姚佳麗，徐海能，范齊昀，董昭駿，吳建章

溫州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)生物學(xué)研究中心，浙江 溫州 325035

胃癌的發(fā)生與食用熏烤、鹽腌食品等飲食習(xí)慣密切相關(guān)，因此其在我國等東亞人群中發(fā)病率極高，其中我國胃癌發(fā)病例數(shù)約占全球50%[1]。近年來由于胃鏡等檢測手段的普及，胃癌的早期診斷率在日本、韓國已分別高達(dá)60%、70%。而我國的早期胃癌診斷率仍然較低（＜10%），70%胃癌患者為進(jìn)展期或晚期，化療是進(jìn)展期或晚期胃癌除外科手術(shù)以外的必備治療手段[1-2]。但目前被批準(zhǔn)用于胃癌臨床治療的靶向藥物僅針對HER2和VEGFR靶點(diǎn)，氟尿嘧啶等傳統(tǒng)細(xì)胞毒類化療藥物仍然是一線化療用藥，而該類藥物具有非常大的不良反應(yīng)[1，3]。

五味子丙素為木質(zhì)素的一種，也是中藥五味子中主要的活性成分之一，具有保肝[4]、抗氧化[5-6]、抗炎[7]等藥理學(xué)活性。近年來相繼發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素類化合物也具有較好的抗腫瘤活性，但是目前有關(guān)五味子丙素抗腫瘤活性的報道極少。本研究分析了五味子丙素的體外抗胃癌活性及其對臨床化療藥物的體外增敏活性，為五味子丙素在臨床中的應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌細(xì)胞AGS（上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心），五味子丙素（成都普思生物科技有限公司），MTT粉末（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PBS緩沖液、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（美國Gibco公司），凋亡試劑盒（美國BD Biosciences Clontech公司），Cleaved-PARP抗體、Bax抗體（美國Cell Signaling Technology公司），Bcl-2抗體（美國Santa Cruz公司），GAPDH抗體（杭州賢至生物科技有限公司），結(jié)晶紫染色液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：AGS細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基置于恒溫培養(yǎng)箱，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)：將AGS細(xì)胞消化鋪板，待細(xì)胞貼壁后，加藥。藥物孵育72 h后加入MTT溶液，4 h后吸去培養(yǎng)基，加入DMSO，在微型振蕩儀上振蕩至甲臜完全溶解后用酶標(biāo)儀測定吸光值（OD值）。抑制率=（1-藥物組吸光度的平均值/DMSO組吸光度的平均值）×100%。在測定藥物對細(xì)胞生長抑制活性的半數(shù)抑制濃度（IC50）中，藥物設(shè)置9個濃度（100、80、70、60、50、40、35、20、10 μmol/L），用Graphpad 7.0計算IC50。

1.2.3 細(xì)胞集落克隆形成實(shí)驗(yàn)：取AGS細(xì)胞鋪入6孔板（5 000個細(xì)胞/孔）。培養(yǎng)20 h細(xì)胞貼壁后加五味子丙素，設(shè)置DMSO組、五味子丙素10 μmol/L組、五味子丙素20 μmol/L組、五味子丙素30 μmol/L組、五味子丙素40 μmol/L組。96 h后換液（同時再加五味子丙素）。7 d后，棄培養(yǎng)基，常規(guī)清洗后4%多聚甲醛固定。常規(guī)清洗后加結(jié)晶紫染色液。最后回收結(jié)晶紫染色液，常規(guī)清洗后晾干拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡：取AGS細(xì)胞鋪于6 孔板（20 萬個細(xì)胞/孔），20 h細(xì)胞貼壁后換液加五味子丙素。分別設(shè)置DMSO組、五味子丙素20 μmol/L組、五味子丙素40 μmol/L組、五味子丙素60 μmol/L組。藥物孵育36 h后，收集全部細(xì)胞，PBS洗后，離心棄去PBS。加入稀釋后的Annexin V binding buffer，在加Annexin V/PI共染。染色結(jié)束，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，F(xiàn)lowJo 7.6軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.5 Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)：取AGS細(xì)胞鋪于6孔板，每孔20萬個細(xì)胞。20 h細(xì)胞貼壁后加五味子丙素，藥物分組同上。藥物作用30 h后提總蛋白，制備蛋白樣品?？偟鞍壮Ｒ?guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育（一抗1:1 000稀釋，二抗1:5 000稀釋）、常規(guī)洗膜，隨后在凝膠成像系統(tǒng)下檢測目的蛋白，并用Image Lab軟件進(jìn)行處理分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用Graphpad Prism 7.0軟件繪圖，SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五味子丙素抑制胃癌細(xì)胞生長 五味子丙素具有較好的體外抗胃癌活性，其IC50為（35.73±5.73）μmol/L（見圖1）。集落形成實(shí)驗(yàn)顯示，五味子丙素也能以濃度劑量依賴性地抑制AGS細(xì)胞生長，在濃度為20 μmol/L時對集落的形成就具有很好的抑制作用（見圖2）。

圖2 五味子丙素對AGS集落形成的影響

2.2 五味子丙素誘導(dǎo)AGS凋亡 流式細(xì)胞儀測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子丙素在40 μmol/L時就能明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，其在濃度為40 μmol/L和60 μmol/L時細(xì)胞總凋亡率分別為32.1%和38.4%，晚期凋亡率分別為20.9%和22.8%，因此主要表現(xiàn)為晚期凋亡（見圖3）。

