肖 珊，馬郁文，李 婧，張彥紅，何 泓，方春香，王萬銘

1華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢430014；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州511400；3廣州市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州511400；4廣州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東 廣州511400；5長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院，湖北 武漢430000；6武漢腦科醫(yī)院，湖北 武漢430000

心血管疾病在全球范圍內(nèi)有著很高的致死率，其發(fā)病機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，包括了炎癥的發(fā)生以及血管的病變等［1-2］。血管緊張素II（Ang II）是RAAS的血管活性肽，具有強(qiáng)效收縮血管作用，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在高血壓調(diào)節(jié)中起重要作用［3-4］。Ang II通過與特定受體結(jié)合來調(diào)節(jié)自身作用從而調(diào)節(jié)心血管穩(wěn)態(tài)，AT1受體參與血管緊張素的主要病理生理作用［5-6］。在低血壓狀態(tài)下，Ang II通過AT1激活RAS系統(tǒng)后，通過促進(jìn)Ca2+流入增加引起的血管收縮，減少NO 產(chǎn)生并且刺激醛固酮的產(chǎn)生，同時(shí)增加炎癥因子的表達(dá)，從而能促進(jìn)自身免疫功能障礙的發(fā)展［7-8］。單磷酸腺苷活化蛋白激酶AMPK是一種應(yīng)激活的蛋白酶，是細(xì)胞ATP水平的代謝傳感器，是關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子也是一種氧化還原敏感酶［9］。SIRT1是一種NAD+依賴的去乙?；福谘装Y反應(yīng)和免疫中發(fā)揮多種作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)AMPK 的激活可提高細(xì)胞內(nèi)NAD+濃度，從而激活SIRT1的表達(dá)。AMPK和SIRT1對(duì)機(jī)體的能量代謝敏感，兩者發(fā)揮著協(xié)調(diào)作用共同維持著機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)［11］。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，Ang II通過抑制AMPK/SIRT1通路促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生發(fā)展［12-13］，但是具體的機(jī)制尚未闡明。本研究通過構(gòu)建Ang II抑制巨噬細(xì)胞AMPK/SIRT1通路的活化的細(xì)胞模型進(jìn)一步探討其具體機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

Ang II（SIGMA,SML0142），Lipofec-tamine 3000轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒（Invitrogen，L3000075），DMED-F12（Gibco，C11875500BT）；胎牛血清（Gibco，10091148）；0.25%EDTA 胰酶（Gibco，25100-056）；青霉素/鏈霉素（Gibco，15140-122）；活性氧ROS 試劑盒（南京建成，E004）；SOD試劑盒（南京建成，A001-3）；MDA試劑盒（南京建成，A003-1）；AT1 抗體（Affinity，DF4910）PAMPK 抗體（Abcam，ab18528）；AMPK 抗體（CST，5832S）；SIRT1 抗體（Santa，SC-515045）；β-actin 抗體（Boster，BM0627）；Anti-Rabbi（CST，7074S）；Anti-Mouse（CST，7076S）。

1.2 儀器與設(shè)備

Western blot 電泳儀（型號(hào)：PowerPacTM HC，BIO-RAD）；化學(xué)發(fā)光成像儀（型號(hào)：TANON 5200，TANON）。激光共聚焦熒光顯微鏡（型號(hào)：LSM800，ZEISS）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）購(gòu)于ATCC。RAW264.7 細(xì)胞的培養(yǎng)用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM-F12 完全培養(yǎng)基，37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。將細(xì)胞接種到6 孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，給予不同濃度的Ang II（0、0.5、1、3、10、20 μmol/L）刺激，24 h后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 Western blot 檢測(cè) AT1，AMPK，P-AMPK,SIRT1的表達(dá)，RIPA 細(xì)胞裂解液（Themor Scientific,Rockford,USA）提取各分組的總蛋白，用BCA（碧云天）試劑盒測(cè)定濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，然后金屬浴100 ℃蛋白變性5 min，于-20 ℃保存。配制12%分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到0.22 μmol/L PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別用AT1，AMPK，P-AMPK，SIRT1，β-actin 抗體孵育，先室溫孵育1 h，然后4 ℃過夜，TBST洗3次后，二抗孵育2 h，TBST 洗3 次，再使用ECL 法曝光顯影。采用Image J 軟件進(jìn)行對(duì)蛋白條帶灰度值的計(jì)算。

1.3.3 檢測(cè)SOD 和MDA 的表達(dá) 96 孔板接種細(xì)胞，待RAW264.7細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)給予Ang II 刺激，24 h后吸取細(xì)胞上清液，用來檢測(cè)SOD活性和MDA表達(dá)量。

