閆偉平,謝法紅,郭瑞杰,聶 帥,郭曉輝

(中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科派駐第一醫(yī)學(xué)中心原門診藥局,北京 100853;*通訊作者,E-mail:31352858@qq.com)

三陰性乳腺癌是一種臨床免疫組織化學(xué)檢查中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和原癌基因Her-2三者均為陰性的乳腺癌,占乳腺癌的15%-20%。且其惡性程度更高,患者預(yù)后更差,有較高的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。目前主要的治療手段為手術(shù)治療、輔助化療和靶向治療等,但仍難以達(dá)到理想效果[1]。紫草素為草本植物紫草的主要有效成分,近年來研究發(fā)現(xiàn)紫草素及其衍生物有抗炎[2]、抗病毒[3]、抗免疫[4]等多種生物功效,它在抗腫瘤方面的研究更為廣泛,紫草素可以通過誘導(dǎo)凋亡、壞死、壞死性凋亡等多種死亡形式來抑制腫瘤細(xì)胞增殖,同時(shí)通過對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控,降低MMP-9蛋白表達(dá)量,進(jìn)而阻斷腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移[5,6]。近年來,紫草素逐漸成為抗乳腺癌藥物研究的熱點(diǎn),研究表明它能夠降低MCF-7細(xì)胞中ER的表達(dá),促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[7]。但目前紫草素在三陰性乳腺癌中的作用尚未被闡明,為其在乳腺癌中的臨床應(yīng)用帶來了一定的局限性。本研究旨在研究紫草素在三陰性乳腺癌細(xì)胞中所發(fā)揮的作用及其可能機(jī)制研究,為三陰性乳腺癌尋找新的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

紫草素購于上海源葉生物科技有限公司;噻唑藍(lán)(5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)、z-VAD-fmk和Necrostatin-1(Nec-1)購自美國Sigma公司;DAPI和Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自凱基生物;兔抗RIP1抗體購自美國Santa公司,Tubulin抗體購自南京巴傲德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)

人三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231購自上海細(xì)胞庫,由本實(shí)驗(yàn)室保存。該細(xì)胞在培養(yǎng)過程中使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司),并在37 ℃且含有5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

當(dāng)細(xì)胞處于生長對(duì)數(shù)期時(shí),將其制成混懸液,以每孔8 000個(gè)細(xì)胞同時(shí)接種于三塊96孔板中,每孔150 μl。培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),待第2天細(xì)胞貼壁正常生長時(shí),分別使用濃度為0,2.5,5,7.5,10,15 μmol/L的紫草素予以相應(yīng)處理,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照孔。在藥物作用24,48,72 h時(shí)每孔分別加入20 μl的MTT,培養(yǎng)2-4 h,取出孔板棄去上清,并加入150 μl的DMSO溶解甲臜結(jié)晶,37 ℃烘箱中繼續(xù)放置10 min待結(jié)晶完全溶解,酶標(biāo)儀在490 nm波長處測(cè)得每孔對(duì)應(yīng)的OD值用于后續(xù)計(jì)算。當(dāng)使用Caspase抑制劑z-VAD-fmk(20 μmol/L)時(shí),設(shè)置分組為對(duì)照組、z-VAD-fmk組、紫草素組、紫草素與z-VAD-fmk聯(lián)用組;壞死性凋亡抑制劑Nec-1(20 μmol/L)與紫草素聯(lián)合作用時(shí),設(shè)置分組為對(duì)照組、Nec-1組、紫草素組、紫草素與Nec-1聯(lián)用組,均提前使用Nec-1或z-VAD-fmk對(duì)孔內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理1 h,吸去上清后重新加入含有抑制劑和紫草素的培養(yǎng)基進(jìn)行處理,48 h后按照上述步驟進(jìn)行檢測(cè)分析OD值。

1.4 DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核變化

選取處于對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞,吹打均勻后計(jì)數(shù)并制成混懸液,以每孔1.5×104細(xì)胞接種于12孔板中,第2天細(xì)胞貼壁后分別使用濃度梯度的紫草素(0,5,10,15 μmol/L)進(jìn)行處理,24 h后棄去上清并使用4%多聚甲醛在4 ℃冰箱中固定20 min,PBS清洗后避光加入DAPI染色試劑,5-10 min后棄去孔內(nèi)液體,PBS清洗3次后通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照,記錄紫草素作用后MDA-MB-231細(xì)胞核的改變。

1.5 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

將MDA-MB-231細(xì)胞按1×105/孔接種于6孔板中,第2天使用紫草素(0,5,10,15 μmol/L)進(jìn)行處理,24 h后收取細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,棄去上清后加入適量預(yù)冷的PBS進(jìn)行清洗3次,離心后棄上清并每樣品中加入500 μl Binding Buffer,10 μl Annexin Ⅴ-FITC試劑輕輕彈勻,4 ℃冰箱中避光反應(yīng)30 min后加入5 μl PI試劑,輕輕混勻后在2 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀上機(jī)操作,保存結(jié)果并加以分析。與抑制劑聯(lián)用時(shí),均先使用抑制劑預(yù)處理1 h后加入抑制劑與紫草素的混合培養(yǎng)基。