2.3 五味子丙素對凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western blot檢測五味子丙素對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μmol/L的五味子丙素孵育細(xì)胞24 h后就能夠明顯上調(diào)凋亡蛋白Cleaved-PARP，并下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)（見圖4A）；不同濃度梯度的五味子丙素孵育細(xì)胞后，對Cleaved-PARP和Bcl-2的影響呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性，在40 μmol/L下就表現(xiàn)出明顯的活性（見圖4B）。但是，五味子丙素對凋亡蛋白Bax的表達(dá)沒有明顯的影響。

圖3 五味子丙素對AGS凋亡的影響

2.4 五味子丙素對5-FU的增敏活性 用MTT法進(jìn)一步研究了五味子丙素對5-FU的增敏活性。結(jié)果顯示設(shè)置的9 個聯(lián)合用藥濃度組合均具有比相應(yīng)單藥更強(qiáng)的抑制細(xì)胞生長活性（其中五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L和五味子丙素40 μmol/L+5-FU 2 μmol/L聯(lián)合組與5-FU 2 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 3 μmol/L聯(lián)合組與5-FU 3 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L、五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L聯(lián)合組與5-FU 4 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素20 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素20 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素20 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；五味子丙素30 μmol/L+5-FU 2 μmol/L、五味子丙素30 μmol/L+5-FU 3 μmol/L和五味子丙素30 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素30 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）；五味子丙素40 μmol/L+5-FU 4 μmol/L與五味子丙素40 μmol/L單藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），可知五味子丙素表現(xiàn)了較好地增敏5-FU的抗胃癌活性。

3 討論

圖4 五味子丙素不同時間（A）和不同濃度（B）孵育對AGS凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 五味子丙素增敏5-FU的抗胃癌活性

五味子是一種在我國應(yīng)用最廣泛的滋補(bǔ)中藥之一，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列五味子為上品，藥用價值極高，能滋補(bǔ)強(qiáng)壯之力，有強(qiáng)身健體之效。五味子的主要活性成分為木質(zhì)素，主要包括五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素[8]。研究顯示，五味子的保護(hù)心臟和心血管、肝臟等作用與木質(zhì)素類的抗炎、抗氧化活性密切相關(guān)[8]。近年來的研究顯示，木質(zhì)素類成分也具有良好的抗腫瘤活性，其中五味子乙素和五味子甲素都有較多的研究報道。如五味子乙素對肺癌、肝癌、前列腺癌、胃癌等惡性腫瘤均具有較好的體外抗腫瘤活性[9]；對膠質(zhì)瘤、乳腺癌具有良好的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性[9]；五味子甲素對膽管癌[10]、結(jié)腸癌[11]、乳腺癌[12]、胰腺癌[13]均具有良好的體外腫瘤活性，對肺癌具有良好的體內(nèi)外抗腫瘤活性[14]。而五味子丙素抗腫瘤活性的研究報道極少，目前僅PARK等[15]報道其通過抑制U937細(xì)胞的生長、阻滯周期和誘導(dǎo)凋亡來發(fā)揮抗腫瘤活性；LU等[16]報道其能較好地抑制肝癌細(xì)胞（Bel-7402）的生長[IC50=（81.58±1.06）μmol/L]。本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素能較好地抑制胃癌細(xì)胞生長，并能夠明顯影響凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved-PARP、Bcl-2）的表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。

靶向藥物是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)，目前已有多種該類藥物上市。但是，胃癌的靶向藥物極少，應(yīng)用于臨床的僅有HER2抑制劑曲妥珠單抗和VEGFR抑制劑雷莫蘆單抗，這導(dǎo)致了目前從靶向藥物獲益的胃癌患者極其有限[1]。因此胃癌化療的一線主要用藥仍然是氟尿嘧啶等經(jīng)典細(xì)胞毒類化療藥物，而該類藥物的選擇性差，在靶向腫瘤的同時，對正常細(xì)胞核組織也具有很大的殺傷作用，不良反應(yīng)非常大[1]。聯(lián)合用藥是解決此類問題的有效策略，最理性的聯(lián)合藥物應(yīng)該是：能夠?qū)熕幬镌雒?，且不增加不良反?yīng)，甚至可以降低化療不良反應(yīng)。但是，目前一般的聯(lián)合用藥策略均注重增敏，而安全性被忽略了，因此聯(lián)合用藥會帶來更大的不良反應(yīng)。從具有器官保護(hù)作用的藥物中挖掘聯(lián)合用藥藥物是最佳策略，如五味子乙素能使實(shí)驗(yàn)小鼠的心臟免受抗腫瘤藥物多柔比星引起的不良反應(yīng)，對鉑類化合物引起的腎臟毒性具有緩解作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素具有很好地增敏5-FU的體外抗胃癌活性。由于五味子丙素對肝臟等器官也具有很好的保護(hù)作用，預(yù)期其對胃癌化療增敏的同時，極大可能也會具有降低氟尿嘧啶類化療毒性的作用，但其體內(nèi)增敏和降低不良反應(yīng)的藥效還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五味子丙素不僅具有較好的體外抗胃癌活性，也具有明顯增敏胃癌化療的作用，可能成為低毒的胃癌化療候選新藥。