植物乳桿菌LV02 抑菌特性及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究

楊 悅，滑婉月，陳志迪，張 瑤，易欣欣，高秀芝

（食品質(zhì)量安全北京實驗室/農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室/微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)北京市工程實驗室/北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

0 引 言

【研究意義】植物乳桿菌屬于革蘭氏陽性桿菌，兼性厭氧[1]。在人體的胃腸道內(nèi)，植物乳桿菌屬于優(yōu)勢菌群，可以通過代謝產(chǎn)生有機酸及細(xì)菌素等有益物質(zhì)，有效抑制腐敗菌[2]。乳酸菌素是具有類似抗生素的殺菌功效，但不會產(chǎn)生抗藥性及毒性的多肽或蛋白質(zhì)[3?4]。大部分乳酸菌素只有效抑制G+或G?，而均具有抗菌效果的則較少[5]。菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力的大小與菌株特性有很大關(guān)系。有研究表明發(fā)酵培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分也對菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的抑菌能力有所影響[6]。另外，乳酸菌素在食品中應(yīng)用廣泛，為使之發(fā)揮最大作用，了解抑菌活性的適宜pH 環(huán)境及溫度也十分重要[7]。因此，開展植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及其抑菌特性的研究，對替代抗生素類防腐劑的開發(fā)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】近年來，為研究植物乳桿菌抑菌特性及生物量OD600的優(yōu)化，學(xué)者們進行了大量探索[8]。王瑤等[9?10]研究的植物乳桿菌LPL-1 對單增李斯特氏菌具有抑制作用。優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，葡萄糖對發(fā)酵產(chǎn)物影響最大，優(yōu)化后細(xì)菌素可提高1.62 倍；在100 ℃，30 min 條件下LPL-1 的細(xì)菌素仍具有熱穩(wěn)定性；徐瓏倩等[11]研究的植物乳桿菌P158 對藤黃微球菌、銅綠假單胞桿菌具有抑制作用。在對培養(yǎng)基的氮源及吐溫80 成分進行優(yōu)化后，細(xì)菌素明顯提高了218%。Zhao 等[12]研究植物乳桿菌素JLA-9 的生化特性時，發(fā)現(xiàn)該乳桿菌素具有耐高溫的特性。而許女等[13]對植物乳桿菌素KF1 進行pH 2.0～12.0 處理時發(fā)現(xiàn)，只有pH 為2.0～6.0 時該乳桿菌素具有較好的抑菌性，中性及堿性環(huán)境便失去了抑菌活性。Yoo 等[14]研究優(yōu)化植物乳桿菌JNU 2116 的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)酵母提取物對其生長影響最大?！颈狙芯壳腥朦c】目前的研究成果中，對于可同時抑制G+及G?的植物乳桿菌報道較少。植物乳桿菌LV02 可抑制部分革蘭氏陽性及陰性菌[15]。對大腸桿菌YS 有一定的抑菌效果，大腸桿菌YS 分離于生菜，為植物乳桿菌LV02后續(xù)開發(fā)抗菌保鮮類產(chǎn)品提供技術(shù)參考。采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，可以克服正交法篩選范圍寬泛的缺點，經(jīng)爬坡與最陡爬坡試驗對水平范圍進行縮減，使最終結(jié)果更具說服力[16]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】植物乳桿菌LV02 分離于發(fā)酵蔬菜，前期發(fā)現(xiàn)其可抑制部分革蘭氏陰性及陽性菌[15]。本研究以植物乳桿菌LV02 為研究對象，對其抑菌特性進行探討。并基于單因素、爬坡試驗及最陡爬坡試驗，以抑菌圈直徑及生物量OD600為響應(yīng)值，利用CCD 試驗進行數(shù)據(jù)分析，通過優(yōu)化植物乳桿菌LV02 的發(fā)酵培養(yǎng)基，提高對大腸桿菌YS 的抑菌性及生物量OD600，以期為植物乳桿菌LV02 的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要試劑

