溫梓辰，張萬祥，吳 倩，楊玉佩，謝 謙，鐘 輝，盛文兵，彭彩云

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥民族醫(yī)藥物創(chuàng)新發(fā)展國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/創(chuàng)新藥物研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

在如今新藥研發(fā)的熱潮中，中醫(yī)藥已逐漸成為研究關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特征，導(dǎo)致中藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制無法明確，從而阻礙了中醫(yī)藥的發(fā)展。目前，研究中藥材活性成分及其作用機(jī)制的主要方法有血清藥物化學(xué)方法、“譜-效”關(guān)系分析方法、藥效差示血清色譜法、分子生物色譜法等，但都無法清晰解釋中藥活性與療效的內(nèi)涵。小分子活性化合物與靶點(diǎn)的相互作用并不一一對(duì)應(yīng)，而且通過實(shí)驗(yàn)方法預(yù)測(cè)單個(gè)化合物的靶標(biāo)蛋白是一個(gè)耗時(shí)且昂貴的過程[1]，因此使用計(jì)算技術(shù)進(jìn)行虛擬篩選成為前期實(shí)驗(yàn)的有力工具[2]。反向?qū)蛹夹g(shù)是以小分子化合物為探針，通過空間和能量匹配在靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫中相互識(shí)別，按照匹配程度由高到低進(jìn)行打分和排序，通過排序結(jié)果，在數(shù)據(jù)庫中篩選活性化合物潛在的蛋白靶點(diǎn)，以探索其作用機(jī)制和副作用等[3-4]。筆者從反向分子對(duì)接技術(shù)在蛋白靶點(diǎn)預(yù)測(cè)、作用機(jī)制闡明、中藥質(zhì)量標(biāo)志物篩選及反向篩選技術(shù)的組合應(yīng)用等方面綜述其研究進(jìn)展，以期為中藥復(fù)雜成分的現(xiàn)代化研究提供理論依據(jù)，并討論其優(yōu)點(diǎn)和局限性。

1 反向?qū)釉诘鞍装悬c(diǎn)預(yù)測(cè)中的應(yīng)用

中藥具有化學(xué)成分多樣性和活性多樣性的特性，復(fù)雜的化學(xué)成分的協(xié)同作用使其作用靶點(diǎn)同樣具有復(fù)雜性和多樣性。因此，中藥預(yù)防和治療疾病的機(jī)制十分復(fù)雜，活性成分靶點(diǎn)的確認(rèn)和表征具有重要意義[5]。對(duì)于植物治療學(xué)來說，尋找生物活性成分的分子靶點(diǎn)非常困難，而利用傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析和藥代動(dòng)力學(xué)方法進(jìn)行搜索又耗時(shí)費(fèi)力[6-8]。采用虛擬篩選和其他計(jì)算方法預(yù)測(cè)分子靶點(diǎn)近年來成為熱點(diǎn)，在中藥的復(fù)雜活性成分研究上發(fā)揮了較好的作用。

