汪楓樺 陳潔瓊 孫曉東

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院眼科 上海眼視覺與光醫(yī)學工程技術研究中心 200080

從20世紀90年代早期開始，基因治療開始進入臨床試驗階段。近十年來，新的基因載體、基因編輯技術以及細胞生物學和免疫學研究取得了較大進展，為基因治療的安全性和有效性提供了支撐。2017年，作為全球首個遺傳性視網(wǎng)膜疾病(inherited retinal diseases，IRDs)的基因治療藥物，用于治療先天性黑矇的RPE65基因產(chǎn)品Luxturna獲得美國FDA批準，開創(chuàng)了基因治療的新篇章。目前，基因治療從實驗室走向臨床，掀起了新的醫(yī)學革命，而加深對罕見遺傳性疾病自然病程的認識、保障病毒載體的安全性、臨床級病毒載體的制備及其標準的建立、臨床研究終點觀察指標和倫理監(jiān)管，均是基因療法臨床實踐和療效評價中面臨的關鍵問題和挑戰(zhàn)。因此開展IRDs相關的基因治療臨床試驗須首先充分考慮上述問題，完善診療體系，建立合理可循的制度和規(guī)范化流程。

1 對IRDs臨床特征和自然病程的全面了解是開展基因治療的前提

目前基因療法是改善IRDs患者視功能有效且可行的方法，但基因療法的實施需基于對IRDs發(fā)病機制、自然病程、臨床特征和遺傳規(guī)律的深入認識。2018年，美國FDA《視網(wǎng)膜疾病的人類基因療法指南》中第1條明確指出，深入研究IRDs的臨床特征和自然病程是基因治療藥物研發(fā)的重要前提和基礎。雖然近年來基因測序技術取得了長足進步且檢測成本大幅下降，但IRDs具有高度遺傳異質性和臨床異質性[1]，因此與其他眼科常見病相比，IRDs患病率較低，患者年齡段跨度大，臨床表型差異大，基因突變類型多樣化，綜合的基因診斷和臨床診斷過程復雜且相對不明確。例如，Leber先天性黑矇(Leber congenital amaurosis，LCA)患兒視力常為20/200～光感，甚至無光感，眼底表現(xiàn)可大致正常，也可出現(xiàn)各種異常表現(xiàn)，包括椒鹽樣或錢幣樣色素沉積、黃斑萎縮或缺損、視網(wǎng)膜白色斑點等[2]。隨著年齡的增長和病情變化，LCA患者的視功能和眼底損害逐漸進展，疾病晚期大量視細胞凋亡，若此時選擇基因治療，則由于缺乏功能正常的宿主細胞而表現(xiàn)為治療無效。先天性視網(wǎng)膜劈裂癥通常為中度視力損傷，未累及黃斑區(qū)時可保持較好的中心視力，但多數(shù)患者50～60歲時視力明顯減退，黃斑區(qū)視網(wǎng)膜色素上皮發(fā)生萎縮[3]，基因治療效果也欠佳。因此，只有全面了解IRDs的自然病程規(guī)律和特點，才能確定基因治療中最佳“治療窗”和臨床終點評價指標。

目前，國外已有多個IRDs自然病程的系統(tǒng)性觀察研究[4-5]，我國作為人口大國，人群疾病譜廣，存在民族和地域差異。中國人群中IRDs病變特征與西方人群顯著不同，如西方人群中CEP290c.2991+1655A>G(p.Cys998X)為LCA常見的致病突變位點[6-7]，但該位點在我國LCA患者中極少報道。目前，我國對IRDs的自然病程研究僅限于很少量的橫斷面研究[8-10]。因此，亟需開展基于我國人群遺傳背景的前瞻性自然病程研究，深入、系統(tǒng)地觀察不同基因突變引起的中國人群IRDs的臨床特征和自然病程規(guī)律，為精準基因治療以及臨床適用的治療操作技術和評價技術研究奠定基礎。

2 基因治療載體的安全性是基因治療成功的關鍵

已上市的基因替代療法是通過載體將遺傳物質轉移到患者的細胞中，并表達功能正常的蛋白，以達到治療效果，載體相關的免疫原性及其與宿主基因組整合的風險是基因治療安全性的關注熱點。理想的載體應滿足嚴格規(guī)范的表達、低不良反應、持續(xù)可控的治療效果、靶細胞特異性以及足夠的DNA容量等條件[11]。目前大部分研究是使用腺病毒、腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)和慢病毒等病毒載體遞送系統(tǒng)，各具優(yōu)缺點。AAV具有無致病性、高效長期表達、易于基因操作以及低免疫原性的特點，在基因治療臨床研究中應用較多，例如美國Spark Therapeutics公司開發(fā)的Luxturna即采用2型AAV作為遞送載體，能夠安全、有效地靶向視網(wǎng)膜色素上皮細胞，實現(xiàn)基因增補治療的目標[12]。