植物乳桿菌LV02（Lactobacillus plantarum，NCBI登錄號：MH885507），分離源于發(fā)酵蔬菜；大腸桿菌YS（Escherichia coli，NCBI 登錄號：MN153456.1），分離源于生菜。以上菌種均保存于北京農(nóng)學(xué)院食品學(xué)院菌種保藏室。營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）、酵母浸粉，酪蛋白胨均購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡萄糖及蔗糖均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。MRS 肉湯（MRS）：葡萄糖20 g·L?1、蛋白胨10 g·L?1、牛肉粉5 g·L?1、酵母菌4 g·L?1、乙酸鈉5 g·L?1、磷酸氫二鉀2 g·L?1、硫酸鎂0.2 g·L?1、檸檬酸三銨2 g·L?1、硫酸錳0.05 g·L?1、吐溫80 1 mL·L?1、蒸 餾水1 L。pH6.2 ± 0.1，121 ℃高壓滅菌15 min 備用。

1.2 主要儀器設(shè)備

WS-01 型恒溫恒濕箱，湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司；BSA2202S 型分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DL-CJ-1N 型超級潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MLS-3750 型高壓蒸汽滅菌鍋，Sanyo ELectric Co.Ltd；T6 型新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 植物乳桿菌LV02 發(fā)酵上清濾液的制備 從植物乳桿菌LV02 的甘油保藏管中以2%的接種量置于10 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h。蘸取一環(huán)菌液進行兩代平板劃線，每代培養(yǎng)24 h，得到二代活化板。從中挑取2 環(huán)單菌落轉(zhuǎn)接到50 mL的MRS 液體培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，再用同樣的溫度以5%的接種量轉(zhuǎn)培靜置24 h，得到LV02發(fā)酵培養(yǎng)液。4 ℃，15 min，8 000 r·min?1離心，再用0.22 μm 的無菌濾膜過濾，得到LV02 發(fā)酵上清過濾液。

1.3.2 指示菌的培養(yǎng) 從經(jīng)二代活化的大腸桿菌YS 平板上挑取一環(huán)單菌落，置于已高壓滅菌的LB肉湯中進行12 h、150 r·min?1、37 ℃的恒溫培養(yǎng)。

1.3.3 抑菌試驗 向60 ℃左右的150 mL 營養(yǎng)瓊脂內(nèi)注入107CFU·mL?1的大腸桿菌菌液150 μL，在超凈臺上左右混勻，倒入一次性平板內(nèi)。瓊脂凝固后，放上牛津杯，向每個牛津杯內(nèi)注入100 μL 的LV02 發(fā)酵上清過濾液，三組平行，37 ℃培養(yǎng)12 h觀察抑菌圈直徑。

1.3.4 植物乳桿菌LV02 抑菌特性

1.3.4.1 硫酸銨沉淀法初步分離LV02 的細(xì)菌素 取LV02 發(fā)酵上清過濾液，分別以40%、50%、60%、70%、80%及90%的飽和度硫酸銨進行12 h 沉淀。將硫酸銨沉淀液進行15 min、8 000 r·min?1的4 ℃低溫離心，將得到的離心沉淀，用去離子水（體積為發(fā)酵上清液的1/10）進行混勻復(fù)溶。采用0.22 μm 的無菌濾膜過濾復(fù)溶液，采用牛津杯法，篩選硫酸沉淀LV02 的細(xì)菌素最佳飽和度。

1.3.4.2 植物乳桿菌LV02 熱穩(wěn)定性試驗 將pH 6.3 的LV02 發(fā)酵上清濾液，分別置于60 、80、100 ℃的恒溫水浴鍋中處理60、90 、120 min。經(jīng)0.22 μm 的無菌濾膜過濾后進行牛津杯試驗。

1.3.4.3 pH 對植物乳桿菌 LV02 抑菌活性的影響用1 mol·L?1的NaOH 溶液及鹽酸將LV02 發(fā)酵上清濾液的pH 分別調(diào)至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5。以未經(jīng)處理的LV02 發(fā)酵上清濾液作為對照，采用牛津杯法觀察對大腸桿菌YS 的抑制效果。

