釉質(zhì)仿生再礦化的研究進(jìn)展與挑戰(zhàn)

張旭

（天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院 · 天津醫(yī)科大學(xué)口腔研究所，天津 300070）

齲病為全球發(fā)病率最高的疾?。?5%，2010年）[1]。因此，早期預(yù)防和治療牙釉質(zhì)齲將節(jié)省大量治療費(fèi)用和醫(yī)療資源，尤其是針對治療不配合的幼兒和殘障人士、行動不便的老年人，甚至也包括較長時間在外執(zhí)行任務(wù)的航天員、軍隊(duì)士兵等特殊人群，或在口腔醫(yī)生職業(yè)暴露風(fēng)險(xiǎn)提高的公共衛(wèi)生事件中，不便開展有創(chuàng)治療時，亟需一種快速高效地恢復(fù)天然/類天然牙釉質(zhì)硬組織的仿生再礦化方法。本文擬從仿生角度淺談釉質(zhì)發(fā)生過程與釉質(zhì)仿生礦化之間的相互關(guān)系，為早期牙釉質(zhì)齲病的預(yù)防和微創(chuàng)治療提供一條新的研究思路。

1 釉質(zhì)生物礦化過程的三個“關(guān)鍵事件”

釉質(zhì)的仿生再礦化旨在體外模擬釉質(zhì)天然發(fā)生過程，通過應(yīng)用相關(guān)蛋白或其類似物，控制無定形礦物質(zhì)前體在脫礦釉質(zhì)表面有序沉積，最終所形成羥基磷灰石晶體結(jié)構(gòu)同天然釉質(zhì)相似，并具備接近的機(jī)械性能，以達(dá)到自下而上修復(fù)脫礦釉質(zhì)的目的。因此，仿生再礦化的研究基礎(chǔ)與釉質(zhì)發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。

成熟的牙釉質(zhì)為高度礦化的無細(xì)胞組織，其受外界或內(nèi)源性因素受損后，除唾液提供的保護(hù)及再礦化潛力外，缺乏有效的生理手段進(jìn)行修復(fù)。牙釉質(zhì)的發(fā)育主要分為三個功能階段：分泌前期、分泌期和成熟期[2]。在早期分泌階段形成的釉質(zhì)礦物主要是無定形磷酸鈣（amorphous calcium phosphate，ACP），在釉質(zhì)基蛋白（enamel matrix protein）的調(diào)控下，最終轉(zhuǎn)化為羥基磷灰石晶體。釉質(zhì)基蛋白是生物礦化的主要執(zhí)行者，主要包括釉原蛋白、非釉原蛋白和釉質(zhì)基蛋白水解酶。其中，釉原蛋白占釉質(zhì)有機(jī)基質(zhì)的90%以上，非釉原蛋白和釉質(zhì)蛋白酶占10%左右。非釉原蛋白則主要包括釉蛋白、成釉蛋白、釉叢蛋白等。

目前已有研究證明，釉原蛋白，釉蛋白及兩者間的相互協(xié)調(diào)作用對于控制釉質(zhì)晶體形成至關(guān)重要[3]。經(jīng)選擇性敲除小鼠的蛋白基因后，可表現(xiàn)為不同程度的釉質(zhì)發(fā)育不全，晶體走向混亂。此外，對于釉質(zhì)蛋白酶缺失的小鼠，其牙釉質(zhì)內(nèi)有機(jī)基質(zhì)將無法降解，致使所生成晶體的結(jié)晶度明顯降低，這亦暗示了有機(jī)礦化模板的降解或是釉質(zhì)晶體成熟的關(guān)鍵步驟[4]。

綜上，牙釉質(zhì)生物礦化似乎主要涉及了三個“關(guān)鍵事件”：（1）釉原蛋白模板和非釉原蛋白穩(wěn)定的無定形磷酸鈣在時間和空間上自組裝，調(diào)控晶體的生長；（2）成熟期有機(jī)基質(zhì)被降解，從細(xì)胞外空間被移除；（3）成熟后期，無定形磷酸鈣向羥基磷灰石晶體轉(zhuǎn)化，完成礦化。若能采用一種更趨近于天然的手段在體外模擬該三個“關(guān)鍵事件”，或可實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)受損區(qū)域快速高效的仿生修復(fù)。

2 釉質(zhì)仿生再礦化

目前牙釉質(zhì)仿生礦化主要圍繞釉原蛋白仿生礦化展開，主要包括如下幾個仿生策略：（1）體外合成全序列釉原蛋白或蛋白片段；（2）根據(jù)釉原蛋白調(diào)控介導(dǎo)礦化的機(jī)制，設(shè)計(jì)仿生多肽；（3）用其他聚合物仿生釉原蛋白調(diào)控礦化的功能。

