左歸丸治療骨質(zhì)疏松癥的臨床應(yīng)用及實驗研究進展*

牟宏亮，吳小燕，昝強，楊鋒，崔曉萍

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽712046

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量減少，骨密度下降，骨強度降低，從而導(dǎo)致骨結(jié)構(gòu)異常，骨脆性增加，持重減弱，易發(fā)生骨折為特征的慢性退行性骨疾病［1］。無論性別，可發(fā)生于任何年齡，但多見于絕經(jīng)后女性和老年男性。OP是中國乃至世界最常見的骨骼性疾病和多發(fā)病。隨著全球人口老齡化進程的加速，OP的發(fā)病率現(xiàn)已躍居慢性疾病的第3位，其高致殘率嚴重影響著人們的生活質(zhì)量［2-4］，亟需尋求有效的治療方案。

OP可歸屬于中醫(yī)學(xué)“腎虛”“虛勞”“骨痹”“骨痿”等范疇［5］，且該病的發(fā)生與腎關(guān)系密切?！夺t(yī)經(jīng)精義》云：“腎藏精，精生髓，髓養(yǎng)骨，故骨者，腎之合也，髓者，精之所生也，精足則髓足，髓在骨內(nèi)，髓足則骨強?！笨梢?，腎中精氣充足是維持骨骼正常生長發(fā)育的關(guān)鍵。若腎精充足，骨髓生化有源，則骨骼強健有力；若腎精虧虛，骨髓生化乏源，骨髓空虛，則骨枯髓減，骨骼得不到濡養(yǎng)，骨軟無力，脆弱易折，故臨床治療多以補腎為主。

經(jīng)方左歸丸作為補腎填精的代表方，臨床用以治療OP療效確切，且多項臨床觀察及實驗研究已從分子生物學(xué)水平證實其安全性、有效性及可靠性?，F(xiàn)對左歸丸治療OP的相關(guān)研究進行總結(jié)概述，以便為后期的臨床應(yīng)用提供一定的參考。

1 臨床研究

1.1 左歸丸單藥治療OP的臨床研究孫志英等［6］臨床觀察90例肝腎不足證OP患者，分別以左歸丸湯劑和丸劑進行干預(yù)，6個療程后，兩組患者的生活質(zhì)量（日常生活能力、社會活動能力、抑郁心理狀態(tài)及焦慮心理狀態(tài)）均較治療前明顯改善，視覺模擬評分法（visual analogue scale，VAS）評分顯著降低，且丸劑組療效明顯優(yōu)于湯劑組。歐陽峰松［7］觀察肝腎陰虛型老年性O(shè)P患者100例，治療組50例予以左歸丸加減治療，對照組50例則以口服鈣爾奇D和阿法骨化醇片聯(lián)合治療。2個療程后（3個月為1療程），治療組有效率為92.0%，明顯高于對照組的72.0%；同時，兩組患者的腰背疼痛程度及腰椎和股骨頸的骨密度變化均較治療前明顯好轉(zhuǎn)，且治療組療效明顯優(yōu)于對照組。王如然等［8］觀察30例左歸丸治療2型糖尿病合并骨質(zhì)疏松腎陰虛證患者的臨床療效，發(fā)現(xiàn)經(jīng)6個月治療后，左歸丸組總有效率為83.33%，明顯高于單用鈣爾奇D組的76.67%和對照組的33.33%；同時，左歸丸組患者骨密度較對照組顯著增加，血清骨鈣素、甲狀旁腺素和堿性磷酸酶水平顯著降低，治療骨痛的平均起效時間、平均緩解時間均明顯縮短。

