滕力慶，周濤，王曉，江維克*

(1. 貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550312；2.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院) 山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

心肌缺血(myocardial ischemia)是指心臟中血液灌注不足導致其供氧減少及心肌能量代謝異常的一種病理狀態(tài)[1]。多種因素可致心肌缺血，其中較常見的發(fā)病原因為冠狀動脈對心肌的供血、供氧不足[2]。由于心肌缺血發(fā)病病因及機制的復雜性，臨床上常采用綜合手段進行治療。中藥具有多成分、多靶點及多通路的協(xié)同調(diào)控作用，在心肌缺血治療中的應用逐漸增多。

太子參為石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，其性甘、微苦，平。歸脾、肺經(jīng)，具有補氣健脾、生津潤肺的功效[3]。2015版《中國藥典》記載太子參具有益氣健脾、生津潤肺的作用[4]。現(xiàn)代藥理研究表明：太子參多糖具有心肌保護作用，能夠促進氧自由基清除，減輕心肌損傷及預防心率失常[5]；太子參皂苷可通過抗氧化應激及抑制細胞凋亡保護心肌細胞，減輕氧化損傷[6]。

中藥網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學理論，從整體調(diào)控角度分析單味中藥或中藥復方藥效作用機制的一種方法[7]?，F(xiàn)有研究對太子參抗心肌缺血的機制僅涉及抗氧化應激、抑制心肌細胞凋亡及促進血管新生[8]層面，因此，其具體作用機制有待深入挖掘。為此，本研究應用網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法探討太子參抗心肌缺血的分子作用機制，并將其關鍵靶點與活性成分進行分子對接驗證，為太子參抗心肌缺血作用機制的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 太子參活性成分的篩選及對應靶點預測

以“太子參”為關鍵詞，通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)獲取太子參的活性化合物基本信息，利用口服生物利用度(oral bioavailablility，OB)≥30%和藥物類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18進行篩選，同時查閱文獻補充未納入的成分。應用TCMSP、Pubmed(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/)及SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測所得活性成分對應的靶蛋白，借助uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將靶點蛋白規(guī)范成相應的基因名。

1.2 心肌缺血相關靶點的檢索及太子參抗心肌缺血關鍵靶點作用網(wǎng)絡構(gòu)建

以“myocardial ischemia”為關鍵詞，通過檢索Pubmed、ctd(http://ctdbase.org/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)及Genecards(https://www.genecards.org/)等數(shù)據(jù)庫篩選心肌缺血作用靶點，將所得靶點去除重復項后獲得心肌缺血相關靶點。

將1.1節(jié)所得太子參活性成分對應靶點與心肌缺血相關靶點借助OmicShare(http://www.omicshare.com/tools/)網(wǎng)站取交集，獲取太子參抗心肌缺血的作用靶點。將交集靶點通過STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(protein-protein interaction，PPI)，設置最小相互作用得分(interaction score >0.7)，獲取太子參抗心肌缺血核心靶點網(wǎng)絡。

1.3 GO功能及Pathway富集分析

將1.2節(jié)所得交集靶點數(shù)據(jù)借助WebGestalt數(shù)據(jù)庫(http://www.webgestalt.org/)進行基因本體( gene ontology，GO)功能富集分析，其中GO功能包括細胞組分(cell component，CC)、生物過程(biological processes，BP)及分子功能(molecular function，MF)。使用Cytoscape軟件中的ClueGo插件對交集靶點進行Pathway富集分析，選取基因數(shù)排名前10的通路，通過OmicShare網(wǎng)站繪制氣泡圖。

1.4 分子對接

采用AutoDock Tools 1.5.6軟件對太子參抗心肌缺血關鍵靶點PPI網(wǎng)絡中度值(degree)前3的靶點蛋白與入血活性成分進行分子對接驗證。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取化合物的三維結(jié)構(gòu)，借助RCSB PDB網(wǎng)站獲取靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)。通過AutoDock Tools對上述蛋白受體和配體進行常規(guī)處理，借助其插件Autogrid獲得對接活性位點，進行分子對接，獲取化合物與靶點蛋白對接結(jié)合能，使用PyMOL 2.4.0軟件將對接結(jié)果進行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 太子參活性成分的篩選及對應靶點預測

共篩選獲得太子參活性成分8個，分別為角鯊烯(Supraene)、刺槐素(Acacetin)、蒙花甙(Linarin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、木犀草素(Luteolin)、蒲公英萜醇(Taraxerol)、仙人掌甾醇(Schottenol)及亞油酸甘油酯(1-Monolinolein)，預測獲得靶點251個，其活性成分的基本信息見表1。