2.1 釉原蛋白及其序列片段

2.1.1 重組釉原蛋白 釉原蛋白屬于內(nèi)在無序化結(jié)構(gòu)蛋白，可與不同分子相互作用形成不同構(gòu)象。在Ca2+和PO43-的參與下，自組裝為納米球（直徑20～ 30 nm）的釉原蛋白有進(jìn)一步多向延伸為富含淀粉樣結(jié)構(gòu)的鏈狀、網(wǎng)狀納米纖維的趨勢[5]。蛋白質(zhì)淀粉樣結(jié)構(gòu)（amyloid）是蛋白質(zhì)鏈解折疊單體再折疊時形成大量β-sheet 結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生的納米纖維聚集體。在體外單獨(dú)誘導(dǎo)重組全長釉原蛋白（rP172）能夠促進(jìn)細(xì)長棒狀羥基磷灰石的形成，該現(xiàn)象表明釉原蛋白能夠有效抑制晶體無規(guī)則的側(cè)面延伸并促使其以c 軸方向優(yōu)先生長[6]。

將rP172 與殼聚糖相結(jié)合制得水凝膠作用于釉質(zhì)脫礦區(qū)域后，可形成約15 μm 的類釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)，并與牙面緊密貼合[7]。但需要注意的是，該類釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)的形成僅發(fā)生在釉原蛋白自組裝和礦化（礦物離子摻雜）同時發(fā)生的條件下，預(yù)先組裝釉原蛋白則不能達(dá)到該修復(fù)效果。此外，雖然rP172具有一定的釉質(zhì)重建能力，但由于存在免疫原性，合成制備復(fù)雜，成本高等原因而限制了其在臨床的應(yīng)用。

2.1.2 釉原蛋白短片段多肽 鑒于釉原蛋白全長片段合成較為困難且非功能序列具有潛在免疫原性，近年開始采用選擇性剪接釉原蛋白的主要功能段以合成短片段多肽TRAP 或LRAP，后者可替代全長蛋白在釉質(zhì)仿生礦化中發(fā)揮作用，誘導(dǎo)無定形磷酸鈣向有序晶體轉(zhuǎn)化，形成類釉質(zhì)樣結(jié)構(gòu)。

但TRAP 及LRAP 在體外尚不能實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)發(fā)生過程中的自組裝行為，多以納米球或無定形單體形式存在，與體內(nèi)釉質(zhì)有機(jī)基質(zhì)中存在的交叉β-sheet 結(jié)構(gòu)纖維狀蛋白尚存在差距，無法作為有機(jī)模板引導(dǎo)有序晶體的大量形成[8]。

2.2 仿生多肽

仿生多肽旨在蛋白功能序列的基礎(chǔ)上加以人為地設(shè)計(jì)或修飾，形成與原蛋白功能接近的小分子片段。其中，P11-4 被設(shè)計(jì)為具有大量β-sheet結(jié)構(gòu)的功能肽，該多肽能夠在特定因素觸發(fā)下，自發(fā)性組裝為纖維狀三維支架以模擬基質(zhì)內(nèi)釉原蛋白的功能特性，這點(diǎn)對于實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)仿生再礦化具有重要作用[9]。除具備LRAP 的控制晶體取向及延伸功能外，P11-4 能夠通過其表面帶有的負(fù)電荷及磷酸化絲氨酸殘基吸引聚集溶液內(nèi)Ca2+，迅速恢復(fù)礦化所需離子濃度，從而促進(jìn)脫礦釉質(zhì)的修復(fù)。但由P11-4 誘導(dǎo)形成的晶體往往呈扇狀排列，與水平排列的真實(shí)釉柱結(jié)構(gòu)區(qū)別較大[10]。

鑒于釉原蛋白來源類多肽往往缺乏對于釉質(zhì)的精確定位能力，近幾年有研究嘗試通過不同修飾以強(qiáng)化對于釉質(zhì)的原位修復(fù)效果。通過將釉原蛋白C 末端氨基酸短序列經(jīng)連接肽與無機(jī)結(jié)合肽HA6-1 結(jié)合后，可將修復(fù)作用位點(diǎn)有效定位在釉質(zhì)表面，促使羥基磷灰石于脫礦區(qū)域有序沉積[11]。此外，經(jīng)還原劑催化打開二硫鍵的溶菌酶可轉(zhuǎn)變?yōu)楹写罅喀?sheet 結(jié)構(gòu)的淀粉樣蛋白（phasetransitioned lysozyme，PTL），對釉質(zhì)形成有效鋪展粘附[12]。PTL經(jīng)釉原蛋白N端及中心區(qū)序列修飾后，通過模擬體內(nèi)酶切后的釉原蛋白狀態(tài)，可作為成核模板實(shí)現(xiàn)羥基磷灰石的合成，實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)的仿生再礦化修復(fù)。

