魏晴，盧虹志，張俊，梁珊珊，3，薛娟*

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)大果木姜子研究中心，貴州貴陽550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)植物多糖研究中心，貴州貴陽550025）

艷山姜為姜科山姜屬植物艷山姜Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith 的干燥成熟果實(shí)，始見于《植物名實(shí)圖考》，廣泛分布在我國西南地區(qū)[1-2]。艷山姜具有溫中燥濕、行氣止痛、截瘧的功效，主治心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥狀，已被收錄于2003 版《貴州省中藥、民族藥標(biāo)準(zhǔn)》[3]。艷山姜用于治療胃潰瘍，在水族的民間應(yīng)用已經(jīng)有數(shù)百年歷史，且效果顯著[3-4]。此外，在貴州，艷山姜莖、葉和果實(shí)也作為一種食品應(yīng)用于日常生活中。因此艷山姜作為“藥食同源”植物的開發(fā)研究具有極大的價(jià)值。

近年來研究主要集中在艷山姜抗心肌缺血、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎、鎮(zhèn)痛和降壓等藥理作用上，而對(duì)艷山姜成分及提取工藝的研究幾乎為空白[5-8]。艷山姜抗氧化活性的研究中，僅對(duì)葉的醇提物成分進(jìn)行了研究，對(duì)其它藥用部位以及成分研究未見報(bào)道[9-10]。因此本文采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化艷山姜多糖的提取工藝，并比較了不同藥用部位多糖的抗氧化活性，填補(bǔ)了艷山姜成分及提取工藝研究的空白，為艷山姜這一特色“藥食同源”植物的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV721 型紫外可見分光光度計(jì)：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；BSA124S 電子分析天平：賽多利斯儀器有限公司；KQ-500DE 超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：MB6951）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：美國Sigma 公司；其它化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 材料

艷山姜：華夏藥業(yè)有限責(zé)任公司，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為姜科山姜屬植物艷山姜Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt et Smith 的干燥成熟根莖。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

將新鮮的艷山姜置于陰涼處晾干，除去雜質(zhì)，用粉碎機(jī)粉碎，過40 目篩，即得艷山姜粉末。

1.3.2 超聲輔助提取的單因素試驗(yàn)

分別稱取艷山姜粉末5 g，按照液料比30∶1（mL/g），超聲功率70 W，考察提取時(shí)間分別為30、35、40、45、50 min 時(shí)對(duì)多糖得率的影響；按照液料比30∶1（mL/g），提取時(shí)間40 min，考察超聲功率分別為50、60、70、80、90 W 時(shí)對(duì)多糖得率的影響；按照超聲功率70 W，提取時(shí)間40 min，考察液料比分別為20∶1、30：1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g）時(shí)對(duì)多糖得率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)3 個(gè)影響因素進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)，以多糖得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究艷山姜多糖的最佳提取工藝條件。利用Design Expert 10.0.7 軟件進(jìn)行分析，建立數(shù)學(xué)回歸模型，以得到最佳的提取工藝，表1 為響應(yīng)面因子水平。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Response surface design test factor level and coding

1.3.4 多糖含量的測定

1.3.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參考文獻(xiàn)[11-12]。得到線性回歸方程為：Y=8.043 1x+0.074 5，R2=0.999 3。

1.3.4.2 樣品多糖得率的測定

超聲輔助提取后將提取液冷卻至25℃，以4 000r/min離心2 次，每次15 min，分離上清液，在上清液中加入無水乙醇（最終乙醇濃度至80%），4 ℃冰箱內(nèi)過夜，以4 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，50 ℃干燥至恒重，即得艷山姜多糖。分別稱取10 mg 艷山姜多糖，加入10 mL 蒸餾水，配制成1 mg/mL 的艷山姜多糖溶液。每份溶液各取0.1 mL，分別加入蒸餾水0.9 mL，將其稀釋100 倍后分別加入1 mL 苯酚搖勻，迅速加入5 mL 濃硫酸搖勻，冷卻至室溫（25 ℃），測定其吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試液中葡萄糖的含量，再按下式計(jì)算樣品中多糖得率：多糖得率/%=C×D/W×10。式中：C 為樣品中葡萄糖濃度，mg/mL；D 為樣品溶液稀釋倍數(shù)；W為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.5 艷山姜多糖抗氧化活性研究