1.6 Western blot法檢測(cè)RIP1蛋白的表達(dá)

不同濃度紫草素處理MDA-MB-231細(xì)胞24 h后,使用RIPA裂解液提取獲得細(xì)胞總蛋白,BCA試劑盒分別檢測(cè)蛋白濃度。每孔取20 μg蛋白上樣,進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,牛奶封閉2 h后PBST清洗3次,8 min/次;一抗(RIP1,1 ∶1 000;Tubulin,1 ∶5 000)孵育2-4 h,PBST清洗3次后使用相應(yīng)的二抗孵育1 h,PBST清洗3次,置于ECL發(fā)光液中并輕柔吹打,通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測(cè)目的蛋白表達(dá),Image J軟件進(jìn)行灰度值掃描分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)描述用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間差異分析使用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示,濃度梯度的紫草素(0,2.5,5,7.5,10,15 μmol/L)作用三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞24,48,72 h,細(xì)胞的存活率隨著紫草素給藥濃度的增大和作用時(shí)間的延長而逐漸降低(見圖1)。10 μmol/L濃度時(shí),24,48,72 h時(shí)細(xì)胞存活率分別為(71.95±2.15)%,(58.62±1.12)%和(36.08±0.98)%,故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用10 μmol/L作為紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的作用濃度。

2.2 紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核的影響

將5,10,15 μmol/L紫草素作用于MDA-MB-231

與24 h組相比,*P<0.05,***P<0.001圖1 紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effects of shikonin on the proliferation of MDA-MB-231 cells

細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化見圖2,DAPI染色后細(xì)胞核的變化見圖3。與對(duì)照相比,隨著紫草素濃度的增加,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮;DAPI染色后細(xì)胞核濃縮,且在高濃度紫草素作用時(shí)有核碎裂情況發(fā)生。

紅色箭頭處為細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮圖2 紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)的影響 (×40)Figure 2 Effect of shikonin on MDA-MB-231 cell morphology (×40)

白色箭頭處為DAPI染色后細(xì)胞核濃縮圖3 紫草素作用下MDA-MB-231細(xì)胞DAPI染色結(jié)果 (×40)Figure 3 DAPI staining results of shikonin on MDA-MB-231 cells (×40)

2.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染結(jié)果見圖4。5,10,15 μmol/L紫草素作用MDA-MB-231細(xì)胞24 h后細(xì)胞凋亡率分別是(6.4±1.2)%,(15.6±1.35)%和(29.0±2.11)%。

圖4 不同濃度紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率的影響Figure 4 Apoptosis rate of MDA-MB-231 cells after treated with shikonin

2.4 紫草素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡

分別將凋亡抑制劑z-VAD-fmk和壞死性凋亡抑制劑Nec-1與紫草素聯(lián)用處理細(xì)胞,結(jié)果表明與Nec-1聯(lián)用時(shí),紫草素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的抑制作用明顯被逆轉(zhuǎn),單獨(dú)使用紫草素時(shí)細(xì)胞OD值為0.65±0.02,聯(lián)用時(shí)OD值為0.90±0.04,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而與z-VAD-fmk聯(lián)用時(shí)OD值為0.63±0.05,與單獨(dú)使用紫草素(0.60±0.03)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖5)。Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染得到相類似的結(jié)果,從圖5中能夠看到Nec-1可以顯著逆轉(zhuǎn)紫草素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖5 壞死性凋亡抑制劑Nec-1和凋亡抑制劑z-VAD-fmk對(duì)紫草素誘導(dǎo)的MDA-MB-231細(xì)胞增殖和凋亡的影響Figure 5 Effects of necroptosis inhibitor Nec-1 and apoptosis inhibitor z-VAD-fmk on cell proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells induced by shikonin

2.5 紫草素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞中壞死性凋亡特異性蛋白R(shí)IP1表達(dá)升高

通過Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)紫草素的使用濃度逐漸增高時(shí),壞死性凋亡關(guān)鍵性蛋白R(shí)IP1的表達(dá)量隨之也逐漸升高(見圖6)。同時(shí),當(dāng)紫草素與Nec-1聯(lián)用時(shí),RIP1的表達(dá)量較單獨(dú)使用紫草素時(shí)降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,見圖6);z-VAD-fmk與紫草素聯(lián)用則對(duì)RIP1表達(dá)無影響(見圖6)。

圖6 紫草素和凋亡抑制劑對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中壞死性凋亡相關(guān)蛋白的影響Figure 6 Effects of shikonin and apoptosis inhibitors on necroptosis-related protein in MDA-MB-231 cells

