袁令興 李秀峰 顧傳蘭 盧世軍 婁慶艷 劉源 林繁錄 徐英民

臨沂市中心醫(yī)院泌尿外科276400

0 引 言

腎癌在全球男性中的發(fā)病率位于第6 位，在全球女性中的發(fā)病率居于第8 位[1]，且在我國的發(fā)病率呈現(xiàn)一個逐年遞增的趨勢[2]。腎癌的死亡率位居全球前十位，是一類嚴重的惡性腫瘤疾病[3]。近年來，針對天然藥物中的抗癌活性成分在腫瘤治療中的研究越來越多，很多療效甚佳的天然藥物被發(fā)掘出來。補骨脂素為傳統(tǒng)中藥補骨脂的主要化學成分[4]，對眾多腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，有望成為一種療效顯著的抗癌藥物[5-7]。然而，補骨脂素對腎癌細胞的影響尚不明確。本研究中，利用體外培養(yǎng)的腎癌細胞系HTB-47 和CRL-1932，觀察補骨脂素對腎癌細胞增殖、侵襲能力的影響，探索細胞培養(yǎng)前期的最合適的補骨脂素濃度。此外，分析補骨脂素對細胞增殖抗原（marker of proliferation Ki-67，MKI67）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達的影響，研究其抑制增殖的機制；分析補骨脂素對基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase,MMP2）和MMP9 表達的影響，研究其抑制遷移、侵襲的內在機制。本研究結果可為進一步尋找腎癌新的治療靶點提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

HTB-47 與CRL-1932 腎癌細胞系（美國ATCC 細胞公司），Ki67/MKI67 抗體（ab156872）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）抗體（ab8245）、PCNA 抗體（ab29）、MMP2抗體（ab92536）、MMP9 抗體（ab76003）、β-acting 蛋白（英國Abcam 公司），補骨脂素（西亞化學科技有限公司），RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Hyclone公司）。

CO2恒溫培養(yǎng)箱、Transwell 小室、細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶（美國Thermo Scientific 公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及加藥處理

將5 mg 補骨脂素粉末溶于300 μl 二甲基亞砜中制成儲存液，保存在-80 ℃環(huán)境中。實驗時根據(jù)需要用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋到指定濃度。

HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞系置于含體積分數(shù)為10%胎牛血清和1%青-鏈雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，放入5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長滿培養(yǎng)瓶后，用胰酶消化，然后將細胞離心吹打均勻鋪在6 孔板中。待6 孔板中的細胞密度達50%～70%時，對照組中加入二甲基亞砜，實驗組中加入含補骨脂素為30 μg/ml 的二甲基亞砜溶液。加藥后繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.2 蛋白印跡法（Western blot）檢測蛋白表達

HTB-47 和CRL-1932 細胞加補骨脂素處理24 h后，裂解細胞并萃取總蛋白。在測定蛋白濃度后，計算定量，然后用95 ℃變性處理5 min。進行Western blot 檢測，根據(jù)步驟轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，之后將膜封閉，用1∶1000配 置 好 的MKI67、PCNA、MMP2、MMP9 和GAPDH一抗（1∶1000 稀釋）在4 ℃搖床孵育過夜。次日，二抗室溫孵育1 h），用電化學發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法進行曝光。最后，用Image J 圖像處理軟件進行灰度分析。

1.2.3 劃痕實驗

在鋪滿生長HTB-47 和CRL-1932 細胞的培養(yǎng)板上用10 μL 移液槍的槍頭進行細胞劃線，換新配制的含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在顯微鏡下拍照保存。然后加入補骨脂素，24 h 后，從細胞培養(yǎng)箱取出細胞培養(yǎng)板，換液后再次拍照。利用Image J 圖像處理軟件計算各組細胞的遷移距離，每組至少重復3 次。

1.2.4 細胞侵襲實驗

在加入補骨脂素24 h 后，將實驗組和對照組細胞以每室200 μL 細胞懸液（2×104/室） 接種于Transwell 小室的上室中，下室加入含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基。將Transwell 小室置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后取出。PBS 沖洗2 遍后，用4%多聚甲醛固定25 min，再次清洗后，用質量分數(shù)為0.1%的結晶紫在4 ℃染色30 min，染色結束后清洗晾干。在100 倍顯微鏡視野下，取4～5個視野進行拍照計數(shù)，每組至少重復3 次。

1.2.5 增殖克隆形成實驗

在對照組和實驗組細胞進行胰酶消化并計數(shù)后，以每孔2000 個細胞的密度接種于6 孔板中，然后放于細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)5～7 天后，取出6孔板，用PBS 沖洗2 次，每次3 min。然后，每孔加入1 ml 質量濃度為40 g/L 的多聚甲醛溶液，置于4 ℃固定30 min，再次用PBS 沖洗2 次，用配制好的結晶紫工作液在4 ℃條件下染色30 min。染色結束后，取出6 孔板，再次用PBS 清洗，風干。用Image J 圖像處理軟件統(tǒng)計計數(shù)，每組重復不少于3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad 7.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計量資料以均值±標準差（Mean±SD）表示，兩組間比較采用t 檢驗，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 細胞增殖能力的影響

細胞增殖實驗結果顯示，相對于二甲基亞砜處理的對照組，補骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932細胞的克隆形成能力明顯受到抑制（圖1A）。該結果說明補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 細胞的增殖能力有影響。為了進一步說明補骨脂素的抑制作用，用細胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit 8，CCK8）進行了細胞計數(shù)實驗。結果顯示，相比于對照組，實驗組中HTB-47 和CRL-1932 細胞的增殖明顯受到抑制（圖1B）。上述結果證實補骨脂素對于腎癌細胞的增殖有抑制作用。

