成[9]。TCF4，亦稱轉(zhuǎn)錄因子E2-2，是Wnt信號通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一，該通路調(diào)控細(xì)胞生長及細(xì)胞周期，可誘導(dǎo)細(xì)胞大量增殖，最后導(dǎo)致腫瘤的形成[10]。失調(diào)的Wnt通路傳導(dǎo)不僅和癌癥的發(fā)生有關(guān)，而且在晚期癌癥和轉(zhuǎn)移患者中發(fā)揮著重要作用[11]。TCF4在調(diào)控轉(zhuǎn)錄過程中起著激活或抑制雙重作用，可調(diào)控下游基因的表達，從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[12]。因此，TCF4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，然而，涉及調(diào)控TCF4蛋白的因子仍然知之甚少。本研究通過探究結(jié)腸癌中FAM96B和TCF4蛋白的表達情況及其與臨床病理特征之間的關(guān)系，為進一步了解結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展機制及探索新的治療方法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標(biāo)本來源 收集2018年6月—2019年1月病理科保存的手術(shù)切除的結(jié)腸癌腫瘤組織蠟塊標(biāo)本60例作為觀察組，均經(jīng)2位高年資病理醫(yī)師閱片復(fù)查。60例結(jié)腸癌腫瘤組織，男性38例、女性22例，年齡26～82歲、平均(61.1±12.5)歲，據(jù)2010年第七版國際抗癌聯(lián)盟結(jié)腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ期10例、Ⅱ期27例、Ⅲ期18例及Ⅳ期5例，采用2010年WHO消化系統(tǒng)腫瘤組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)低分化癌19例、中分化癌29例及高分化癌12例。此外，選取其中20例患者的癌旁正常組織標(biāo)本作為對照組，男性12例，女性8例；年齡37～82歲、平均(62.0±11.8)歲。

1.1.2主要試劑及儀器 第一抗體FAM96B(多克隆，ab230410)購自英國Abcam公司，TCF4(多克隆，GTX52873)購自美國GeneTex公司，第二抗體(PV-9001)試劑盒、封閉用正常山羊血清(工作液)、濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)及抗原修復(fù)液購自北京中杉金橋生物公司，免疫組織化學(xué)染色缸和電熱恒溫水浴箱購自北京永光明醫(yī)療儀器有限公司、Leica DM6B正置數(shù)字科研顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 方法

1.2.1EnVision二步法檢測FAM96B和TCF4蛋白表達 將石蠟組織按4 μm的厚度切片，60 ℃烤箱烤片1 h，依次二甲苯脫蠟、梯度酒精下行入水；FAM96B、TCF4均用pH 6.0檸檬酸鹽溶液高溫高壓抗原修復(fù)(FAM96B修復(fù)3 min，TCF4修復(fù)5 min)，3%過氧化氫阻斷10 min，消除內(nèi)源性過氧化氫酶；加10%山羊血清工作液封閉(FAM96B封閉40 min，TCF4封閉20 min)，消除非特異性染色；分別滴加FAM96B一抗(稀釋度1 ∶300)、TCF4抗體(稀釋度1 ∶50)；4 ℃過夜，滴加二抗37 ℃孵育15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。

1.2.2結(jié)果判斷 FAM96B及TCF4蛋白細(xì)胞胞漿內(nèi)黃色顆粒狀著色為陽性，由2位病理醫(yī)師用雙盲法進行結(jié)果判定。采用200倍鏡下，每張切片隨機選擇5個視野，每視野計數(shù)100個細(xì)胞，計算陽細(xì)胞百分比，并觀察染色強度；采用免疫組織化學(xué)評分(immunohistochemical score，IHS)進行2組標(biāo)本中FAM96B和TCF4蛋白陽性表達的定量評價，即先按陽性細(xì)胞所占比例<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%及>75%分別記為0、1、2、3及4分，再按著色強度未著色、淺黃色、棕黃色及棕褐色分別記為0、1、2及3分，將2者得分相乘后取5個視野的平均分記為HIS，分?jǐn)?shù)越高，表示陽性越強，并將0～1分、2～4分、5～8分及9～12分分別定義為“-”、“+”、“++”及“+++”，后3個等級合并稱為陽性表達[13]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FAM96B與TCF4蛋白的表達

FAM96B表達癌旁組織的肌層、血管壁平滑肌及結(jié)腸癌腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)AM96B在對照組中的陽性表達程度最強，次之為高分化結(jié)腸癌，低分化結(jié)腸癌組織表達最弱；TCF4表達于對照組結(jié)腸黏膜腺體及結(jié)腸癌組織腫瘤細(xì)胞，對照組表達最弱，次之為高分化結(jié)腸癌，低分化結(jié)腸癌組織表達程度最強；觀察組標(biāo)本FAM96B蛋白的IHS評分較對照組低，TCF4蛋白的IHS評分則較對照組高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1和表1。

注：A、D為對照組，B、E為高分化結(jié)腸癌組織，C、F為低分化結(jié)腸癌組織。圖1 不同組織中FAM96B和TCF4蛋白的表達(EnVision，×200)Fig.1 Expression of FAM96B and TCF4 in observation group and control group(EnVision，×200)

表1 觀察組和對照組組織中FAM96B與TCF4蛋白表達定量評價Tab.1 FAM96B and TCF4 protein expression in observation group and control group

2.2 FAM96B和TCF4蛋白表達與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

免疫組化結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中FAM96B蛋白在未侵及漿膜層的陽性表達率高于侵及漿膜層，在低分化結(jié)腸癌組織中的陽性表達率低于中分化及高分化的結(jié)腸癌組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TCF4蛋白在低分化結(jié)腸癌中的陽性表達率高于中、高分化，Ⅰ～Ⅱ期中的陽性表達率低于Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)。見表2。