由于AAV在人群中存在普遍感染的問題，因此宿主體內針對各種AAV血清型的體液免疫應答是AAV用于基因治療的挑戰(zhàn)。人群中96%的人具有抗AAV中和抗體，其中32%的人能夠完全中和AAV[13]。Boutin等[14]研究發(fā)現(xiàn)，人群中抗AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8和AAV9中和抗體的血清陽性率分別約為67%、72%、40%、46%、30%和47%。目前認為AAV中和抗體的存在是導致早期基因治療臨床試驗失敗的主要因素之一[15]。然而，美國應用基因技術公司研究人員發(fā)現(xiàn)，眼內給予AAV治療后，受試者血清或眼部存在的AAV中和抗體并不會影響基因遞送、表達或眼部炎癥反應，這是由于眼球本身為相對獨立的器官，具有相對免疫豁免特性，同時與其他器官相比，眼球體積較小，對有效治療量的基因治療載體數(shù)量所需較少，治療劑量所產(chǎn)生的抗AAV中和抗體影響較小(https://www.biospace.com)。但是當眼部處于疾病狀態(tài)時，眼球的免疫屏障受到破壞，抗AAV中和抗體相關的風險明顯增大。因此，有研究者推薦進行基于AAV的基因治療時應針對特定AAV的中和抗體進行檢測，并確定最佳給藥途徑[16]。

盡管大量臨床研究在一定程度上顯示了AAV載體的安全性，但其在基因治療中的安全性問題仍受到高度關注。已有研究認為基因治療過程中靜脈注射高劑量AAV會產(chǎn)生毒性反應，引起肝功能嚴重損害[17]。近期美國Audentes Therapeutics公司提供的AT132基因療法的臨床試驗先后出現(xiàn)3例死亡事件，再次引起研究者對AAV載體安全性的關注。該基因療法采用的是8型AAV載體，受試者在接受高劑量病毒載體注射后因出現(xiàn)敗血癥或胃腸道出血癥狀而導致死亡(https://www.audentestx.com)。因此，基因治療中高劑量AAV注射引起嚴重并發(fā)癥的機制及相應的解決方案值得深入探索。

同時在臨床及臨床前研究中依然發(fā)現(xiàn)AAV攜帶的治療基因整合進入宿主基因組的現(xiàn)象。Inagaki等[18]研究發(fā)現(xiàn)，新生小鼠體內注入AAV后其攜帶的遺傳物質整合入宿主基因組中并發(fā)生了肝癌；近期Kaiser[19]對犬進行AAV基因治療后在犬的染色體上檢測到AAV攜帶的治療性基因片段，有些甚至位于與生長相關的基因附近，推測存在誘發(fā)癌癥的可能性。由此提示我們，AAV病毒載體在基因治療中依然存在潛在的成瘤風險。在未來的基因治療研究中，如何精準地導入目的基因并維持長期、有效、安全的表達仍是基因治療的一個挑戰(zhàn)。

3 GMP級規(guī)?；《据d體生產(chǎn)是目前基因治療產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸

病毒載體比傳統(tǒng)生物制劑的制作生產(chǎn)過程復雜得多，開發(fā)并定制病毒的周期長，同時研發(fā)費用高昂，因此大規(guī)模生產(chǎn)和制備合格的GMP級病毒載體是目前基因治療產(chǎn)業(yè)化的瓶頸問題。成熟的AAV生產(chǎn)工藝必須能夠提供高度一致、高純度和高滴度的病毒產(chǎn)品，同時滿足監(jiān)管中的安全性和有效性要求并能夠降低成本。