圖1 補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞增殖的抑制作用

2.2 Western blot 結果

使用Western blot 法檢測HTB-47 和CRL-1932細胞增殖相關蛋白（MKI67、PCNA）的表達情況。MKI67 是一種核抗原，是細胞增殖的標記物，其指數(shù)高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤、轉移及預后密切相關；PCNA 是增殖細胞核抗原，僅存在于正常增殖細胞和腫瘤細胞中，在細胞增殖的啟動方面起重要作用，是反映細胞增殖狀態(tài)的良好指標。Western blot 結果顯示，相比于對照組，實驗組HTB-47 和CRL-1932 細胞的MKI67 蛋白表達明顯受到抑制（圖2A），PCNA 的蛋白表達也明顯下調（圖2B）。該結果提示，補骨脂素可能是通過降低MKI67 和PCNA的表達從而抑制HTB-47 和CRL-1932 細胞的增殖。

圖2 補骨脂素對腎癌細胞中MKI67 和PCNA 的影響

2.3 補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 細胞侵襲和遷移能力的影響

Transwell 細胞遷移實驗結果顯示，與對照組相比，實驗組，即補骨脂素處理后的HTB-47 和CRL-1932 細胞的侵襲能力明顯受到抑制（圖3A）。說明補骨脂素可明顯抑制HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞的侵襲能力。為了進一步驗證此結論，又進行了劃痕實驗，其結果顯示，實驗組腎癌細胞的遷移距離明顯小于對照組細胞（圖3B）。該結果進一步說明補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 細胞的侵襲、遷移能力有抑制作用。上述結果提示，補骨脂素可能作為腎癌治療的一種潛在有效的治療藥物，有助于提高患者的治愈率和生存率。

圖3 補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞侵襲和遷移的抑制作用

2.4 補骨脂素對腎癌細胞中MMP 蛋白的影響

MMP2 和MMP9 是MMP 基因家族的成員，二者主要功能在于降解細胞外基質蛋白并參與信號轉導，其高水平表達常與腫瘤的侵襲和遷移相關聯(lián)。因此，測定對照組和實驗組腎癌細胞中MMP2 和MMP9 的表達水平，以此分析補骨脂素對腎癌細胞侵襲、遷移能力的影響機制。結果顯示，實驗組，即補骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 細胞中的MMP2和MMP9 蛋白水平明顯低于對照組（圖4）。該結果提示，補骨脂素可能通過下調MMP2 和MMP9 的蛋白表達水平，從而抑制HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞的侵襲、遷移能力。

圖4 補骨脂素對腎癌細胞中MMP2 和MMP9 蛋白表達水平的影響

3 討 論

腎癌高居不下的發(fā)病率和死亡率是其診治過程中的最大難題[8]。近年來，盡管腎癌的治療技術已經得到了顯著的進展，手術切除、新輔助放化療、內分泌治療、免疫治療、靶向治療、中醫(yī)藥治療等多種治療方式的聯(lián)合，使腎癌患者的5年生存率得到了極大提高，預后也明顯得到改善[9-10]。但每年因腎癌死亡的患者數(shù)量仍然很大，改進或創(chuàng)新腎癌的治療方案仍然是急需解決的問題[11]。

補骨脂素是傳統(tǒng)中藥補骨脂種子中的主要有效成分，屬于呋喃豆素類化合物[12]。大量研究結果表明，補骨脂素具有廣泛的藥理作用和生物活性，涉及保護心血管、抗組胺作用、促進粒細胞的生長、抗生育雌激素樣等多方面作用[13-14]。近年來，補骨脂素的抗腫瘤作用得到廣泛研究，其在腫瘤治療中的作用也逐漸被重視。大量學者通過體內外研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂素對多種腫瘤細胞系及實體腫瘤有明顯的抑制作用，包括乳腺癌[5]、白血病、肝癌[6]、肺癌[15]、前列腺癌、黏液表皮樣癌等。然而，補骨脂素在腎癌中的作用效果還尚不明晰，缺少詳細的研究來分析補骨脂素對腎癌細胞的具體影響。本研究旨在初步研究補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞系的影響，并探討其內在影響機制。

本研究結果顯示，補骨脂素處理之后的HTB-47和CRL-1932 腎癌細胞的增殖克隆能力明顯減弱，腎癌細胞的增殖能力被顯著抑制。為了解釋這一抑制現(xiàn)象，檢測了對照組和實驗組腎癌細胞中的重要增殖指標，即MKI67 和PCNA 的蛋白表達量。結果顯示，補骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞中，MKI67 和PCNA 的表達明顯下調。這可能是補骨脂素抑制腎癌細胞增殖的內在機制。此外，Transwell 和劃痕實驗結果顯示，補骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞的侵襲、遷移能力也明顯受到抑制。因此，通過免疫印跡法測定了對照組和實驗組中MMP2 和MMP9 的蛋白表達量，以探究補骨脂素對HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞侵襲、遷移能力的影響機制。結果顯示，補骨脂素處理的HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞中的MMP2 和MMP9 表達量顯著下調。該結果提示，補骨脂素可能是通過介導MMP2 和MMP9 來抑制腎癌細胞的侵襲和遷移。但本研究中僅初步探討了補骨脂素抑制腎癌進展的內在機制，具體的內在作用和詳細機制有待于進一步研究。

4 結 論

傳統(tǒng)中藥成分補骨脂素可顯著抑制HTB-47 和CRL-1932 腎癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，其機制可能涉及下調MKI67、PCNA、MMP2 和MMP9 的蛋白表達。補骨脂素有望作為一個治療腎癌的潛在而有效的藥物。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突