1.3.5.1 樣品的前處理

分別取艷山姜粉末10 g 在提取時(shí)間35 min、超聲功率70 W、液料比40∶1（mL/g）條件下提取多糖，得到母液濃度為25 mg/mL，然后取160 μL 母液置于10 mL容量瓶中，余下部分用蒸餾水補(bǔ)足，得到400 μg/mL 溶液，再將溶液對(duì)半稀釋，分別得到50、100、200、400 μg/mL的各待測樣品溶液。

1.3.5.2 DPPH 自由基清除能力測定

參照文獻(xiàn)的方法[13-14]，分別準(zhǔn)確吸取不同濃度待測樣品2 mL，再吸取2 mL DPPH 標(biāo)準(zhǔn)乙醇溶液加入到10 mL 的試管中搖勻，室溫（25 ℃）下避光靜置30 min后測定其在517 nm 處的吸光值。每個(gè)待測樣品平行測定3 次，取平均值。按照如下公式計(jì)算清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

式中：Ao為2 mL 樣品溶劑與2 mL DPPH 混合反應(yīng)后的吸光值；Ai為2 mL 樣品與2 mLDPPH 混合反應(yīng)后的吸光值；Aj為2 mL 樣品與2 mL 乙醇混合反應(yīng)后的吸光值。

1.3.5.3 超氧陰離子自由基的清除能力測定

參照文獻(xiàn)的方法并進(jìn)行修改[15-16]，在420 nm 處測定吸光值，每隔30 s 測一次，記錄樣品在300 s 內(nèi)的吸光值，最后計(jì)算線性范圍內(nèi)的吸光值每分鐘的增加值。將所得的各個(gè)吸光值帶入如下公式，求出不同濃度樣品對(duì)于超氧陰離子自由基的清除率。

超氧陰離子自由基清除率/%=[（ΔAo-ΔA）/ΔAo]×100

式中：ΔAo為鄰苯三酚在300 s 內(nèi)每分鐘吸光值的增加值；ΔA 為樣品溶液在300 s 內(nèi)每分鐘吸光值的增加值。

1.3.5.4 羥基自由基的清除能力測定

參照張淑杰等的方法[17]，在37 ℃恒溫水浴鍋中溫浴60 min，在536 nm 處測其吸光值，分別記錄吸光值。將所得的各個(gè)吸光值帶入如下公式求出不同濃度樣品對(duì)于羥基自由基的清除率。

羥基自由基清除率/%=[A樣-A損]/[A未-A損]×100

式中：A樣為用不同濃度待測樣品1 mL 代替1 mL雙蒸水測得吸光值；A損為加入1 mL 0.01%的過氧化氫溶液后測定的吸光值；A未為用1 mL 蒸餾水代替1 mL 0.01%過氧化氫測定的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

將測得的數(shù)據(jù)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，運(yùn)用Design-Expert10.0.7 軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

提取時(shí)間對(duì)艷山姜多糖得率的影響見圖1。

圖1 提取時(shí)間對(duì)艷山姜多糖得率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the yield of Alpinia zerumbert polysaccharides

由圖1 可知，提取時(shí)間為30 min ～50 min 時(shí)，艷山姜多糖得率在35 min 達(dá)到最高值5.25%，提取時(shí)間為40 min 時(shí)多糖得率顯著下降，原因可能是隨著提取時(shí)間延長，其它成分也被提取出來，使得多糖含量下降，而40 min 后溶液達(dá)到飽和，無更多成分被提取出來，因此多糖得率無顯著變化。

超聲功率對(duì)艷山姜多糖得率的影響見圖2。

圖2 超聲功率對(duì)艷山姜多糖得率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic power on the yield of Alpinia zerumbet polysaccharides

由圖2 可知，超聲功率為50 W～90 W 時(shí)，艷山姜多糖得率在70 W 達(dá)到最高值4.28%，當(dāng)超聲功率增大到80 W 時(shí)多糖得率顯著下降，可能原因是高強(qiáng)度的超聲波剪切作用使得部分糖鍵斷裂，使得多糖含量下降。