單味中藥活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的主要流程為：先確定活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，隨后通過各大靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反向篩選，最后對(duì)得分較高的結(jié)果進(jìn)行分析。吳曉敏等[9]將龍須藤的兩種多甲氧基黃酮TMFA和PMFA作為研究對(duì)象，使用Pharm Mapper Server藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反向?qū)雍Y選，根據(jù)匹配結(jié)果進(jìn)行打分，并按分?jǐn)?shù)由高到低排序，然后選取有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的潛在靶點(diǎn)進(jìn)一步分析，根據(jù)龍須藤的主要功效對(duì)其蛋白靶點(diǎn)涉及的疾病進(jìn)行分類，發(fā)現(xiàn)DHODH和CTSK兩個(gè)靶蛋白是其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)靶點(diǎn)；同時(shí)篩選出了一些與心血管疾病和癌癥相關(guān)的蛋白靶點(diǎn)。而國(guó)內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于這兩種成分對(duì)于心血管疾病及癌癥方面治療研究報(bào)道，這為龍須藤治療心血管疾病和癌癥的相關(guān)藥理研究提供了啟示。最后，結(jié)合其他生物信息學(xué)手段進(jìn)行分析，初步預(yù)測(cè)了這兩種成分抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用通路，為龍須藤治療該疾病的分子機(jī)制提供了理論依據(jù)。人參屬藥材主要成分是人參皂苷（三萜皂苷），具有多種活性，但不同的人參皂苷的靶點(diǎn)亟待明確。PARK K等[10]以潛在藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（PDTD）為基礎(chǔ)，選取其中的治療性條目、添加激酶靶點(diǎn)和73個(gè)涉及20種與毒副作用相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)建靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫，結(jié)合Glide反向?qū)榆浖?duì)26種人參皂苷進(jìn)行反向篩選，然后對(duì)篩選出的靶蛋白與人參皂苷進(jìn)行相互作用分析。通過對(duì)人參皂苷與天然配體結(jié)合能的比較和對(duì)接結(jié)果進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)了4種潛在的人參皂苷靶蛋白[按其相互作用強(qiáng)弱排列分別為絲裂原活化蛋白激酶1（MEK1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、絲氨酸蛋白酶凝血酶和絲氨酸蛋白酶α凝血酶]和4個(gè)可能的副作用和毒性相關(guān)的靶點(diǎn)：乙酰膽堿酯酶，腸脂肪酸結(jié)合蛋白，Ⅱ和Ⅳ型碳酸酐酶，谷氨酸脫氫酶。BYLER K G等[11]以sc-PDB數(shù)據(jù)庫中的16 034個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)為潛在的藥物靶蛋白庫，編寫了一個(gè)python腳本對(duì)乳香二萜和三萜使用Molegro Virtual Docker分子對(duì)接軟件進(jìn)行批量反向?qū)友芯?。結(jié)果顯示乳香二萜類化合物與乙酰膽堿酯酶、幾種細(xì)菌靶蛋白和HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶呈選擇性對(duì)接。通過對(duì)靶蛋白及其相互作用進(jìn)行分析可知：乳香萜類化合物的優(yōu)先對(duì)接符合乳香的傳統(tǒng)用途和已有的生物活性。丹參具有活血化瘀的功效，活性成分多種多樣，其中丹參醇A研究較少。陳少軍等[12]使用PharmMapper Server數(shù)據(jù)庫對(duì)丹參的活性化學(xué)成分丹參醇A進(jìn)行反向篩選，預(yù)測(cè)其潛在作用靶點(diǎn)，根據(jù)Fit score由高到低的順序篩選出與疾病相關(guān)的前10個(gè)靶蛋白，對(duì)排名前3的靶蛋白即視黃醇結(jié)合蛋白4、醛糖還原酶和轉(zhuǎn)甲狀腺素運(yùn)載蛋白進(jìn)行了丹參醇A與靶蛋白藥效團(tuán)匹配特征分析，并對(duì)丹參與這些靶蛋白的相互作用進(jìn)行文獻(xiàn)研究，將可能性極大的靶點(diǎn)進(jìn)行反向分子對(duì)接方法學(xué)驗(yàn)證和正向分子對(duì)接驗(yàn)證，驗(yàn)證了方法的可行性和結(jié)果的可靠性，最后預(yù)測(cè)醛糖還原酶可能是丹參醇A的潛在靶蛋白之一。銀杏酸（GAs）為銀杏果實(shí)“白果”中的有毒成分。YU P等[13]以sc-PDB數(shù)據(jù)庫（version2013）中的9 283個(gè)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)為潛在的藥物靶蛋白庫，將5種GAs與其進(jìn)行反向?qū)?，結(jié)合The Database for Annotation Visualization and Integrated Discovery（DAVID）數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路”篩選得到4個(gè)有效的靶蛋白[過氧化物酶體增殖物活化受體（PPARA、PPARD和PPARG）和二氫乳清酸脫氫酶（DHODH）]，并通過分子動(dòng)力學(xué)（MD）模擬和MM/GBSA計(jì)算，證實(shí)了以上5種GAs都可以與DHODH在熱力學(xué)上緊密結(jié)合，可作為對(duì)抗白血?。ˋML）的治療劑或開發(fā)天然DHODH抑制劑的先導(dǎo)化合物。