1.2 左歸丸聯(lián)合其他藥物治療OP的臨床研究韓玉芬［9］臨床觀察102例絕經(jīng)后OP患者，其中對照組51例予以口服阿侖膦酸鈉片治療，觀察組51例在對照組的基礎(chǔ)上予以左歸丸治療。6個療程（4周為一療程）后，與對照組相比，觀察組腰椎及股骨近端骨密度顯著升高，血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRAP5b）及組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）水平顯著降低，表明左歸丸聯(lián)合阿侖膦酸鈉片是通過降低血清TRAP5b及CTSK含量、提高腰椎及股骨近端骨密度水平治療絕經(jīng)后OP。孫福波［10］觀察左歸丸聯(lián)合鮭魚降鈣素治療78例老年性O(shè)P患者的臨床療效，對照組39例予鮭魚降鈣素治療，觀察組在此基礎(chǔ)上予以左歸丸治療，持續(xù)給藥3個月后，觀察組顯效28例，有效9例，有效率為94.87%，明顯高于對照組的74.36%，發(fā)現(xiàn)左歸丸結(jié)合鮭魚降鈣素可顯著改善老年性O(shè)P患者的臨床癥狀和骨密度，且療效優(yōu)于單純使用鮭魚降鈣素。劉玉林等［11］使用左歸丸聯(lián)合阿法骨化醇、替勃龍治療絕經(jīng)后OP患者40例，6個月后，觀察組有效率為87.5%，顯著高于對照組（單用阿法骨化醇聯(lián)合替勃龍）的67.5%。觀察組患者股骨頸骨密度、腰椎正位骨密度及Wards三角區(qū)骨密度均較治療前顯著升高，骨鈣素、骨堿性磷酸酶及TRAP等骨代謝指標水平顯著下降，且各指標改善情況明顯優(yōu)于對照組。以上研究顯示，左歸丸可顯著提高其他相關(guān)藥物的療效，且聯(lián)合用藥療效優(yōu)于單一用藥。

1.3 左歸丸治療OP所致骨折的臨床研究李超［12］臨床觀察90例骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折椎體后凸成形術(shù)（percutaneous kyphoplasty，PKP）后患者，隨機分為3組，分析比較患者的VAS評分、腰痛ODI評分標準（the oswestry disability index）、骨密度水平以及鄰近椎體骨折的發(fā)生率，發(fā)現(xiàn)左歸丸聯(lián)合唑來膦酸能明顯緩解PKP術(shù)后患者腰背部的疼痛，改善患者腰部功能障礙，提高骨密度水平，降低鄰近椎體骨折再發(fā)生率。江和明［13］將60例骨質(zhì)疏松性椎體壓縮性骨折患者隨機分為兩組，對照組30例采用經(jīng)皮雙側(cè)球囊擴張椎體成形術(shù)，治療組在對照組的基礎(chǔ)上予以左歸丸治療。通過對兩組患者術(shù)后3 d、2個月的VAS評分和療效進行評價，發(fā)現(xiàn)術(shù)后2個月治療組有效率為96.67%、治愈率為36.7%，明顯高于對照組70.0%的有效率和10.0%的治愈率，可見左歸丸對OP所致骨折具有較好的療效。

2 實驗研究

破骨細胞和成骨細胞是骨組織代謝的基本功能細胞，對骨的生長或吸收起著調(diào)控作用。成骨細胞的骨形成作用與破骨細胞的骨吸收作用是維持骨骼重建的基礎(chǔ)，若兩者之間的“動態(tài)平衡”被破壞，骨吸收作用強于骨形成作用，則會導(dǎo)致OP的發(fā)生［14-15］。研究證實，左歸丸可通過影響破骨細胞的骨吸收及成骨細胞的骨形成防治OP。