液料比對(duì)艷山姜多糖得率的影響見圖3。

由圖3 可知，液料比為20∶1（mL/g）～60∶1（mL/g）時(shí)，艷山姜多糖得率在40∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最高值4.19%，當(dāng)液料比超過40∶1（mL/g）后多糖得率下降，過高液料比導(dǎo)致多糖得率下降可能是因?yàn)殡S著溶劑量的增大，可溶性物質(zhì)溶出增大，雜質(zhì)含量增高，某些未知成分可能導(dǎo)致部分多糖的分解。

圖3 液料比對(duì)艷山姜多糖得率的影響Fig.3 The effect of liquid-material ratio on the yield of Alpinia zerumbet polysaccharides

2.2 響應(yīng)面方案與試驗(yàn)結(jié)果

利用響應(yīng)面軟件Design Expert 10.0.7 設(shè)計(jì)三因素三水平的試驗(yàn)，設(shè)計(jì)方案見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

對(duì)模型數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到自變量提取時(shí)間（A）、超聲功率（B）、液料比（C）與艷山姜多糖得率（Y）的二次多元回歸方程：Y=5.55+0.16A+0.10B+0.091C-0.18AB-0.23AC-0.012BC-1.77A2-0.62B2-0.95C2。

表3 響應(yīng)面二次模型多糖得率的方差和回歸系數(shù)分析Table 3 Analysis of variance and regression coefficient of polysaccharide yield in response surface quadratic model

由表3 可知，A、AC、A2、B2、C2的P＜0.05，以上因素對(duì)多糖得率的影響顯著；B、C、AB、BC 的P＞0.05，以上因素對(duì)多糖得率的影響不顯著。由F 值可知，3 個(gè)因素對(duì)艷山姜多糖得率的影響程度的大小順序?yàn)椋禾崛r(shí)間＞超聲功率＞液料比。

2.3 響應(yīng)面分析

當(dāng)液料比固定為40∶1（mL/g）時(shí)，超聲功率與提取時(shí)間相互作用見圖4。

圖4 提取時(shí)間和超聲功率對(duì)多糖得率響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface graph of extraction time and ultrasonic power versus polysaccharide yield

由圖4 可知，在超聲功率一定時(shí)，多糖得率隨提取時(shí)間先增大然后降低；在提取時(shí)間一定時(shí)，多糖得率隨超聲功率先增大然后趨于平緩降低，響應(yīng)面坡度較小，提取時(shí)間和超聲功率的交互作用不顯著。

當(dāng)超聲功率固定為70 W 時(shí)，提取時(shí)間和液料比相互作用見圖5。

圖5 提取時(shí)間和液料比對(duì)多糖得率響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graph of extraction time and liquidmaterial ratio versus polysaccharide yield

由圖5 可知，在液料比一定時(shí)，多糖得率隨提取時(shí)間先增大后降低；在提取時(shí)間一定時(shí)，多糖得率隨液料比先增大后降低，響應(yīng)面坡度陡峭，等高線密集，接近橢圓形，說明提取時(shí)間和液料比交互作用顯著。

當(dāng)提取時(shí)間固定為35 min 時(shí)，超聲功率和液料比相互作用見圖6。

由圖6 可知，在超聲功率一定時(shí)，多糖得率隨液料比先增大然后趨于平緩；在液料比一定時(shí)，多糖得率隨超聲功率先增大然后趨于平緩，響應(yīng)面坡度較小，等高線近圓形，說明液料比和超聲功率的交互作用不顯著，以上結(jié)果均這與回歸方程方差分析的結(jié)果相符。

2.4 優(yōu)化與驗(yàn)證試驗(yàn)