表2 結(jié)腸癌組織中FAM96B和TCF4蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Relationship between FAM96B and TCF4 protein expression and clinicopathological features in colon cancer

2.3 FAM96B與TCF4蛋白表達的相關(guān)性

Spearman等級相關(guān)分析顯示，F(xiàn)AM96B蛋白表達與TCF4蛋白表達無相關(guān)性(r=0.052，P=0.692)。見表3。

表3 結(jié)腸癌組織中FAM96B與TCF4蛋白表達的相關(guān)性(n)Tab.3 Correlation of FAM96B and TCF4 protein expression in colon cancer(n)

3 討論

結(jié)腸癌是最常見的第3種惡性腫瘤，目前的治療方式仍不能完全有效地延緩或終止疾病的發(fā)展[14-15]。因此，積極研究結(jié)腸癌新的治療靶點具有重要意義。FAM96B與細(xì)胞的增殖及遷移有關(guān)，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系[5-6,9,16]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)AM96B蛋白在觀察組標(biāo)本中的IHS評分較對照組低，結(jié)腸癌浸潤程度越深、分化程度越低，F(xiàn)AM96B蛋白表達水平越低，但在不同性別、年齡、腫瘤大小及臨床分期組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這與FAM96B已知的基本生物學(xué)功能相吻合，也與Jin等[16]報道FAM96B低表達狀態(tài)與前列腺癌的發(fā)生有一定關(guān)系相一致。蔡遜等[17]較早報道了過表達的FAM96B能誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，可抑制腫瘤細(xì)胞進一步增殖。此外，國內(nèi)部分研究也證實FAM96B在消化道上皮源性惡性腫瘤(胃癌及肝癌等)中呈低表達，過表達的FAM96B能抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，有望成為惡性腫瘤潛在的診斷和治療靶點[5-6]。此外，本課題組前期研究已表明，F(xiàn)AM96B在胃腸道間質(zhì)瘤中表達減少甚至缺失，與胃腸道間質(zhì)瘤腫瘤大小及危險度分級有關(guān)[18]。本研究結(jié)果還顯示FAM96B蛋白的低表達影響結(jié)腸癌腫瘤的浸潤深度和病理學(xué)分型，隨著FAM96B蛋白表達的減少，結(jié)腸癌腫瘤浸潤深度加深和(或)病理學(xué)分化程度降低。

TCF4是Wnt通路關(guān)鍵條件因素之一，與細(xì)胞增殖相關(guān)[10-11]。TCF4在少突膠質(zhì)細(xì)胞的終末分化和中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成是必需的[19]。TCF4具有雙向調(diào)節(jié)的作用，高表達可明顯抑制胚胎性腦腫瘤髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，其表達量的多少與臨床結(jié)果顯著相關(guān)[20]；TCF4在原發(fā)性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤中呈高表達狀態(tài)，蛋白免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記TCF4為原發(fā)性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤的診斷提供了一種可靠、獨立及經(jīng)濟的方法[21]；Lydia等[22]報道了沉默TCF4可以增強結(jié)腸癌患者對常用化療藥物的敏感性，且TCF4蛋白含量越高，患者總生存期越短;Florentien等[23]證實了TCF4在急性髓系白血病中呈高表達狀態(tài)，是急性髓系白血病的獨立預(yù)后不良因素，可指導(dǎo)該病的治療決策;Neerj等[24]研究提出TCF4蛋白過表達會導(dǎo)致患者發(fā)生基因突變，進而導(dǎo)致彌漫大B淋巴瘤形成,在彌漫大B淋巴瘤小鼠模型中，降低TCF4的表達能抑制腫瘤的生長并延長小鼠生存期，靶向抑制TCF4的表達有望治療復(fù)發(fā)或難治性彌漫大B淋巴瘤。本研究通過檢測觀察組和對照組標(biāo)本中TCF4蛋白的表達情況，結(jié)果表明觀察組標(biāo)本中TCF4的IHS評分較對照組高，說明觀察組標(biāo)本中TCF4蛋白表達較對照組高；分化程度越低，臨床分期越高，TCF 4蛋白表達越高，但在不同性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤浸潤分組組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。這提示TCF4蛋白的表達與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；隨著TCF4蛋白表達增加，結(jié)腸癌病理組織分化程度降低或臨床分期增高。

Yang等[9]報道FAM96B作為TCF4的調(diào)節(jié)基因，能調(diào)控TCF4蛋白的表達，進而在血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移形成中發(fā)揮重要作用。本研究采用Spearman等級相關(guān)分析了觀察組標(biāo)本中FAM96B與TCF4蛋白表達情況的相關(guān)性，結(jié)果顯示FAM96B在結(jié)腸癌組織中呈低表達，TCF4在結(jié)腸癌組織中呈高表達，但FAM96B與TCF4表達無相關(guān)性。分析可能是FAM96B與TCF4的表達水平缺乏線性關(guān)系，TCF4受多種調(diào)控因子影響等。關(guān)于FAM96B是否能調(diào)控TCF4及調(diào)控的具體機制還需進一步探究。

綜上，F(xiàn)AM96B在結(jié)腸癌中表達減少甚至缺失，并與結(jié)腸癌浸潤深度及病理組織分型有關(guān)；TCF4在結(jié)腸癌中表達增加，并與結(jié)腸癌病理組織分型及臨床分期有關(guān)。提示FAM96B、TCF4與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，這為臨床提供了新的治療靶點和思路。