3 討論

三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)作為乳腺癌中最具侵襲性的腫瘤類型,因其激素受體和原癌基因均為陰性而不能有效進(jìn)行內(nèi)分泌治療和抗原癌基因治療,故TNBC的患者預(yù)后差、腫瘤轉(zhuǎn)移率和死亡率均明顯較高[8]。因此尋找對(duì)于TNBC有效的治療手段尤為重要。2018年研究者發(fā)現(xiàn)采用免疫治療聯(lián)合化療的診治策略在TNBC治療中有較好的臨床效果,研究者們?cè)谑褂米仙即己洼飙h(huán)類化療基礎(chǔ)上聯(lián)合PD-L1拮抗劑Durvalumab使得患者緩解率提高10%[9]。PARP抑制劑Olaparib和Talazoparib在TNBC的治療中同樣取得良好效果,使TNBC患者病理完全緩解率約20%[10]。有研究報(bào)道紫草素對(duì)肝癌[11]、白血病[12]、骨肉瘤[13]、結(jié)腸癌[14]、乳腺癌[15,16]等均有抑制作用,因此被認(rèn)為是極具有研究?jī)r(jià)值的天然抗腫瘤化合物。但目前較少有紫草素在TNBC中的相關(guān)報(bào)道。

研究顯示,紫草素通過上調(diào)Bax表達(dá)下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[14];Chen等[15]研究中表明,紫草素通過降低PI3K、Akt的表達(dá)及其磷酸化水平,同時(shí)促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬,抑制細(xì)胞活力,多種途徑共同發(fā)揮抗腫瘤作用;An等[16]研究發(fā)現(xiàn)紫草素上調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達(dá),破壞細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)平衡,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。在急性淋巴性白血病中,紫草素能夠特異性抑制PKM2生物活性,減少糖酵解的代償,致使白血病細(xì)胞能量供應(yīng)不足從而抑制其增殖[12]。Zhang等[17]研究中發(fā)現(xiàn)紫草素可以誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z發(fā)生壞死性凋亡,同時(shí)伴有ROS的激活,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其可以抑制小鼠腫瘤生長。壞死性凋亡(necroptosis)是由受體相互作用蛋白(RIP)介導(dǎo)的,Caspases非依賴性細(xì)胞死亡模式,是近年來死亡形式的熱門研究之一。壞死性凋亡發(fā)生時(shí),RIP1和RIP3兩個(gè)關(guān)鍵性蛋白結(jié)合形成壞死性凋亡復(fù)合體necrosome,RIP3的S227自磷酸化并募集MLKL,導(dǎo)致MLKL的T357/S358磷酸化執(zhí)行壞死性凋亡。該過程可以被小分子物質(zhì)Necrostatin 1(Nec-1)特異性抑制[18,19]。研究報(bào)道壞死性凋亡過程在腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中被明顯抑制,一些新的化合物或天然藥物通過不同機(jī)制途徑誘發(fā)壞死性凋亡,達(dá)到殺傷抑制腫瘤的作用[20]。綠茶提取物茶多酚[21]被發(fā)現(xiàn)可以誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡,紫草素同樣被報(bào)道可以作為壞死性凋亡的誘導(dǎo)劑[17]。以上研究結(jié)果表明,紫草素可以通過多種不同的途徑發(fā)揮抗腫瘤作用,但其在三陰性乳腺癌中的具體作用機(jī)制尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)研究中,我們使用不同濃度的紫草素作用于人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中,發(fā)現(xiàn)隨著作用濃度的增加和作用時(shí)間的延長,MDA-MB-231細(xì)胞的存活率不斷降低,細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核發(fā)生明顯皺縮。為了探究紫草素在MDA-MB-231中誘導(dǎo)的死亡形式,分別使用Caspase凋亡抑制劑z-VAD-fmk和壞死性凋亡抑制劑Nec-1與紫草素聯(lián)用48 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nec-1可以有效逆轉(zhuǎn)紫草素的殺傷作用,而z-VAD-fmk對(duì)于紫草素在MDA-MB-231中的作用幾乎沒有影響,因此猜測(cè)紫草素誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生壞死性凋亡而抑制其增殖。為了進(jìn)一步研究,檢測(cè)了紫草素作用后壞死性凋亡特異性蛋白R(shí)IP1的表達(dá),結(jié)果表明隨著紫草素濃度的增加,RIP1的表達(dá)呈依賴性增加,且Nec-1可以逆轉(zhuǎn)對(duì)RIP1的上調(diào)作用。

綜上所述,紫草素可以抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞的增殖,其作用機(jī)制可能與上調(diào)RIP1的表達(dá)從而誘導(dǎo)壞死性凋亡過程發(fā)生有關(guān),為紫草素用于臨床三陰性乳腺癌的治療提供參考。但本實(shí)驗(yàn)只使用了一種人三陰性乳腺癌細(xì)胞株且未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探究,存在許多不足之處,因此將在接下來的實(shí)驗(yàn)研究中繼續(xù)予以探討。