反向?qū)蛹夹g(shù)不僅可以應(yīng)用于單味中藥活性成分的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，還可以對(duì)中藥復(fù)方的活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，從而為闡明中藥復(fù)方防治疾病的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。如QIANG W J等[14]利用數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)資料，建立了遠(yuǎn)志散化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，通過反向分子對(duì)接預(yù)測(cè)潛在的靶點(diǎn)，構(gòu)建了組分靶網(wǎng)絡(luò)，對(duì)阿爾茨海默病（AD）的靶網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行映射和分析，得到“活性成分AD靶”網(wǎng)絡(luò)。通過網(wǎng)絡(luò)分析篩選出關(guān)鍵目標(biāo)，確定了3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（COX-2、M-AChRM1和M-AChRM2）和1個(gè)重要靶點(diǎn)[乙酰膽堿酯酶（AchE）]。施學(xué)麗等[15]基于經(jīng)方的“方證相應(yīng)”理論，采用PharmMapper Server數(shù)據(jù)庫對(duì)桂枝湯相關(guān)活性化學(xué)成分進(jìn)行反向篩選，根據(jù)匹配結(jié)果進(jìn)行評(píng)分和排序，篩選出與桂枝湯調(diào)和營(yíng)衛(wèi)作用相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)，然后利用AutoDock Vina軟件進(jìn)行正向分子對(duì)接模擬試驗(yàn)，驗(yàn)證匹配結(jié)果的可靠性，最后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示桂枝湯調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的作用機(jī)制與11β-HSD1有一定的相關(guān)性。這種以“方”的藥物活性成分為研究的出發(fā)點(diǎn)，使用反向分子對(duì)接技術(shù)尋找“方”所含活性化學(xué)成分的蛋白靶點(diǎn)，然后以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究這些蛋白靶點(diǎn)與“證”的相關(guān)性，通過分析靶點(diǎn)蛋白在生物體內(nèi)的活性作用來反推“證”的內(nèi)在發(fā)生機(jī)制的研究方法也是一條較好的中藥復(fù)方研究途徑。