1.3.4.4 植物乳桿菌LV02 對不同指示菌的抑菌效果取5%的LV02 種子液，轉(zhuǎn)置MRS 肉湯培養(yǎng)24 h，得到LV02 發(fā)酵培養(yǎng)液。以4 ℃，15 min，8 000 r·min?1離心，再用0.22 μm 的無菌濾膜過濾，得到LV02 發(fā)酵上清過濾液。向60 ℃左右的150 mL 營養(yǎng)瓊脂內(nèi)分別注入107CFU·mL?1的大腸桿菌YS、單增李斯特菌及豬霍亂沙門氏菌150 μL。在超凈臺上左右混勻，倒入一次性平板內(nèi)。瓊脂凝固后，放上牛津杯，在每個牛津杯內(nèi)放入100 μL 的LV02 發(fā)酵上清過濾液，每次重復(fù)3 次，37 ℃培養(yǎng)12 h 觀察抑菌圈直徑。

1.3.5 單因素試驗

1.3.5.1 優(yōu)化氮源、碳源 以MRS 肉湯配方為 基礎(chǔ)，將氮源（19 g·L?1）等量替換為大豆蛋白胨、酪蛋白胨、酵母浸粉、蛋白胨及酵母浸粉+蛋白胨（1∶1）。確定氮源后，再將碳源（20 g·L?1）等量替換為葡萄糖、蔗糖、果糖、D-果糖、乳糖、葡萄糖+乳糖（1∶1）及葡萄糖+蔗糖（1∶1），其他成分及含量和MRS 肉湯一致，用50 mL 去離子水?dāng)嚢杓訜崛芙猓?21 ℃、15 min 高壓滅菌。以體積分?jǐn)?shù)為5%的量進行發(fā)酵接種，37 ℃培養(yǎng)24 h，以牛津杯法測定抑菌圈直徑，選出最佳碳源。

1.3.5.2 優(yōu)化礦物質(zhì)組合 固定氮源、碳源，對礦物質(zhì)進行優(yōu)化。組合因子有磷酸氫二鉀（0、2、4、6、8 g·L?1）、硫酸鎂（0、0.1、0.2、0.3、0.4 g·L?1）、乙酸鈉（0、2.5、5.0、7.5、10 g·L?1）及硫酸錳（0、0.1、0.2、0.3、0.4 g·L?1）。首先選取其中一種考察因子，按照所設(shè)計的不同添加量來逐一篩選。其他因子以此類推。最終得到一組無機鹽組合，其他成分及含量和MRS 肉湯一致，用50 mL 去離子水?dāng)嚢杓訜崛芙猓?21 ℃高壓滅菌15 min。以體積分?jǐn)?shù)為5%的量進行發(fā)酵接種，37 ℃培養(yǎng)24 h，以牛津杯法[17]測定抑菌圈直徑，選出最佳礦物質(zhì)組合。

1.3.5.3 優(yōu)化吐溫80、生長因子組合 以0、1、2、3、4 mL·L?1對吐溫80 進行單因素篩選。確定吐溫80 添加量后，分別加入胡蘿卜汁、黃瓜汁、西紅柿汁、胡蘿卜汁+西紅柿汁（1∶1）、黃瓜汁+西紅柿汁（1∶1），各50 mL·L?1。其他成分及含量和MRS 肉湯一致。用50 mL 去離子水?dāng)嚢杓訜崛芙猓捎?21 ℃、15 min 高壓滅菌。以體積分?jǐn)?shù)為5%的量發(fā)酵接種，37 ℃培養(yǎng)24 h 后取出，以牛津杯法測定抑菌圈直徑，選出最佳生長因子。

1.3.6 爬坡試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用PB 試驗初步設(shè)計出每個因子的高低水平（高低水平的差值要適合，否則會出現(xiàn)效應(yīng)不明顯的結(jié)果）。對葡萄糖、酵母浸粉、硫酸錳、硫酸鎂、乙酸鈉、吐溫80 及胡蘿卜汁，這7 種因子進行PB 試驗（n=12）。以抑菌圈直徑為響應(yīng)值，分析影響LV02抑菌效果的顯著影響因子，Plackett-Burman 設(shè)計因子水平見表1。