2.1 左歸丸通過抑制破骨細胞的骨吸收治療OP

2.1.1 通過調(diào)節(jié)破骨細胞分化調(diào)控因子骨保護素（osteoprotegerin，OPG）及核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）抑制破骨細胞李強等［16］體外分離培養(yǎng)破骨細胞和成骨細胞，并制備卵巢切除加左歸丸組、卵巢切除組及對照組大鼠的含藥血清，分別對其進行干預(yù)。通過檢測比較破骨細胞所引起的骨吸收陷窩數(shù)目和面積、OPG及破骨細胞RANKL蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清可對破骨細胞產(chǎn)生直接的抑制作用，同時可促進OPG表達，抑制RANKL活性，并可通過成骨細胞間接抑制破骨細胞，從而防治OP，此與劉梅潔等［17］的研究結(jié)果基本一致。此外，劉飛祥等［18-19］發(fā)現(xiàn)左歸丸可通過調(diào)節(jié)β2腎上腺素受 體（β2 adrenergic receptor，β2AR）介 導(dǎo) 的RANKL／OPG信號通路，降低大鼠血清中Ⅰ型膠原羧基端肽β特殊序列（βcross-linked C-telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTX）水平，提高骨特異性堿性磷酸酶水平，增加骨量，改善股骨遠端骨小梁顯微的結(jié)構(gòu)。吳佳瑩等［14］采用切除雙側(cè)卵巢法制作OP模型大鼠，予以左歸丸干預(yù)3個月后，發(fā)現(xiàn)左歸丸組與模型組大鼠相比，脛骨骨量顯著增加，骨吸收（骨小梁吸收表面百分比）和骨形成（骨小梁形成表面百分比、類骨質(zhì)平均寬度、骨小梁礦化率、骨皮質(zhì)礦化率）水平明顯降低，且大鼠肝組織中鐵調(diào)素mRNA及脛骨骨髓中OPG mRNA的表達強度明顯增高，而鐵泵蛋白Ferroportin1和RANKL mRNA表達強度則明顯下調(diào)。得出結(jié)論：左歸丸可通過提高鐵調(diào)素的表達水平，促使其與受體鐵泵蛋白Ferroportin1結(jié)合，調(diào)節(jié)下游的信號通路OPG／RANKL，使OPG表達上調(diào)，RANKL表達下調(diào)，從而抑制破骨細胞活性，達到治療OP的目的。

2.1.2 通過調(diào)節(jié)瞬時受體電位通道V5（transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 5，TRPV5）抑制破骨細胞的骨吸收有研究發(fā)現(xiàn)，機體具有鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運的組織及器官幾乎均有新型鈣離子通道TRPV5的參與［20］。TRPV5可參與調(diào)節(jié)整個機體的鈣平衡，介導(dǎo)破骨細胞的分化過程，并與OP鈣代謝紊亂現(xiàn)象具有一定的聯(lián)系［21］。唐皓等［22］通過切除大鼠卵巢造模研究左歸丸治療OP的作用機制，并通過蛋白免疫印跡法檢測骨組織TRPV5、鈣結(jié)合蛋白D28K、鈉鈣交換器1和細胞膜鈣汞蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)與模型組相比左歸丸組上述蛋白的表達水平均明顯下降，且以左歸丸高劑量組下調(diào)最為顯著。進而證實左歸丸可通過降低破骨細胞中TRPV5、鈣結(jié)合蛋白D28K、細胞膜鈣汞蛋白、鈉鈣交換器1等蛋白的表達水平，抑制破骨細胞的骨吸收，從而起到抗OP作用。

2.1.3 通過調(diào)節(jié)炎癥因子抑制破骨細胞活性初始T細胞在白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23）的刺激下，可分化形成輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17），而Th17分泌IL-17A可觸發(fā)機體局部炎癥反應(yīng)，并產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）等炎性細胞因子，促進破骨細胞形成，導(dǎo)致骨質(zhì)流失［23］。有研究顯示，IL-17與絕經(jīng)后OP的發(fā)生關(guān)系密切［24］。謝寶華等［25］發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后婦女骨密度下降，Th17／調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cells，Tregs）亞群向Th17偏移。予以左歸丸治療后，患者骨密度明顯增加，Th17亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達下調(diào)，Treg亞群特異性核轉(zhuǎn)錄因子蛋白表達上調(diào)，進而證實左歸丸可誘導(dǎo)Th17／Treg亞群向Treg偏移，抑制溶骨性細胞因子的產(chǎn)生，從而減少骨丟失。劉立萍等［26］研究發(fā)現(xiàn)左歸丸干預(yù)組去卵巢大鼠血清中TNF-α、IL-17、RANKL水平較模型組大鼠顯著降低；通過TRAP染色法檢測股骨組織破骨細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)左歸丸干預(yù)組大鼠較模型組明顯減少，HE（hematoxylin-eosin staining）染色法觀察發(fā)現(xiàn)左歸丸干預(yù)組大鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)、形態(tài)基本正常，破骨細胞數(shù)目明顯減少，骨小梁狹窄。陳劍磨等［27］以左歸丸混懸液給去勢OP大鼠灌服12周后，發(fā)現(xiàn)左歸丸組大鼠腰椎椎體組織中TNF-α、IL-1與IL-6 mRNA表達水平較模型組顯著下降。以上研究結(jié)果表明，左歸丸可通過調(diào)節(jié)炎癥因子、抑制破骨細胞活性進而達到治療OP的目的。