2 反向?qū)釉陉U明作用機(jī)制中的應(yīng)用

對(duì)于中藥作用機(jī)制的闡明，反向?qū)蛹夹g(shù)發(fā)揮了不可忽視的作用。目前，反向?qū)蛹夹g(shù)對(duì)中藥活性成分作用機(jī)制的研究主要集中于抗炎作用機(jī)制、抗腫瘤作用機(jī)制等方面。有兩種主要的研究方法，一種是對(duì)炎癥通路上的蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行反向分子對(duì)接模擬或運(yùn)用藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反向分子對(duì)接篩選，根據(jù)對(duì)接的小分子化合物與生物大分子結(jié)合的自由能由低到高進(jìn)行排序。而活性化合物與靶蛋白的親和力高低是由自由能的量值所評(píng)價(jià)的，對(duì)接自由能越高，其親和力就越低，以此篩選出親和力較高的靶蛋白，并對(duì)其配體-蛋白分子復(fù)合物進(jìn)行作用力分析。如徐佑?xùn)|等[16]將大黃酸作為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象，選取TLR4/NF-κB、P38、JAK2/STAT3 3條炎癥通路上的30個(gè)蛋白為靶標(biāo)庫，運(yùn)用AutoDock對(duì)大黃酸進(jìn)行反向分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，依據(jù)對(duì)接自由能由低到高進(jìn)行排序，然后對(duì)分子復(fù)合物中親和力較高的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行篩選，獲得3個(gè)具有高親和性的靶蛋白（P38、P13Kγ和JAK2），通過分析這3個(gè)靶蛋白在炎癥通路上的作用，認(rèn)為大黃酸發(fā)揮抗炎作用是通過抑制炎癥通路上的靶蛋白，進(jìn)而影響炎癥信號(hào)傳遞。獨(dú)腳金內(nèi)酯近年被證明為一種植物中普遍存在的新型植物激素，具有多種生物活性。陳奕銳等[17]根據(jù)靶點(diǎn)蛋白數(shù)據(jù)庫構(gòu)建原則，從NF-κB炎癥通路中選取了信號(hào)通路上的62個(gè)蛋白，使用PDB數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)的PDB格式，構(gòu)建靶標(biāo)蛋白數(shù)據(jù)庫，通過AutoDock Vina分子對(duì)接軟件，運(yùn)用MS-DOS批處理腳本，將獨(dú)腳金內(nèi)酯類似物GR24和靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫中的靶標(biāo)蛋白進(jìn)行反向分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，最后以對(duì)接評(píng)分和對(duì)接構(gòu)象的相互作用力分析為依據(jù)，反向篩選出3個(gè)親和力較高的靶標(biāo)蛋白（PARP1、CK2和AKT）。結(jié)果表明GR24對(duì)這些靶蛋白具有競(jìng)爭(zhēng)抑制的活性，這也為其抗炎作用機(jī)制的研究提供了指引。雖然對(duì)于這些藥物的研究出發(fā)點(diǎn)都是以其抗炎活性為基礎(chǔ)，但是最終結(jié)果卻都顯示了其抗腫瘤活性，因此也為其抗腫瘤活性的后續(xù)研究提供了參考。槲皮素廣泛存在于各種植物中，是天然的黃酮類化合物。張明波等[18]利用AutoDock Vina軟件將槲皮素與已知結(jié)構(gòu)的抗腫瘤藥物的靶蛋白進(jìn)行半柔性對(duì)接，并對(duì)槲皮素與靶蛋白分子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)氫鍵相互作用進(jìn)行作用模式分析，按照其自由能由低到高選取-9.0 kcal/mol以下的靶蛋白，通過計(jì)算得到槲皮素對(duì)這些靶蛋白的抑制常數(shù)都達(dá)到了nmol/L級(jí)。這表明槲皮素與這些抗腫瘤靶蛋白具有較好的親和性，槲皮素的抗腫瘤作用是通過抑制二氫葉酸還原酶、二氫乳清酸脫氫酶和基質(zhì)金屬蛋白酶-8等酶的活性來實(shí)現(xiàn)的。

犀角地黃湯的化學(xué)成分復(fù)雜，歐海亞等[19]將篩選出的活性成分用PharmMapper Sever進(jìn)行藥效團(tuán)匹配反向篩選，使用Cytoscape軟件和String數(shù)據(jù)庫分別構(gòu)建“化合物-靶點(diǎn)-疾病”相關(guān)網(wǎng)絡(luò)和靶蛋白相對(duì)應(yīng)基因的“蛋白互作”網(wǎng)絡(luò)，最后通過GO-BP功能富集及KEGG通路富集，對(duì)靶點(diǎn)蛋白的生物學(xué)過程和通路進(jìn)行分析，揭示了犀角地黃湯治療疾病的可能作用及機(jī)制。中藥單體臭椿酮具有多種藥理活性，如抗瘧疾、抗病毒、抗腫瘤等。趙松峰等[20]使用PharmMapper數(shù)據(jù)庫篩選臭椿酮抗腫瘤的潛在作用靶點(diǎn)，利用KEGG數(shù)據(jù)庫獲取篩選出的潛在活性靶點(diǎn)的通路信息，并對(duì)其進(jìn)行富集分析構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，最后使用Cytoscape軟件構(gòu)建“化合物（臭椿酮）-蛋白靶點(diǎn)-作用通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，通過對(duì)其相關(guān)蛋白靶標(biāo)和通路研究，發(fā)現(xiàn)這些靶點(diǎn)和通路主要集中于一些腫瘤通路。臭椿酮發(fā)揮抗腫瘤作用也是由于其對(duì)相關(guān)的信號(hào)通路的作用實(shí)現(xiàn)的，這些理論基礎(chǔ)為臭椿酮能夠作為治療多種腫瘤的潛在藥物提供了支撐。