2.3 聚合物

近年來，已有研究設(shè)計(jì)并研發(fā)了具有蛋白質(zhì)類似功能的聚合物，以實(shí)現(xiàn)早期釉質(zhì)齲的仿生預(yù)防及治療。聚合物可通過模擬體內(nèi)釉原蛋白對于無定形磷酸鈣的穩(wěn)定作用，實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)再礦化。聚（丙烯酸）（PAA）可在低分子量條件下螯合無機(jī)離子，形成穩(wěn)定液相前驅(qū)體，并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移致脫礦區(qū)域，實(shí)現(xiàn)晶體轉(zhuǎn)化。當(dāng)PAA 與作用機(jī)制接近的聚乙烯膦酸（PVPA）或三偏磷酸鈉（STMP）相結(jié)合時，可產(chǎn)生協(xié)同作用進(jìn)一步優(yōu)化原有礦化作用，促使所形成晶體更為均勻且定向有序[13]。此外，與PAA 促礦化機(jī)制相接近的聚合物尚有聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚丙烯胺鹽酸鹽、聚賴氨酸及羧甲基殼聚糖等，均可通過穩(wěn)定ACP 并促使其向晶體轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)的仿生礦化修復(fù)[14]。

而在最新研究中，鑒于聚酰胺胺樹枝狀聚合物（PAMAM）對于晶體的結(jié)合行為與釉原蛋白十分接近，能夠組裝呈類纖維帶狀結(jié)構(gòu)，因此又將PAMAM 稱為“人工蛋白”[15]。加載有羧基官能團(tuán)（-COOH）的PAMAM-COOH 可作為脫礦質(zhì)釉質(zhì)表面的有機(jī)模板，提供成核位點(diǎn)，誘導(dǎo)與天然釉質(zhì)具有相同結(jié)構(gòu)和取向的羥基磷灰石晶體形成[16]。而PAMAM-PO3H2則具有與釉原蛋白相似的直徑和功能，形成與釉質(zhì)表面垂直且定向有序的棒狀晶體，實(shí)現(xiàn)釉質(zhì)原位礦化[17]。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，現(xiàn)有研究基本均是通過釉原蛋白、其衍生物或仿生物直接穩(wěn)定無定形磷酸鈣或與礦物離子相互作用，以獲得類牙釉質(zhì)晶體。但這些手段仍然無法在體外精準(zhǔn)形成釉質(zhì)的釉柱樣結(jié)構(gòu)，并將機(jī)械性能完全恢復(fù)至正常釉質(zhì)水平。目前，釉質(zhì)仿生礦化研究擬關(guān)注以下2 大方面：

3.1 重視釉原蛋白的淀粉樣結(jié)構(gòu)及模板功能

從體內(nèi)釉質(zhì)礦化的實(shí)際角度出發(fā)，只有P11-4低聚物具有淀粉樣蛋白特征（含有β-sheet 結(jié)構(gòu)），因此可在生理?xiàng)l件下于釉質(zhì)齲損表層下自組裝成纖維支架，并依賴對Ca2+離子較高的親和力，促進(jìn)礦物晶體成核啟動礦化。而現(xiàn)有研究主要缺乏對釉原蛋白淀粉樣纖維狀態(tài)的仿生，未能突出釉原蛋白最主要的礦化模板功能。這種蛋白模板功能的缺失，或是目前無法完全重構(gòu)有序排列的釉柱狀結(jié)構(gòu)的潛在原因之一。

3.2 重視非釉原蛋白、蛋白水解酶在釉質(zhì)發(fā)生中的重要作用

對于釉原蛋白的酶解剪切過程僅有少數(shù)研究通過次氯酸鈉或三乙醇進(jìn)行模擬，目前對于仿生牙釉質(zhì)生物礦化中水解蛋白酶作用的闡述仍較為匱乏[18]。而對于非釉原蛋白，例如釉蛋白，雖然對于ACP 的穩(wěn)定及成核均有不容忽視的作用，但對該蛋白的仿生還未引起重視。最近有學(xué)者嘗試?yán)镁厶於彼醽矸律缘鞍?，基于聚合物誘導(dǎo)液相前驅(qū)體機(jī)制去穩(wěn)定ACP，并作用于脫礦的釉原蛋白纖維支架，使其重新礦化。目前大多數(shù)的研究尚集中于利用酸性聚電解質(zhì)以仿生釉原蛋白功能，但其實(shí)后者并不是典型的酸性蛋白。

此外，目前所應(yīng)用的仿生途徑并不能完全模擬釉原蛋白、非釉原蛋白及礦物之間在時間及空間上的同步組裝行為，這或許也是無法在體外完全形成釉質(zhì)釉柱樣結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵難點(diǎn)。

因此，仿生礦化的研究尚需進(jìn)一步關(guān)注釉質(zhì)發(fā)生三個“關(guān)鍵事件”，重視釉原蛋白的礦化模板功能以及非釉原蛋白及水解酶在礦化過程中的作用，從而以最接近天然發(fā)生的形式快速有效地修復(fù)脫礦釉質(zhì)，達(dá)到有效預(yù)防并治療早期釉質(zhì)齲的目的。