表1 太子參活性成分基本信息

2.2 心肌缺血相關靶點的檢索及太子參抗心肌缺血關鍵靶點作用網(wǎng)絡構(gòu)建

通過檢索Pubmed、CTD、DrugBank及Genecards等數(shù)據(jù)庫獲得心肌缺血相關靶點548個。

通過Venn軟件將太子參活性成分對應靶點與心肌缺血相關靶點取交集，獲取太子參抗心肌缺血的作用靶點(圖1)。將交集靶點通過STRING網(wǎng)站構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(圖2)，靶點與靶點之間的關系達278條，節(jié)點越大表示其在網(wǎng)絡中的作用越大。設置最小相互作用得分，獲得太子參抗心肌缺血核心靶點28個(表2)。將28個核心靶點及與之對應的活性成分信息導入Cytoscape軟件中，選擇工具欄下的“NetworkAnalyzer”進行網(wǎng)絡分析，獲取目標基因的度值。其中目標基因為節(jié)點，一個節(jié)點的度值表示網(wǎng)絡中與該節(jié)點相連的全部路線條數(shù)。

表2 太子參抗心肌缺血核心靶點信息表

圖1 太子參活性成分作用靶點與心肌缺血相關靶點Venn圖Fig.1 Venn diagram of targets of active components of Pseudostellariae Radix and targets related to myocardial ischemia

圖2 太子參抗心肌缺血關鍵靶點PPI網(wǎng)絡Fig.2 PPI network of key targets of Pseudostellariae Radix against myocardial ischemia

2.3 GO功能及Pathway富集分析

將太子參抗心肌缺血關鍵靶點借助WEB-based Gene SeT AnaLysis Toolkit進行GO富集分析(圖3)，表明太子參抗心肌缺血主要參與細胞凋亡、血管新生及炎癥反應等生物學過程，其中BP富集基因數(shù)量較大的有生物調(diào)控、代謝過程、刺激反應及多細胞生物過程；CC富集基因數(shù)量較大的有細胞核、細胞膜、腔上包膜及蛋白質(zhì)復合體；MF富集基因數(shù)量較大的有蛋白質(zhì)結(jié)合、離子結(jié)合、核酸結(jié)合及分子傳遞活性。利用Cytoscape軟件中的ClueGo插件對交集靶點進行Pathway富集分析，基因數(shù)排名前10位的信號通路見圖4。太子參抗心肌缺血的通路主要涉及MyD88-independent TLR4 cascade(非依賴MyD88的TLR4信號傳導通路)、MyD88:Mal cascade initiated on plasma membrane(MyD88：質(zhì)膜上啟動的MAL級聯(lián))、Activated TLR4 signalling(激活的TLR4信號通路)、Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade(Toll樣受體4(TLR4)級聯(lián))及Intrinsic Pathway for Apoptosis(細胞凋亡的內(nèi)在途徑)，相關基因包括JUN、MAPK1、IKBKG、PTPN11及RELA等。Pathway分析會對每個有差異基因存在的pathway返回一個P值，小的P值表示差異基因在該Pathway 中出現(xiàn)了富集(表3)。

表3 太子參抗心肌缺血關鍵靶點Pathway富集分析相關基因

圖3 太子參抗心肌缺血關鍵靶點GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of key targets of Pseudostellariae Radix against myocardial ischemia

圖4 太子參抗心肌缺血關鍵靶點Pathway富集分析Fig.4 Pathway enrichment analysis of key targets of Pseudostellariae Radix against myocardial ischemia

2.4 分子對接

選取太子參抗心肌缺血關鍵靶點PPI網(wǎng)絡中度值排名前3位的靶點(AKT1、IL6、MAPK1、TP53)與太子參活性化合物進行分子對接驗證，結(jié)果見表4。若結(jié)合能小于0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)地結(jié)合，結(jié)合能越小對接越好。其中，蒲公英萜醇(Taraxerol)與靶點AKT1、IL6、MAPK1、TP53的結(jié)合性最好，Taraxerol與靶點AKT1、IL6、MAPK1、TP53的最佳復合結(jié)構(gòu)見圖5。

表4 太子參活性化合物與關鍵靶點的對接結(jié)合能

圖5 Taraxerol與關鍵靶點的分子對接圖Fig.5 Molecular docking diagram of Taraxerol and key targets

3 討論

中醫(yī)學中沒有“心肌缺血”這一病名，根據(jù)病位及胸悶、胸痛的臨床表現(xiàn)將其歸為“胸痹”“心悸”等范疇[9]?！稄埵厢t(yī)通·悸》[10]所謂：“夫氣虛者，由陽氣內(nèi)微，心下空虛，內(nèi)動為悸”。心肌缺血發(fā)生時心臟受損，心陽虛衰致臟腑功能、氣機升降等失調(diào)，導致痰、濕、瘀等病理產(chǎn)物的發(fā)生[11]。因此，心陽虛衰，痰瘀阻絡為心肌缺血發(fā)生的病因病機。近年來，心肌缺血的治療多采用中西醫(yī)結(jié)合的治療方法，中藥在改善心肌缺血患者臨床癥狀中起到一定的作用[12]。太子參為補虛藥的代表藥之一，其益氣生津、強心等功效[13]與心肌缺血的病因病機相符合，使氣充陰旺，血液順暢則無瘀滯之虞[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明[15]，太子參可通過抗氧化應激、抑制心肌細胞凋亡及促進血管新生等途徑干預心肌缺血。本研究應用網(wǎng)絡藥理學和分子對接的方法初步揭示太子參活性化合物抗心肌缺血的生物學過程，預測獲得太子參抗心肌缺血的作用靶點及信號通路。