3 反向?qū)釉谥兴幓钚曰衔锖Y選中的應(yīng)用

單味中藥或是復(fù)方都含有大量化合物，這給活性化合物確證帶來了難度。反向?qū)幽軐?duì)大量化合物進(jìn)行篩選，從中選出有效的活性化合物。如蘇博源等[21]以凹葉木蘭和中緬木蓮中所提取的18種化合物為研究對(duì)象，使用Discovery Studio軟件中的Pharma DB藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫為靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶標(biāo)匹配，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜サ粑磁c抗腫瘤靶標(biāo)結(jié)合的化合物，進(jìn)一步篩選出25組配體-受體的結(jié)合類型并對(duì)其進(jìn)行全柔性對(duì)接分析和預(yù)測(cè)剩余化合物的藥代動(dòng)力學(xué)與毒理性質(zhì)。研究結(jié)果表明其中4種化合物具有較大抗腫瘤活性潛力。腫節(jié)風(fēng)含揮發(fā)油、酯類、酚類、鞣質(zhì)、黃酮等化學(xué)成分。林彤等[22]通過TCMSP等數(shù)據(jù)庫搜集腫節(jié)風(fēng)的化學(xué)成分，應(yīng)用CTD匹配靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病，采用Cytoscape構(gòu)建和分析網(wǎng)絡(luò)，利用STRING進(jìn)行靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析，通過Glue GO進(jìn)行基因本體（GO）及KEGG通路富集分析，采用EMDOCK進(jìn)行分子對(duì)接，最終篩選出22個(gè)腫節(jié)風(fēng)活性成分，可作用于116個(gè)靶點(diǎn)治療18類疾病，確認(rèn)了淫羊藿素、苯二甲酸等8種活性成分為腫節(jié)風(fēng)的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，ALB、EGFR、CASP3及MAPK8等為其關(guān)鍵靶點(diǎn)。

4 反向?qū)釉谥兴庂|(zhì)量標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用

2016年，劉昌孝院士提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker）這一新概念后[23]，中藥質(zhì)量標(biāo)志物成為了中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的前沿與核心，業(yè)內(nèi)學(xué)者對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)志物的研究方法、研究模式和示范性研究等方面進(jìn)行了廣泛的研究[24-27]。白鋼等[28]以中藥質(zhì)量標(biāo)志物為切入點(diǎn)，嘗試構(gòu)建中藥材品質(zhì)的近紅外智能評(píng)價(jià)體系；李小錦等[29]提出了以臨床藥效為基準(zhǔn)，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系的中藥質(zhì)量生物標(biāo)志物研究策略；侯小濤等[30]基于中藥一物多效的特點(diǎn)，以中藥相反功效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究為起點(diǎn)，對(duì)具有反向功效差異特點(diǎn)的中藥進(jìn)行中藥質(zhì)量標(biāo)志物研究。而白鋼等[28]關(guān)于成分與藥效關(guān)聯(lián)研究的闡述，又為反向虛擬篩選技術(shù)應(yīng)用于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的研究提供了思路。李小錦等[29]提到采用反向分子對(duì)接與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)中藥質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)，這一思路和白鋼等[28]關(guān)于成分與藥效關(guān)聯(lián)研究的闡述相互印證。具體研究是通過文獻(xiàn)檢索對(duì)中英文文獻(xiàn)中與研究對(duì)象相關(guān)的活性成分進(jìn)行篩選，然后利用PharmMapper藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反向找靶，預(yù)測(cè)所搜集的中藥活性成分直接作用的靶點(diǎn)。對(duì)篩選出來的靶蛋白進(jìn)行功能注釋，再根據(jù)靶蛋白功能對(duì)相應(yīng)的活性成分進(jìn)行分組，將所分得的化學(xué)物質(zhì)組與藥效進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究，篩選出與藥物關(guān)鍵功能相關(guān)的直接作用靶點(diǎn)。最后，將獲取的靶點(diǎn)蛋白信息導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中，通過KEGG-Pathway功能預(yù)測(cè)靶蛋白的作用通路，對(duì)通路進(jìn)行富集、注釋和分析，并構(gòu)建“藥材-活性化合物-靶點(diǎn)-通路-疾病”作用網(wǎng)絡(luò)，初步預(yù)測(cè)質(zhì)量生物標(biāo)志物的范圍后，針對(duì)所篩選的關(guān)鍵藥理作用進(jìn)行動(dòng)物模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過分組、造模、給藥后對(duì)動(dòng)物的脂肪組織和肌肉組織中相關(guān)蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定與分析，初步得到藥物藥效功能相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)志物。