2.1.4 通過抑制TRAP進而抑制破骨細胞活性TRAP主要由破骨細胞分泌表達，是破骨細胞的活性標志物，在OP患者中呈高表達狀態(tài)。左歸丸則可通過抑制TRAP的活性，防止骨丟失，從而起到治療OP的作用［28-29］。劉立萍等［28］通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，左歸丸可能是通過下調(diào)破骨細胞功能標記分子T細胞核因子2的蛋白表達抑制TRAP，從而達到抑制破骨細胞活性的作用，以防治老年性O(shè)P。

2.2 左歸丸通過促進成骨細胞的骨形成治療OP成骨細胞是骨形成和重建過程中的主要功能細胞，可分泌骨鈣素、骨橋蛋白、OPG等生物活性物質(zhì)，參與骨基質(zhì)的合成、分泌和礦化，調(diào)節(jié)并影響骨的形成和重建過程［30］，同時可調(diào)節(jié)破骨細胞的活性和功能，維持骨代謝平衡。若成骨細胞的增殖受到抑制，可直接導(dǎo)致骨形成減少而引發(fā)骨質(zhì)疏松［31］。左歸丸可通過調(diào)節(jié)細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、p38絲裂原活化蛋白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）、Wnt／β-catenin等信號通路，誘導(dǎo)成骨細胞增殖與分化以防止骨損失，治療OP。

2.2.1 左歸丸與ERK信號通路有研究發(fā)現(xiàn)，人體骨骼重建的過程需要多種激素共同調(diào)節(jié)，而雌激素在骨代謝過程中發(fā)揮著重要作用。盛斌等［32-33］通過研究證實，雌激素可通過誘導(dǎo)成骨細胞MC3T3-E1堿性磷酸酶活性、骨橋蛋白、OPG及骨鈣素等的生成而調(diào)節(jié)成骨細胞骨形成。劉立萍等［34］以左歸丸含藥血清對成骨細胞MC3T3-E1進行干預(yù)，同時使用雌激素受體拮抗劑共孵以阻斷雌激素受體（estrogen receptor，ER）。通過采用Western-blot法檢測各實驗組ERα、ERK、p-ERK和Osterix蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清組、左歸丸去補陽藥含藥血清組ERα、ERK、p-ERK和Osterix蛋白表達水平均上調(diào)。研究結(jié)果進一步表明，左歸丸含藥血清可通過上調(diào)成骨細胞ER激活ERK信號通路，促進MC3T3-E1成骨細胞的增殖、分化和礦化。該研究與章建華等［35］的結(jié)果一致。臨床多項研究已證實，左歸丸具有促進雌激素分泌、提高雌激素受體表達、改善低雌激素相關(guān)癥狀等類雌激素樣作用，故表明左歸丸可通過調(diào)控ERK信號通路促進成骨細胞的增殖進而達到治療OP的作用，且對于絕經(jīng)后OP尤為適宜。

2.2.2 左歸丸與p38MAPK信號通路p38MAPK信號通路在成骨細胞增殖與分化的過程中起著重要作用。各種炎癥因子刺激p38MAPK信號通路使其激活，可調(diào)節(jié)堿性磷酸酶的表達，促進成骨細胞分化、成熟，從而調(diào)控骨形成［36-37］。劉立萍等［38］通過實驗研究探討p38MAPK信號通路對左歸丸含藥血清干預(yù)MC3T3-E1成骨細胞分化的影響，發(fā)現(xiàn)左歸丸含藥血清可促進MC3T3-E1成骨細胞分化，明顯上調(diào)堿性磷酸酶蛋白表達水平；于左歸丸含藥血清組添加p38特異阻滯劑SB203580后，成骨細胞的分化作用受到抑制，堿性磷酸酶蛋白表達水平下調(diào)。該研究證實了左歸丸可通過p38MAPK信號通路干預(yù)MC3T3-E1成骨細胞分化，促進骨形成。研究進一步證實了左歸丸可通過上調(diào)MC3T3-E1細胞p38磷酸化蛋白的表達水平，激活p38MAPK信號通路，促進成骨細胞礦化、增殖，促進骨形成，進而達到治療OP的目的［39］。