軟件處理下最優(yōu)條件為液料比40.12∶1（mL/g）、超聲功率72.86 W、提取時(shí)間35.47 min，此條件預(yù)測艷山姜多糖得率為5.45%。根據(jù)實(shí)際操作條件，將最佳提取工藝修正為：提取時(shí)間35 min、超聲功率為70 W、液料比為40∶1（mL/g），得到實(shí)測多糖得率為5.37%。實(shí)際值與預(yù)測值之間相差小于0.1%，偏差較小，驗(yàn)證了該響應(yīng)面模型的有效性。因此，響應(yīng)面法對(duì)艷山姜多糖最佳優(yōu)化工藝為提取時(shí)間35 min、超聲功率70 W、液料比40∶1（mL/g）。

2.5 艷山姜多糖抗氧化活性結(jié)果

艷山姜多糖抗氧化作用見表4。

表4 艷山姜多糖抗氧化作用Table 4 Antioxidant effect of Alpinia zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith polysaccharide

2.5.1 艷山姜多糖對(duì)DPPH 自由基清除作用

當(dāng)濃度在50 μg/mL ～300 μg/mL 時(shí)，艷山姜多糖各濃度對(duì)DPPH 自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現(xiàn)出明顯的量效依賴線性關(guān)系，當(dāng)濃度大于300 μg/mL時(shí)，艷山姜多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率基本保持不變，當(dāng)濃度為400 μg/mL 時(shí)，艷山姜多糖對(duì)DPPH 自由基的最大清除率為93.17%，因此，艷山姜多糖對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用。

2.5.2 艷山姜多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

當(dāng)濃度在50 μg/mL～400 μg/mL 時(shí)，艷山姜多糖各濃度對(duì)超氧陰離子自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現(xiàn)出明顯的量效依賴線性關(guān)系。當(dāng)濃度為400 μg/mL時(shí)，艷山姜多糖對(duì)超氧陰離子自由基最大清除率為92.07%。因此，艷山姜多糖對(duì)超氧陰離子自由基有一定的清除作用。

2.5.3 艷山姜多糖對(duì)羥基自由基的清除作用

當(dāng)濃度在50 μg/mL～400 μg/mL 時(shí)，艷山姜多糖對(duì)羥基自由基的清除率隨濃度升高而增大，表現(xiàn)出明顯的量效依賴線性關(guān)系。當(dāng)濃度為400 μg/mL 時(shí)，艷山姜多糖對(duì)羥基自由基的最大清除率為90.17%。因此，艷山姜多糖對(duì)羥基自由基有一定的清除作用。

由以上結(jié)果可知，艷山姜多糖有一定的抗氧化活性，在一定范圍內(nèi)具有濃度依賴性。近年研究表明，多糖一方面可直接作用于抗氧化酶，通過提高如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，發(fā)揮抗氧化作用。此外，多糖還能夠與產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）所需的金屬離子絡(luò)合[18]。多糖含有多個(gè)羥基，這些羥基可以與Fe2+和Cu2+等產(chǎn)生自由基所需的金屬離子絡(luò)合，抑制了自由基的產(chǎn)生，影響了脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)的起始，并最終抑制了ROS 的產(chǎn)生[19]。另一方面，多糖可以直接作用于自由基，可以直接捕獲在脂質(zhì)過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中產(chǎn)生的ROS，阻斷或減慢脂質(zhì)過氧化。對(duì)于羥基自由基，多糖鏈上的氫原子可與它們結(jié)合產(chǎn)生水，達(dá)到去除羥基自由基的目的。對(duì)于超氧陰離子自由基，多糖類可以引起氧化反應(yīng)，從而達(dá)到清除的目的[20]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用超聲輔助提取法獲得艷山姜多糖，進(jìn)一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化了多糖的提取工藝。結(jié)果表明，影響艷山姜多糖得率的順序?yàn)椋禾崛r(shí)間（A）＞超聲功率（B）＞液料比（C）。艷山姜多糖最佳超聲輔助提取工藝條件為：提取時(shí)間35 min、超聲功率70 W、液料比40∶1（mL/g），在此工藝條件下，艷山姜多糖得率為5.37%。本研究首次對(duì)艷山姜多糖提取工藝進(jìn)行研究，并優(yōu)化了多糖的提取工藝。此外，艷山姜多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

綜上所述，超聲輔助提取艷山姜多糖的優(yōu)化工藝可行，且艷山姜多糖有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，本研究為艷山姜產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。