1.3.4 實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞ROS 96孔板接種細(xì)胞，1萬/孔巨噬細(xì)胞，5～6 h后給予不同濃度的Ang II干預(yù)，刺激24 h后，吸出細(xì)胞培養(yǎng)基，用含DCFH-DA探針20 μmol/L的PBS避光37 ℃孵育細(xì)胞30 min，然后用PBS清洗細(xì)胞2遍，最后加入150 μL/孔PBS，放入實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)儀里，用其熒光顯微鏡拍照記錄。

1.3.5 shRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染 巨噬細(xì)胞內(nèi)AT1R 受體的沉默運(yùn)用shRNA 技術(shù)，利用CRISPR 設(shè)計(jì)工（gttp：//crispr.mit.edu/）編輯CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的AT1R受體的基因序列，shRNA 序列合成后，由BBSl酶切導(dǎo)入PX459質(zhì)粒中。AT1R 受體shRNA 的序列為：5'-CTTTCTTCT AAATCTCGCCC-3'。采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

1.3.6 ROS 抑制劑干預(yù) 將細(xì)胞接種到六孔板中，分組為Ang II刺激組和Apocynin抑制組，貼壁后用20 μmol/L Ang II以及100 μmol/L Apocynin刺激細(xì)胞24 h，提取蛋白。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ang II抑制巨噬細(xì)胞AMPK/SIRT1信號(hào)通路

分別給予RAW264.7不同濃度的Ang II（0、0.5、1、3、10、20 μmol/L），刺激24 h后檢測(cè)P-AMPK、AMPK、SIRT-1 蛋白的表達(dá)量。與對(duì)照組相比，0.5～10 μmol/L的Ang II 的干擾對(duì)細(xì)胞蛋白的表達(dá)無明顯變化，但20 μmol/L的Ang II的刺激能顯著抑制蛋白AMPK的磷酸化（圖1A、B），同時(shí)抑制SIRT1 的表達(dá)（圖1C、D）。

2.2 Ang II活化巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)

分別不同濃度劑量的Ang II（0、0.5、1、3、10、20 μmol/L）刺激巨噬細(xì)胞，刺激24 h后用實(shí)時(shí)細(xì)胞檢測(cè)儀顯微鏡拍照細(xì)胞內(nèi)ROS 的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.5～10 μmol/L Ang II 處理后細(xì)胞的ROS 的釋放沒有明顯增加，而20 μmol/L 的Ang II刺激明顯增加了細(xì)胞ROS的釋放（圖2A、B）。在檢測(cè)SOD活性和MDA表達(dá)量時(shí)，0.5～10 μmol/L的Ang II對(duì)細(xì)胞無明顯改變，20 μmol/L的AngII明顯抑制SOD 活性（圖2C），能顯著增加MDA的產(chǎn)生（圖2D）。

圖1 Angiotensin II 對(duì)巨噬細(xì)胞AMPK/SIRT1 信號(hào)通路的影響Fig.1 Effect of angiotensin II on AMPK/SIRT1 signaling pathway in macrophages. A, B: Western blotting of AMPK and p-AMPK in angiotensin II-treated macrophages(n=3).*P＜0.05 vs 0 μmol/L.C,D:Western blotting of SIRT1 in angiotensin II-treated macrophages(n=3).*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

2.3 shAT1R 巨噬細(xì)胞阻斷了Ang II 對(duì)AMPK/SIRT1信號(hào)通路的抑制作用

將細(xì)胞分為scramble組和shAT1R組，給予20μmol/L有效劑量Ang II的刺激，24 h后檢測(cè)P-AMPK、AMPK、SIRT1蛋白的表達(dá)量。Scramble 組與對(duì)照組相比，刺激組的AMPK 的磷酸化和SIRT1蛋白的表達(dá)量均減少；但shAT1R組中，與對(duì)照組相比較，Ang II 刺激后細(xì)胞的AMPK的磷酸化水平和SIRT1蛋白的表達(dá)量均沒有明顯改變（圖3）。

圖2 Angiotensin II 對(duì)巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of angiotensin II on oxidative stress response in macrophages.A,B:Quantitative analysis of ROS expression stained with DCFH-DA by flow cytometry.C:SOD activity in RAW264.7 cells stimulated with 0,0.5,1,3,10,and 20 μmol/L angiotensin II.D:MDAlevels in RAW264.7 cells stimulated with 0,0.5,1,3,10,and 20 μmol/Langiotensin II.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.

