廣東漢族人群D18S51基因座等位基因分型現(xiàn)象分析

蘭菲菲，陳延冰，丁紅珂，杜 麗，張 彥，尹愛華

廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東廣州 511442

短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)是人類基因組DNA中遺傳學(xué)標(biāo)記之一，在法醫(yī)學(xué)研究中具有重要應(yīng)用價值。在鑒定中會遇到STR基因座的特殊分型現(xiàn)象，例如三帶型等位基因和off-ladder(OL)現(xiàn)象等。三帶型等位基因的發(fā)生機制較為復(fù)雜，發(fā)生率不高，有研究表明中國人群中TPOX等基因座的檢出率在0.01%～0.09%[1]，陳玲等[2]報道中國人群D18S51基因座檢出率為0.013 7%。而OL現(xiàn)象較常見，有報道顯示不同STR基因座均會發(fā)生OL現(xiàn)象[3-4]。正確計算特殊分型基因座的親權(quán)指數(shù)(PI)及計算和(或)命名OL等位基因，對親權(quán)鑒定的結(jié)論和科學(xué)性均有不同程度的影響。本文對發(fā)現(xiàn)的D18S51基因座特殊分型現(xiàn)象進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本中心日常受理檢測的9 419例研究對象，均在本中心進行三聯(lián)體(母親、孩子與被檢父親)或二聯(lián)體(孩子與被檢父親或母親)親子鑒定，研究對象均為廣東地區(qū)漢族人群。本研究經(jīng)本中心倫理委員會審核通過，所有研究對象均已知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA提取 全部血液標(biāo)本采用Chelex-100法提取基因組DNA。血液輕輕混勻后，吸取2 μL全血至1.5 mL的離心管中，加入1 mL滅菌純凈水，劇烈震蕩30 s，室溫放置30 min；13 000 r/min離心3 min，收集沉淀；在沉淀中加200 μL 5%的Chelex-100懸液，用震蕩儀劇烈震蕩，震蕩后瞬時離心，放入恒溫水浴箱中56 ℃孵育30 min；100 ℃煮沸8 min，取出后劇烈震蕩，13 000 r/min離心3 min，吸取上清液保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2多重PCR擴增 取上清液1 μL，采用Powerplex?21擴增體系(購自美國Promega公司)，按照操作說明書進行20個常染色體和1個性染色體STR基因座的多重PCR擴增。

1.2.3STR基因座的等位基因分型 每個標(biāo)本取1 μL PCR擴增產(chǎn)物、9 μL甲酰胺與0.5 μL的Powerplex?21體系內(nèi)標(biāo)充分混合均勻，用3500XL基因分析儀(購自美國AB公司)進行毛細管電泳，標(biāo)記每個STR基因座的擴增片段大小。按照Powerplex?21體系操作說明，利用GeneMapper?ID-X軟件(購自美國AB公司)分析電泳后的數(shù)據(jù)，以Powerplex?21體系的每個STR基因座等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物作為標(biāo)準(zhǔn)，獲取被檢測標(biāo)本的STR基因座的等位基因分型。

1.2.4D18S51基因座特殊分型等位基因的驗證 選取Powerplex?21體系檢測發(fā)現(xiàn)的三帶型等位基因及OL等位基因的家系標(biāo)本，重新提取DNA，采用IdentifilerTM體系(購自美國AB公司)進行驗證。

1.2.5OL等位基因的分型計算 根據(jù)GeneMapper?ID-X軟件中給出的OL等位基因片段大小，結(jié)合基因分型標(biāo)準(zhǔn)物中D18S51基因座等位基因的大小，計算并減掉基因座的漂移率，計算OL等位基因的大小后進行等位基因分型的命名[3]。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 使用GeneMapper?ID-X軟件對等位基因進行計算并命名，計數(shù)資料以例數(shù)和百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1D18S51基因座三帶型等位基因分型結(jié)果 利用Powerplex?21體系進行20個常染色體STR基因座檢測，在9 419例研究對象中發(fā)現(xiàn)1個家系的孩子D18S51基因座存在三帶型等位基因17，23，24(Type1類型)，峰高比例約為3∶2∶1，等位基因17的峰面積約為等位基因23和24之和。該家系標(biāo)本重新提取DNA后經(jīng)過IdentifilerTM體系檢測驗證，確定了該孩子在D18S51基因座發(fā)生三帶型等位基因現(xiàn)象。該三帶型等位基因基因型頻率為0.010 6%(1/9 419)。見圖1。