5 反向?qū)优c其他方法組合應(yīng)用

計(jì)算機(jī)輔助藥物篩選方法和傳統(tǒng)藥物篩選過程對(duì)比，可以避免傳統(tǒng)方法篩選的盲目性，具有較好的主觀性和高效便捷的特性。近年來，反向分子對(duì)接組合其他方法進(jìn)行目標(biāo)預(yù)測(cè)的趨勢(shì)緩慢上升，尤其是使用反向?qū)酉到y(tǒng)和反向藥效團(tuán)映射的反向篩選方法變得非常重要[31]。主要有以下3種組合方法。

5.1反向藥效團(tuán)匹配和正向分子對(duì)接方法 綜合反向篩選與正向?qū)拥慕Y(jié)果，可以更精確、更嚴(yán)密地確定潛在靶點(diǎn)。周域等[32]運(yùn)用PharmMapper藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫對(duì)蒼術(shù)酮進(jìn)行反向篩選，按照蒼術(shù)酮與藥效團(tuán)的契合程度進(jìn)行評(píng)分。將評(píng)分排在前10的靶標(biāo)蛋白的生理作用進(jìn)行分析，對(duì)具有疾病治療價(jià)值的前3個(gè)靶標(biāo)蛋白與蒼術(shù)酮的藥效團(tuán)匹配特征進(jìn)行詳細(xì)描述，最后對(duì)3個(gè)靶蛋白進(jìn)一步進(jìn)行正向分子對(duì)接驗(yàn)證。反向篩選和正向?qū)拥慕Y(jié)果可預(yù)測(cè)到細(xì)胞維甲酸結(jié)合蛋白2、二肽基肽酶Ⅳ和維甲酸β受體是蒼術(shù)酮的潛在蛋白靶點(diǎn)。

5.2 雙重虛擬篩選法 篩選邏輯由算法組成，單一篩選體系可能出現(xiàn)錯(cuò)誤或遺漏，多個(gè)篩選系統(tǒng)結(jié)合使用，可使篩選結(jié)果更加可靠。BHATTACHARJEE B等[5]在尋找潛在靶點(diǎn)的過程中，采用基于idTarget和PharMapper的雙重虛擬篩選系統(tǒng)，從2個(gè)獨(dú)立的反向篩選平臺(tái)上獲得一組與多種癌癥相關(guān)的靶蛋白，并根據(jù)擬合得分和結(jié)合能進(jìn)行排序，確認(rèn)了靶點(diǎn)并揭示了其抗腫瘤作用機(jī)理。最后，通過對(duì)藏紅花苦素與Hsp90α在AutoDock中的對(duì)接后結(jié)合模式進(jìn)行分析，驗(yàn)證了結(jié)果的有效性。