1.3.7 最陡爬坡試驗根據(jù)PB 試驗結(jié)果中的排列圖，可確定因子的步長及方向[18]，正效應(yīng)則添加量以最低水平往上增加步長，負(fù)效應(yīng)則將添加量以最高水平往下減步長[16]。取對LV02 抑菌影響貢獻率最高的前三種因子，其余因子添加量則以單因素結(jié)果為準(zhǔn)，進行最陡爬坡試驗得到CCD 試驗中心點。

1.3.8 CCD 試驗 將最陡爬坡試驗結(jié)果作為CCD 試驗的中心點，其他非關(guān)鍵因子固定，以抑菌圈直徑及OD600作為響應(yīng)值，進行3 因子5 水平的CCD 優(yōu)化試驗[19]。CCD 優(yōu)化試驗對考察因子設(shè)定的水平范圍大，可使預(yù)期值和實際結(jié)果更相符。試驗因子與水平設(shè)計見表2。

表 1 Plackett-Burman 設(shè)計因子水平及編碼Table 1 Factors, levels, and codes of Plackett-Burman experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飽和度硫酸銨溶液的細(xì)菌素測定

不同飽和度硫酸銨溶液的細(xì)菌素測定結(jié)果見圖1，所有考察的飽和濃度經(jīng)沉淀后，其復(fù)溶液均有抑菌效果。其中在硫酸銨溶液飽和度為80%時，抑菌圈直徑可達到最大，為15.50 ± 0.50 mm，證明80%飽和度的硫酸銨沉淀植物乳桿菌LV02 的細(xì)菌素能力明顯優(yōu)于其他飽和度（P＜0.05）。

表 2 CCD 試驗各因子水平數(shù)Table 2 Levels for each factor on CCD experiment

圖 1 不同飽和度的硫酸銨溶液沉淀細(xì)菌素的效果Fig. 1 Effect of saturation degree of ammonium sulfate solution on bacteriocin precipitation

圖 2 熱處理對植物乳桿菌LV02 抑菌效果的影響Fig. 2 Effect of heat treatment on bacteriostatic property of LV02 bacteriocin

2.2 植物乳桿菌LV02 熱穩(wěn)定性試驗

植物乳桿菌LV02 熱穩(wěn)定性試驗結(jié)果見圖2，pH 6.3 的LV02 發(fā)酵上清濾液經(jīng)不同溫度、時間處理后抗菌活性逐漸降低。在處理60 min 內(nèi)，LV02 對3 種溫度不敏感，結(jié)果之間差異不顯著（P＞0.05）。而在這之后，開始呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。直到處理90 min，3 條溫度線出現(xiàn)平緩態(tài)，LV02 的抗菌活性處于穩(wěn)定狀態(tài)。60 ℃處理60 min，抑菌結(jié)果比初始值高，這可能是有該溫度處理下使抑菌物質(zhì)得到分解產(chǎn)生了活性肽[20]。100 ℃處理120 min，抑菌圈直徑為14.30 ± 0.14 mm，保留了約80%的抑菌活性，說明植物乳桿菌LV02 對高溫不敏感，可以在高溫環(huán)境內(nèi)保持活性。

2.3 pH 對LV02 抗菌活性的影響

pH 對LV02 抗菌活性的影響結(jié)果見圖3，植物乳桿菌LV02 在pH 為 3.0～7.5 均具有抗菌活性。pH 為3.0 時抗菌活性最強，抗菌圈直徑為21.58 ± 0.34 mm。pH 3.0～6.0 時，LV02 的抑菌活性是緩慢下降的趨勢，直到pH 在6.0 以上時，抗菌活性下降的幅度開始增大，且pH 6.0、6.5、7.0、7.5 之間差異顯著（P＜0.05），pH 為7.0 時保留了近80%的抗菌活性，說明LV02 在酸性及中性環(huán)境下pH 穩(wěn)定性較好。這與姜晶等[21]在研究植物乳桿菌DMS20174 對pH 的耐受情況相似，并指出這可能與大腸桿菌在該環(huán)境下競爭性不強有關(guān)。