病毒的生產(chǎn)流程可分為上游的擴增病毒和下游的純化病毒，目前業(yè)界仍然缺少AAV病毒生產(chǎn)的規(guī)?；?、工業(yè)化平臺。在目前的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，通過改進轉染技術和細胞培養(yǎng)方法可以達到大規(guī)模病毒擴增的目的，如何高效、穩(wěn)定地從大量細胞裂解物中純化AAV是目前面臨的主要挑戰(zhàn)。病毒顆粒的下游純化主要是去除工藝和產(chǎn)品的相關雜質，包括宿主細胞DNA和蛋白質、質粒DNA和病毒空殼，這些步驟的處理在生產(chǎn)總成本中占據(jù)很大比重，而其中的主要雜質，如宿主細胞DNA和蛋白質，由于受到宿主細胞DNA組蛋白的保護，且市售核酸酶很難分解染色質，同時該過程涉及多個步驟，顯著降低回收率，因此實驗室的成功純化工藝難以擴展至大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中。

4 基因治療產(chǎn)品管理規(guī)范的建立是基因治療的“門檻”

大規(guī)模開展基因治療的臨床研究應有完善的基因治療產(chǎn)品管理和評價規(guī)范作為保障。目前全球都是將基因治療產(chǎn)品作為藥品來申報和監(jiān)管，對于全球監(jiān)管機構來說，這是一個全新的產(chǎn)業(yè)，僅有數(shù)款產(chǎn)品作為孤兒藥獲批上市，監(jiān)管依然面臨挑戰(zhàn)。中國面臨的更大挑戰(zhàn)是基因治療相關的產(chǎn)業(yè)在國內剛剛興起，目前國內整套質量監(jiān)控法規(guī)管理體系尚未健全。2020年9月，中國國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心頒布了《基因治療產(chǎn)品藥學研究與評價技術指導原則(征求意見稿)》，基于當前的技術發(fā)展和科學認知，針對基因治療藥學研究的特殊性提出要求，以確保研究和治療用藥品的質量、安全性和有效性，目的是規(guī)范和指導基因治療產(chǎn)品按照藥品管理規(guī)范進行研究、開發(fā)和評價。病毒載體作為基因治療的臨床治療劑，首先應符合中國國家藥典委員會2019年公示的《人用基因治療制品總論》的要求，同時應滿足《藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范》的基本原則和相關要求，重點關注生產(chǎn)過程中外源因子的污染和交叉污染、生產(chǎn)人員的健康和安全防護、生產(chǎn)環(huán)境的生物等級和安全隔離，以及生產(chǎn)產(chǎn)物或廢棄物對環(huán)境的生物安全性影響。

在病毒載體進行大規(guī)模生產(chǎn)制備的生產(chǎn)工藝中，首先需要建立符合要求的載體車間，對儀器設備、人員構成、選址、生物安全防護、能耗和環(huán)境評價等方面進行周密設計，以建立起一個合格的GMP級工廠[20]。病毒載體的結構復雜性使得質量控制測試更為復雜，同時由于基因治療產(chǎn)品儲存對時效性要求較高，在質量控制檢測中需要更高要求的快速檢測方法和準確性，因此建立企業(yè)質量控制和放行測試是確保產(chǎn)品安全性、純度和效力的重要環(huán)節(jié)。

基因治療產(chǎn)品涉及體內生物學過程，雖然企業(yè)均有放行標準，但是否足以保證產(chǎn)品的質量依然是難以確保的問題。基因治療產(chǎn)品的溫度敏感特性對冷鏈運輸也提出了挑戰(zhàn)，例如Luxturna必須在-65 ℃條件下進行運輸和保存。同時國內已有多家醫(yī)院開展了關于IRDs基因治療研究者發(fā)起的臨床試驗，是否需要建立院前放行標準，以及建立怎樣的快速檢測指標來確保受試者的安全是值得進一步探討的重要問題。

5 確定有效可行的臨床研究方案和合理的倫理監(jiān)管是基因治療的保障

截至2020年9月，全球已開展44項IRDs相關的基因治療臨床試驗研究(https://clinicaltrials.gov)，雖然第1例LCARPE65基因治療藥物Luxturna的研發(fā)成功為眼科基因治療提供了典范，但IRDs是一系列罕見、視網(wǎng)膜進行性退化的基因缺陷相關疾病，包括視網(wǎng)膜色素變性、無脈絡膜癥、Leber遺傳性視神經(jīng)病變、LCA、Stargardt病和X連鎖視網(wǎng)膜劈裂等。由于這些疾病之間有著不同的致病基因和發(fā)病機制以及其臨床特征多樣化和病程不等的特點，難以設定統(tǒng)一的臨床觀察指標，給臨床研究具體方案的設計和實施提出了挑戰(zhàn)。因此，針對特定基因導致的特定疾病，個性化選擇主要和次要研究終點、制定詳細的患者納入和排除標準在基因治療臨床試驗中至關重要。