本研究結(jié)果顯示，太子參的活性成分8個，對應的作用靶點有251個，其中與心肌缺血相同的作用靶點50個。PPI結(jié)果顯示太子參抗心肌缺血的關鍵靶點為TGFB1、AVPR1A、MMP2、HIF1A、HMOX1、AKT1等。這些關鍵靶點參與血管系統(tǒng)重塑、血管生成、組織修復、炎癥反應、免疫反應及細胞凋亡等生物學過程，涉及MyD88-independent TLR4 cascade、MyD88:Mal cascade initiated on plasma membrane、Activated TLR4 signalling、Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade及Intrinsic Pathway for Apoptosis等通路，這些通路中的相關基因包括JUN、MAPK1、IKBKG、PTPN11及RELA等。借助分子對接技術將太子參活性成分與關鍵靶點PPI網(wǎng)絡中度值排名前3位的靶點(AKT1、IL6、MAPK1、TP53)與太子參活性化合物進行分子對接驗證，結(jié)果表明，蒲公英萜醇(Taraxerol)與靶點AKT1、IL6、MAPK1、TP53的結(jié)合性最好。

太子參活性成分中的蒲公英萜醇[16]、木犀草素[17]、β-谷甾醇[18]、刺槐素[19]及蒙花甙[20]均具有保護心肌細胞的作用。其中，蒲公英萜醇通過抑制氧化應激及炎癥反應起到心肌保護的作用[16]；木犀草素通過下調(diào)TLR4(Toll樣受體4)、MyD88(髓樣分化因子88)、NF-κB(核因子-kappa B)的表達，起到減輕炎癥反應及心臟保護的作用[17]；β-谷甾醇通過參與ERK1/2 信號通路，上調(diào)Bcl-2基因的表達，緩解心肌缺血再灌注大鼠的炎癥損傷及抑制其心肌細胞凋亡[18]；刺槐素通過介導MAPK和PI3K/Akt信號通路，激活PI3K下游靶點24,25Akt，促進心肌梗死后血管新生、改善心臟功能及抑制心肌重塑[19]；蒙花甙通過激活Nrf-2起到抗氧化應激的作用，從而保護心肌組織免受局部缺血及其他損傷導致的損害[20]。

在缺血性心臟病中，冠狀動脈再灌注可有效限制心肌梗塞面積，但在這一過程中由于TNF-α(腫瘤壞死因子α)和IL-6(白介素6)被釋放引發(fā)炎癥反應損傷心肌組織，會產(chǎn)生局部缺血再灌注損傷[21]。TLR4與心肌損傷密切相關，在心肌缺血發(fā)生時，激活后的TLR4通過介導MyD88依賴性途徑增強NF-κB的活性，導致IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的表達增加從而加重心肌細胞的損傷，因此，抑制HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB信號通路能夠減輕炎癥反應從而保護心臟組織[22]。關鍵靶點中HIF1A通過調(diào)控缺氧的適應性反應的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子及誘導AREG(雙調(diào)蛋白)的表達，起到心臟保護的作用[23]；MMP2參與血管系統(tǒng)重塑，血管生成及組織修復等過程[24]。

本文通過相關網(wǎng)絡的構(gòu)建，顯示出太子參抗心肌缺血多成分、多靶點、多途徑的特點，符合中醫(yī)理論的治病特點，為太子參的臨床應用提供了理論依據(jù)。目前研究報道太子參中其他成分如太子參多糖通過下調(diào)促凋亡相關蛋白Bax、Caspase-3和上調(diào)抑凋亡相關蛋白Bcl-2的表達來抑制心肌細胞的凋亡[5]；太子參環(huán)肽B通過上調(diào)血管內(nèi)皮細胞中VEGF165的表達，激活MAPK下游的ERK信號傳導通路，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[8]。本文通過預測，發(fā)現(xiàn)蒲公英萜醇與抗心肌缺血的關鍵靶點AKT1、IL6、MAPK1、TP53的結(jié)合性最好，激活MyD88-independent TLR4 cascade、MyD88:Mal cascade initiated on plasma membrane、Activated TLR4 signalling、Toll Like Receptor 4 (TLR4) Cascade及Intrinsic Pathway for Apoptosis等通路抑制心肌細胞凋亡、減輕炎癥反應及促進血管新生，其抗心肌缺血作用值得深入研究。然而網(wǎng)絡藥理學不涉及活性成分之間的協(xié)調(diào)作用及在體內(nèi)的代謝變化過程，因此本研究僅是理論基礎上的預測，后續(xù)還需通過進一步實驗驗證藥物的藥效作用機制。