2.4 shAT1R巨噬細(xì)胞抑制Ang II對(duì)活性氧的釋放

將細(xì)胞分為scramble 組和shAT1R 組，給予20 μmol/L有效劑量Ang II的刺激，24 h后分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 的釋放量，以及SOD 活性和MDA 的表達(dá)量。單純對(duì)比Ang II刺激組，scramble組的ROS釋放量和MDA的表達(dá)量明顯高于shAT1R組，且scramble組的SOD活性低于shAT1R組（圖4）。

2.5 ROS 抑制劑APO 能阻斷Ang II 對(duì)AMPK/SIRT1信號(hào)通路的抑制作用

將細(xì)胞分為對(duì)照組、Ang II刺激組和APO 抑制劑組，Ang II刺激組給予20 μmol/L有效劑量Ang II的刺激，APO抑制劑組在給予20 μmol/L 有效劑量Ang II的刺激的同時(shí)，加入100 μmol/L的APO處理24 h。結(jié)果顯示，與Ang II刺激組相比，APO抑制劑組中AMPK的磷酸化和SIRT1蛋白的表達(dá)水平有所增加。

圖3 Angiotensin II 對(duì)shAT1R 巨噬細(xì)胞AMPK/SIRT1 信號(hào)通路的影響Fig.3 Effect of angiotensin II on AMPK/SIRT1 signaling pathway in macrophages with AT1R gene silencing.A, B: Western blotting showing the efficiency of AT1R gene silencing (*P＜0.05). C, D: Western blotting showing the effects of Ang II and AT1R gene silencing on the expressions of AMPK and p-AMPK(n=3).**P＜0.05;##P＜0.01.E,F:Western blotting showing the effects of Ang II and AT1R gene silencing on the expression of SIRT1 (n=3).**P＜0.05.##P＜0.01.

3 討論

本研究證明了在巨噬細(xì)胞中，過多的ROS合成可以抑制AMPK/SIRT1信號(hào)通路激活。結(jié)果證明，Ang II激活A(yù)T1受體會(huì)促進(jìn)ROS的合成增加，從而抑制了磷酸化AMPK和SIRT1的表達(dá)，shRNA敲減AT1受體后會(huì)抑制巨噬細(xì)胞中ROS的生成以及促進(jìn)AMPK磷酸化水平和SIRT1的表達(dá)。使用ROS抑制劑APO可以阻斷AT1受體激活后對(duì)AMPK磷酸化水平和SIRT1蛋白表達(dá)的抑制作用。

AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中充當(dāng)能量傳感器［14］。SIRT1主要位于細(xì)胞核中，它參與了心臟中能量產(chǎn)生，氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的生物學(xué)功能［15-16］。SIRT1是一種AMPK調(diào)控的NAD+依賴性蛋白去乙?；?，AMPK可以通過增加NAD+/NADPH比值來充當(dāng)SIRT1激活劑，同時(shí)SIRT1也能調(diào)節(jié)AMPKα的活性［17-19］。文獻(xiàn)報(bào)道AMPK/SIRT1通路可以調(diào)節(jié)血管緊張素II在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)心臟肥大和損傷［20］，使用基因突變小鼠模型的研究表明SIRT1 具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，過表達(dá)SIRT1減輕了Ang II誘導(dǎo)的小鼠血管重構(gòu)和高血壓［21］。炎癥與心血管疾病的發(fā)病機(jī)制和預(yù)后密切相關(guān)，巨噬細(xì)胞在心血管疾病中扮演著重要作用角色［22-23］。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，血管緊張素Ⅱ處理的小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，炎癥反應(yīng)增加，出現(xiàn)血壓升高，血管功能障礙的現(xiàn)象。其機(jī)制可能與巨噬細(xì)胞的AMPK/SIRT1信號(hào)通路有關(guān)［24-25］。本研究數(shù)據(jù)表明，在20 μmol/LAng II的刺激下，巨噬細(xì)胞中磷酸化的AMPK的表達(dá)水平降低，SIRT1的蛋白表達(dá)下降，這說明Ang II在巨噬細(xì)胞中能抑制AMPK/SIRT信號(hào)通路的活化。

氧化應(yīng)激反應(yīng)代表細(xì)胞內(nèi)存在過多的活性氧（ROS），可促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生并極大地促進(jìn)心血管疾病的發(fā)展。細(xì)胞通過連續(xù)產(chǎn)生活性氧，以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，分化和凋亡等反應(yīng)［20,26］。Ang II可以通過煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶刺激ROS的產(chǎn)生并引起炎癥［27］。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明了Ang II能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的ROS 的過度釋放，抑制超氧化物歧化酶（SOD）的活性，降低了細(xì)胞清除由于細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生廢物的能力，增加了氧化終產(chǎn)物丙二醛表達(dá)量。