注：A為父親；B為孩子；C為母親。

2.2D18S51基因座OL等位基因分型結(jié)果 利用Powerplex?21體系在三聯(lián)體親子鑒定的家系中檢測到母親和孩子存在OL等位基因，采用IdentifilerTM體系重復(fù)檢測證實OL等位基因的存在。父親的等位基因分型為17,19；孩子的等位基因分型為19,OL；母親的等位基因分型為16,OL。OL等位基因的基因型頻率為0.021 2%(2/9 419)。見圖2。

注：A為父親；B為孩子；C為母親。

2.3OL等位基因的分型計算 本研究中孩子D18S51基因座的OL等位基因，減掉漂移率(0.04 bp)，OL等位基因(214.79 bp)比Ladder中D18S51基因座的等位基因27(210.66 bp)大4.09 bp，而D18S51基因座為4個核苷酸的重復(fù)，即OL等位基因比Ladder中D18S51基因座的等位基因27大約1個重復(fù)序列(4.09/4=1.023)，因此，孩子的OL等位基因命名為28。母親D18S51基因座的OL等位基因，減掉漂移率(0.05 bp)，OL等位基因(214.81 bp)比Ladder中D18S51基因座的等位基因27(210.66 bp)大4.1 bp，即OL等位基因比Ladder中D18S51基因座的等位基因27大約1個重復(fù)序列(4.1/4=1.025)，因此，母親的OL等位基因命名為28。見圖3。

注：A為孩子；B為母親。

3 討 論

三帶型等位基因和OL等位基因是STR基因座分型中的主要特殊分型[5-6]，在應(yīng)用STR基因座分型技術(shù)進行的臨床檢測和分析(例如親權(quán)鑒定或染色體非整倍體快速診斷)中較為重要。在健康人群中，常染色體的單個STR基因座進行PCR擴增后電泳得到的基因分型是雙等位基因或者單等位基因，圖譜表現(xiàn)為雜合子的2條帶(2個基因峰)，或者純合子的1條帶(1個基因峰)，并且基因分型一般在等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物范圍之內(nèi)。特殊情況下，單個STR基因座分型會出現(xiàn)3條帶(3個基因峰)，即STR基因座的三帶型等位基因。DNA復(fù)制過程中的堿基錯配、滑動或者核心重復(fù)序列的插入或缺失、體細胞突變等均可導(dǎo)致三帶型等位基因的出現(xiàn)[7]。在分析STR基因座的等位基因分型時，采用各STR基因座的等位基因與檢測體系的等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物進行比較，再根據(jù)Ladder的基因分型命名得到STR基因座等位基因的分型，出現(xiàn)在Ladder之外的特殊分型即OL等位基因。由于STR基因座核心重復(fù)序列在不同種族、不同地區(qū)人群和個體間有一定的差異性，實際檢測中會遇到OL等位基因。

本研究通過分析9 419例研究對象20個常染色體STR基因座的等位基因分型，在D18S51基因座發(fā)現(xiàn)了三帶型等位基因分型17,23,24和OL稀有等位基因28，基因型頻率分別為0.010 6%和0.021 2%。其中三帶型等位基因?qū)儆赥ype1類型，3個等位基因峰高度不平衡，比例為3∶2∶1，且等位基因17的峰面積約為等位基因23和24的面積之和。其中，等位基因23和24只相差1個核心序列，可能因為該個體D18S51基因座原來的雜合子其中的1個等位基因發(fā)生了滑動錯配或者體細胞突變，產(chǎn)生了2個等位基因[7-8]。Type1類型三帶型等位基因相對Type2類型較為多見，Type2類型的三帶型等位基因的3條帶峰高度平衡，有研究推測與雜合子基因座發(fā)生了染色體重新排列有關(guān)[8]。OL等位基因根據(jù)其分布可以分為2種情況：一是OL等位基因在該基因座的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物范圍之內(nèi)，位于2個等位基因之間；二是OL等位基因超出該基因座的基因分型標(biāo)準(zhǔn)物范圍[9]。本研究發(fā)現(xiàn)的D18S51基因座OL等位基因28超出了Powerplex?21體系中該基因座Ladder的最大范圍27，是稀有等位基因，發(fā)生頻率較低。因為與基因座的親權(quán)指數(shù)計算相關(guān)，OL等位基因的正確命名較為重要，過濾漂移率之后，經(jīng)過計算，孩子和母親的OL等位基因命名為28，由母親遺傳給孩子。