基因治療仍處于治療疾病的早期階段，所預期的獲益或風險存在很大的不確定性，如何規(guī)范有效地保護患者的利益是基因治療倫理監(jiān)管的重要關注點。1999年，基因治療領域的先鋒James Wilson教授對1例鳥氨酸轉氨甲酰酶缺陷癥患者進行基因治療，患者全身發(fā)生免疫系統(tǒng)反應引起器官衰竭而死亡。由于在這項研究中研究者的臨床前數(shù)據(jù)不透明、受試者風險告知不充分所引起的后果引發(fā)了基因治療的倫理爭論，因此之后的基因治療倫理審查中強調，參與基因治療研究者在設計基因治療方案時應以全人類的利益為出發(fā)點，尊重人類自身而開展基因治療研究，也應盡可能全面地獲得對這一新技術進行評價和控制的能力，即“舉證責任”，應明確無誤地告知受試者和研究者在基因治療的探索中做了什么、為何而做以及可能產(chǎn)生怎樣的后果，讓公眾在完全知曉的前提下自愿選擇。

6 嚴格遵守《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》是開展基因治療的必要前提

根據(jù)國務院在2019年7月頒布的《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》，在合理開展基因治療研究的過程中，研究者所涉及人體遺傳樣本的收集、調查和分析均屬于我國人類遺傳資源[21]。當研究對象為重要的遺傳家系和特定地區(qū)的人類遺傳資源時應當實行申報登記制度，保護和合理利用我國人類遺傳資源，維護公眾健康、國家安全和社會公共利益。

該條例表明，國家支持研究者合理利用人類遺傳資源開展科學研究、發(fā)展生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、提高診療技術，以提高我國生物安全的保障能力，提升人民健康保障水平，對利用人類遺傳資源開展研究開發(fā)活動以及成果的產(chǎn)業(yè)化依照法律、行政法規(guī)和國家有關規(guī)定予以支持。但研究的同時不得超越5條“紅線”：(1)采集、保藏、利用、對外提供我國人類遺傳資源不得危害我國公眾健康、國家安全和社會公共利益；(2)應符合倫理原則，并按照國家有關規(guī)定進行倫理審查；(3)應尊重人類遺傳資源提供者的隱私，取得其事先知情同意，并保護其合法權益；(4)禁止買賣人類遺傳資源；(5)外國組織、個人及其設立或者實際控制的機構不得在我國境內采集、保藏我國人類遺傳資源，不得向境外提供我國人類遺傳資源。

7 關注IRDs基因療法的研究方向以合理開展相關研究

盡管基因治療還存在許多關鍵性技術問題以及臨床研究和治療應用的監(jiān)管和法規(guī)有待進一步完善，但對于很多目前無法治療的疾病，基因治療是值得期待的治療方式。目前，基因治療研究主要聚焦于罕見的單基因遺傳病和腫瘤領域。在眼科的新生血管性年齡相關性黃斑變性中，針對關鍵致病因子血管內皮生長因子開展了多個基因治療臨床試驗，取得了鼓舞人心的效果，在一項Ⅱa期的臨床試驗中，新生血管性年齡相關性黃斑變性患者在進行視網(wǎng)膜下腔注射rAAV.sFlt-1后視力獲得顯著提高[22]。更值得期待的是，基因治療并非僅用于罕見病的治療，隨著新技術、新理論的出現(xiàn)和改進，未來有望將基因治療擴展應用到更為常見的遺傳風險因子和營養(yǎng)因子相關疾病，如心血管病、糖尿病、阿爾茨海默癥、帕金森癥、精神分裂癥等，基因治療作為一種全新的給藥治療方式，為需要持續(xù)給藥的疾病提供全新的治療手段。目前基因治療主要采用基因增補技術，隨著新的基因編輯技術以及細胞生物學的發(fā)展，未來也將開展更多類型的基因治療方式。隨著對基因治療載體功能和安全性的不斷改進，未來將進一步克服病毒載體的免疫原性，更加精準地表達并增加病毒裝載容量，優(yōu)化治療過程，在基因治療制劑的工藝制備中，優(yōu)化各個環(huán)節(jié)并降低生產(chǎn)成本，獲得高效、穩(wěn)定的基因治療制劑。目前，基因治療猶如十年前的生物抗體藥物應用初期一樣，仍處于起步階段，隨著相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和研究工作的日臻成熟，生產(chǎn)出患者可耐受的高質量、安全的基因治療產(chǎn)品是未來的方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突