圖4 Angiotensin II 對(duì)shAT1R 巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響Fig.4 Effect of angiotensin II on oxidative stress response in macrophages with AT1R gene silencing. A, B: Western blotting showing the efficiency of AT1R gene silencing (**P＜0.01). C, D: Quantitative analysis of ROS expression in the macrophages stained with DCFH-DA by flow cytometry(*P＜0.05;#P＜0.05).E:Effect of 20 μmol/L angiotensin II stimulation on SOD activity in RAW264.7 cells transfected with in scramble and shAT1R constructs(*P＜0.05;#P＜0.05).F:Effect og 20 μmol/L angiotensin II on MDAlevel in RAW264.7 cells transfected with in scramble and shAT1R constructs(*P＜0.05;#P＜0.05).

血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1受體)是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的關(guān)鍵分子之一。AT1受體促進(jìn)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，導(dǎo)致高血壓、內(nèi)皮功能障礙、血管重塑和終末器官損傷。通過激活A(yù)T1，血管緊張素（Ang）II驅(qū)動(dòng)血流動(dòng)力學(xué)損傷，隨后單核細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞在高血壓期間進(jìn)入心臟、血管和腎臟［28］。目前文獻(xiàn)報(bào)道激活A(yù)T1受體對(duì)巨噬細(xì)胞的功能有影響。巨噬細(xì)胞中的AT1可以調(diào)控NF-kappaB的活性，AT1的激活會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)的積累、遷移和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時(shí)使動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)巨噬細(xì)胞群的分布向促炎性M1表型發(fā)展，減少M(fèi)2巨噬細(xì)胞的表型，巨噬細(xì)胞中AT1受體敲除后，阻礙了UNX對(duì)M2巨噬細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化的影響［29］。有文獻(xiàn)報(bào)道，使用AT1 受體拮抗劑替米沙坦會(huì)增加AMPK 的磷酸化水平，促進(jìn)AMPK信號(hào)通路的活化來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［30］。為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞中AT1受體和AMPK/SIRT1的關(guān)系，在本實(shí)驗(yàn)中，成功沉默了巨噬細(xì)胞的AT1R受體后，發(fā)現(xiàn)Ang II的刺激對(duì)AMPK的磷酸化無影響，同時(shí)SIRT1蛋白的表達(dá)量也沒有變化，證明在巨噬細(xì)胞中Ang II是通過AT1 受體對(duì)AMPK/SIRT1通路進(jìn)行調(diào)控的。在動(dòng)脈粥樣硬化模型中，選擇性血管緊張素Ⅱ1型受體阻斷劑氯沙坦可抑制ROS的產(chǎn)生［31］。為了驗(yàn)證巨噬細(xì)胞中AT1受體是否會(huì)影響ROS的合成，本研究在敲除AT1受體的巨噬細(xì)胞中，檢測(cè)ROS的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明沉默AT1 受體后，Ang II無法增加ROS的合成，以及抑制了抗氧化酶SOD的活性。

有文章報(bào)道ROS 可以作用于AMPKα 亞基上對(duì)氧化還原敏感的半胱氨酸殘基（Cys-299/Cys-304）來調(diào)控AMPK的活性［32］，另外使用ROS抑制劑N-乙酰半胱氨酸可以降低SIRT1的磷酸化［33］。為了進(jìn)一步驗(yàn)證巨噬細(xì)胞中ROS跟AMPK/SIRT1的關(guān)系，本研究使用ROS的抑制劑APO后，Ang II的刺激不能減弱AMPK 磷酸化水平，也無法降低SIRT1 的蛋白表達(dá)量，這證明Ang II 通過AT1 受體促進(jìn)ROS 氧化應(yīng)激反應(yīng)來調(diào)控AMPK/SIRT1信號(hào)通路。

圖5 抑制巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)AMPK/SIRT1 的影響Fig.5 Effect of inhibition of oxidative stress response on AMPK/SIRT1 signaling in macrophages.A, B: Western blotting for detecting the expression of p-AMPK (n=3). C, D: Western blotting for the expression of SIRT1(n=3).**P＜0.01;#P＜0.05.

綜上所述，本文確定了Ang II通過AT1受體可以調(diào)控巨噬細(xì)胞中的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而抑制AMPK/SIRT1信號(hào)通路的活化。揭示了AT1受體在Ang II誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要作用。