5.3 反向篩選與傳統(tǒng)分子/細(xì)胞生物學(xué)結(jié)合 傳統(tǒng)分子/細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)擁多種優(yōu)勢(shì)，與反向?qū)蛹夹g(shù)結(jié)合，可使預(yù)測(cè)結(jié)果更加可信。CAI J H等[33]提出反向?qū)咏Y(jié)合生物檢測(cè)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法，以抗幽門螺桿菌篩選中發(fā)現(xiàn)的活性天然產(chǎn)物為探針，采用反向?qū)臃ㄋ阉鲀?nèi)部潛在藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（PDTD），然后進(jìn)行同源性研究和酶法檢測(cè)。結(jié)果表明抗幽門螺桿菌肽去甲?；福℉pPDF）是篩選新的抗H.pylori藥物的潛在靶點(diǎn)。利用上述方法，對(duì)于小分子化合物的靶標(biāo)篩選來說，無疑提高了其匹配的準(zhǔn)確性和加強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。

5.4 反向?qū)蛹夹g(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合應(yīng)用 反向分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究從整體出發(fā)通過多成分、多靶標(biāo)、多途徑的研究模式構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”關(guān)系圖，可反映中藥作用機(jī)理，充分體現(xiàn)了中醫(yī)用藥的整體性，無論是在單方還是復(fù)方作用機(jī)制的研究都有較為廣泛的應(yīng)用。如汪艷平等[34]通過PharmMapper藥效團(tuán)數(shù)據(jù)庫反向篩選出瑤藥四方藤的潛在作用靶點(diǎn)，運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫中的KEGG-Pathway功能，根據(jù)潛在的靶蛋白落在通路上的數(shù)量預(yù)測(cè)其作用的信號(hào)傳遞通路，并構(gòu)建“藥材（四方藤）-活性化學(xué)成分-靶點(diǎn)-作用通路”網(wǎng)絡(luò)圖，通過對(duì)四方藤主要作用通路的分析，發(fā)現(xiàn)了與其抗炎作用相關(guān)的4條途徑，提示四方藤抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制可能是其活性成分通過干擾體內(nèi)炎癥通路，進(jìn)而影響炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，達(dá)到治療效果的。

6 討 論

反向分子對(duì)接技術(shù)在藥物的研究與開發(fā)領(lǐng)域具有減少成本、節(jié)約時(shí)間和提高研發(fā)成功率等優(yōu)勢(shì)，這為篩選藥物潛在作用靶點(diǎn)，探索作用機(jī)制，以及預(yù)測(cè)中藥質(zhì)量標(biāo)志物、活性分子等方面提供了新思路，是研究中藥復(fù)雜體系物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制的重要方法之一。盡管反向?qū)蛹夹g(shù)具有一定的可靠性，但計(jì)算機(jī)模擬對(duì)接的結(jié)果不能完全代替體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，同時(shí)還存在一些缺點(diǎn)，如各類軟件的運(yùn)算方法不同，其結(jié)果均存在一定比例的假陽性；另外，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)不完整，蛋白晶體結(jié)構(gòu)解析進(jìn)展緩慢都會(huì)使得結(jié)果不夠完整和準(zhǔn)確；最后，評(píng)價(jià)方法的不夠完善，最終結(jié)果還需要與其他實(shí)驗(yàn)方法的結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行進(jìn)一步分析，以及通過體內(nèi)外研究對(duì)目前已鑒定的靶點(diǎn)進(jìn)行生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此，面對(duì)著中藥單一成分多靶點(diǎn)，組方更是復(fù)雜多變的特性，反向分子對(duì)接技術(shù)顯示出了很大的優(yōu)勢(shì)，在中藥活性化學(xué)成分蛋白靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)、作用機(jī)制的深入研究及功效和生物質(zhì)量標(biāo)志物的確定上具有很大的發(fā)展空間。如能在蛋白數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)容、對(duì)接軟件和解析功能的優(yōu)化、評(píng)價(jià)體系的發(fā)展等方面不斷完善，隨著反向分子對(duì)接理論和技術(shù)上的不斷完善，反向分子對(duì)接技術(shù)必將為科學(xué)、高效地闡明中藥活性分子及其作用途徑提供有力工具。