2.2.3 左歸丸與TGF-β1／Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路TGF-β1／Smad信號通路可參與成骨細胞的增殖和分化過程［40］。石義剛等［41-42］通過研究也已證實TGF-β可通過影響OPG調(diào)節(jié)成骨細胞的增殖與分化。同時，TGF-β可通過與成骨細胞表面的TGF-β受體結(jié)合，促進成骨前體細胞分化為成骨細胞和礦物質(zhì)沉積于骨小梁，進而減少骨損傷［43］。艾思羽［44］通過切除大鼠雙側(cè)卵巢建立絕經(jīng)后OP動物模型，發(fā)現(xiàn)模型組骨組織中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ及其下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達水平下調(diào)，Smad7蛋白表達水平升高；予以左歸丸及其拆方進行干預(yù)后，TGF-β信號通路中TGF-β1、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表達水平較模型組明顯增加，Smad7蛋白表達水平顯著下降。同時，通過骨組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)組大鼠骨小梁變粗、增寬，數(shù)目增多，小梁間連接性改善，排列較緊密，證實左歸丸可通過TGF-β1／Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路提高骨密度進而達到治療絕經(jīng)后OP的目的。該結(jié)果與盛斌等［32-33］的研究一致。可見，左歸丸可通過調(diào)節(jié)TGF-β1／Smads信號通路促進成骨細胞增殖分化，提高骨密度，治療OP。

2.2.4 左歸丸與Wnt／β-catenin信號通路Wnt／β-catenin信號通路，又稱經(jīng)典Wnt通路，由Wnt蛋白、膜受體卷曲蛋白、細胞膜上的共受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5／6和β-catenin等組成，可誘導(dǎo)成骨細胞的形成及分化。當Wnt／β-catenin信號通路傳導(dǎo)異常，會導(dǎo)致骨代謝失常，進而發(fā)生OP［45］。韓學(xué)明等［46-47］臨床觀察發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后OP患者β-catenin蛋白表達水平低下。李玲慧等［48］通過提取新生SD大鼠顱蓋骨處的成骨細胞并以左歸丸含藥血清進行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)左歸丸組成骨細胞β-catenin蛋白表達水平明顯高于模型組。章建華等［35］通過實驗研究也證實了這一點。左歸丸可通過促進β-catenin蛋白水平的表達，激活Wnt信號通路，促進成骨細胞增殖，進而達到治療OP的作用。此外，張志達等［49］發(fā)現(xiàn)左歸丸可通過下調(diào)Wnt／β-catenin 信 號 通 路 抑 制 劑 拮 抗 蛋 白Dickkopf-1的表達來防治糖皮質(zhì)激素性O(shè)P的發(fā)生。

3 總結(jié)

綜上所述，左歸丸可通過多種分子通道調(diào)節(jié)破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成作用，使兩者相互作用，達到穩(wěn)定的平衡狀態(tài)，進而發(fā)揮減輕OP患者骨疼痛程度、促進骨發(fā)育、增加骨密度、提高骨強度的作用。目前，西醫(yī)治療OP主要以鈣劑、維生素D和骨吸收抑制藥物（包括雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽等）為主，需長期服用才可發(fā)揮臨床療效。然而長期服藥會增加心血管疾病、血栓疾病及婦科癌病等的發(fā)生率，且費用昂貴，患者往往比較抗拒。與西醫(yī)治療相比，臨床應(yīng)用左歸丸治療OP療效確切，不良反應(yīng)較少，安全性高，患者依從性好，可長期服用，具有多靶點、多途徑干預(yù)的特點，是臨床防治OP的良好選擇。但目前左歸丸治療OP的效應(yīng)機制仍需更深層次、更全面的研究探討。因此，今后可基于中醫(yī)理論進行多方面、多靶點的實驗研究；在臨床上，對已形成的試驗結(jié)論合理應(yīng)用，采用循證醫(yī)學(xué)研究方法，優(yōu)化臨床試驗設(shè)計方法；開展前瞻性、大樣本、多中心的臨床研究；同時對癥狀評價加強標準化，以提高其臨床應(yīng)用價值。