許澤輝等[10]在中國人群中發(fā)現(xiàn)三聯(lián)體親子鑒定的母親發(fā)生了D18S51基因座三帶型等位基因17,18,19，父親和孩子分型正常。有研究發(fā)現(xiàn)母子單親鑒定中孩子在D18S51基因座檢測出三帶型等位基因15,16,17，母親分型正常[11]。唐劍等[12]發(fā)現(xiàn)D18S51基因座存在的三帶型等位基因14,16,18。除此之外，D18S51基因座的OL等位基因丟失及突變均有報道[13-14]。在檢測中遇到特殊分型現(xiàn)象，首先要用不同檢測試劑盒驗證其發(fā)生的真實性，排除試驗過程中標(biāo)本污染等因素。本研究應(yīng)用Powerplex?21體系和IdentifilerTM體系對發(fā)現(xiàn)的D18S51基因座三帶型及OL等位基因進行驗證，2種檢測試劑盒的分型結(jié)果相同。另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)為基因座親權(quán)指數(shù)的計算及OL等位基因的命名，對于計算及命名的具體方法，目前國內(nèi)尚無國家標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。本研究中孩子D18S51基因座的等位基因23遺傳自母親，推測24可能由等位基因23突變形成。親權(quán)指數(shù)可參考應(yīng)用以下2種計算方式：(1)將等位基因24由23突變而來的因素考慮在內(nèi)，親權(quán)指數(shù)=X/Y=μm/(2p23p24)[1]，μm為母源性突變的平均突變率[15]；(2)將等位基因23和24看作一個整體，根據(jù)雙等位基因的方法計算[16]，親權(quán)指數(shù)=X/Y=1/(2p17)。OL等位基因根據(jù)基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的分型標(biāo)準(zhǔn)和漂移率命名。由于親代和子代中遺傳的稀有等位基因發(fā)生頻率很低，OL基因座的親權(quán)指數(shù)可考慮使用D18S51基因座的最小等位基因頻率計算。

本研究利用Powerplex?21體系檢測分析廣東漢族人群D18S51基因座的特殊分型現(xiàn)象，其中D18S51基因座的三帶型等位基因分型17,23,24在STRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase/)中尚未見收錄，是新發(fā)現(xiàn)的三帶型等位基因。在廣東漢族人群中發(fā)現(xiàn)D18S51基因座的OL等位基因28，數(shù)據(jù)庫中暫無收錄，可作為Powerplex?21體系Ladder等位基因的補充，可提高該檢測體系的檢測效能，本研究探討了親權(quán)指數(shù)的計算及命名，在鑒定實踐中可作為參考。

綜上所述，在鑒定中遇到D18S51等STR基因座的特殊分型現(xiàn)象，可利用含有相同STR位點的不同試劑盒驗證基因座的分型是否正確，排除試驗的非特異性擴增或污染、內(nèi)標(biāo)及Ladder等毛細管電泳的因素。本研究對OL等位基因進行了正確命名，計算了發(fā)生三帶型等位基因或OL基因座的親權(quán)指數(shù)，豐富了STRBase數(shù)據(jù)庫中D18S51基因座的三帶型等位基因分型，補充了廣東漢族人群D18S51基因座OL等位基因分型和頻率數(shù)據(jù)庫。