圖 3 不同pH 對植物乳桿菌LV02 抑菌性的影響Fig. 3 Antibacterial effect of LV02 bacteriocin under pH in large intestines

2.4 LV02 對3 種指示菌的抑菌情況

植物乳桿菌LV02 對不同指示菌的抑菌效果如表3所示。LV02 對大腸桿菌YS、單增李斯特氏菌以及豬霍亂沙門氏菌這3 種指示菌均具有抑制作用。其中，對豬霍亂沙門氏菌的抑菌效果最佳，抑菌圈直徑可達到24.74 ± 0.51 mm。其次是單增李斯特氏菌、大腸桿菌。雖然從3 種指示菌比較來看，大腸桿菌對LV02 所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的敏感度不高，但是從先前研究人員在植物乳桿菌對大腸桿菌抑菌作用方面的研究結(jié)果來看[22]，抑菌圈直徑僅為5～10 mm，與LV02 抑制大腸桿菌的作用結(jié)果差異顯著。并且與對革蘭氏陰性菌沒有殺菌效果的同科菌株（Nisin）相比，LV02 具有明顯的優(yōu)勢[23]。因此，LV02 植物乳桿菌可對部分革蘭氏陰性及陽性菌產(chǎn)生抑制作用，未來可將其應(yīng)用于抑菌產(chǎn)品類開發(fā)。

表 3 LV02 對3 種指示菌的抑菌結(jié)果Table 3 Antibacterial results of LV02 against three kinds of ndicator bacteria

圖 4 不同氮源對LV02 的細(xì)菌素抗菌性的影響Fig. 4 Effect of culture nitrogen sources on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.5 單因素優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 氮源、碳源的優(yōu)化 氮源的優(yōu)化結(jié)果如圖4 所示，不同氮源對植物乳桿菌LV02 的細(xì)菌素抗菌性均具有顯著性影響（P＜0.05），可被LV02 所利用。在以酵母浸粉為唯一氮源時，細(xì)菌素抗菌性最好，抑菌圈直徑可達24.25 ± 0.29 mm。添加蛋白胨時，抗菌性最低，抑菌圈直徑僅為15.75 ± 0.50 mm。將蛋白胨與酵母浸粉1∶1 添加，抗菌效果也次于單一氮源酵母浸粉（P＜0.05），與大豆蛋白胨之間差異不顯著（P＜0.05），本試驗與章檢明[24]在優(yōu)化Lactobacillus plantarumLac-B23 發(fā)酵培養(yǎng)基氮源時的結(jié)論一致，其以蛋白胨作為氮源時細(xì)菌素效價僅為40 AU·mL?1，而氮源為酵母浸粉時效價則為560 AU·mL?1。故本試驗以酵母浸粉作為LV02 優(yōu)化培養(yǎng)基的最佳氮源。不同碳源對LV02 的細(xì)菌素抗菌性的作用效果如圖5可知，葡萄糖的影響作用最大，抑菌圈直徑可達24.28 ± 0.32 mm，與其他碳源相比具有顯著性影響（P＜0.05）。其次為果糖、葡萄糖+蔗糖（1∶1）。D-果糖、乳糖、蔗糖及葡萄糖+蔗糖（1∶1）之間差異不顯著（P＞0.05）。不同碳源的結(jié)構(gòu)是不同的。蔗糖及乳糖屬于雙糖，果糖及D-果糖雖為單糖，但也需要分解才能被利用，因此利用率偏低。生物對糖類物質(zhì)的攝入，主要以葡萄糖的形式進行吸收[25]。故本試驗以葡萄糖為LV02 優(yōu)化培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖 5 不同碳源對LV02 的細(xì)菌素抗菌性的影響Fig. 5 Effect of culture carbon sources on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.5.2 礦物質(zhì)組合的優(yōu)化 物質(zhì)優(yōu)化的結(jié)果見圖6～9。圖6 中，K2HPO4質(zhì)量濃度為2 g·L?1時，對LV02的細(xì)菌素抗菌影響最大，與未添加效果相比差異顯著（P＜0.05）。而低于或高于此質(zhì)量濃度時對抗菌效果均有影響，故以2 g·L?1作為K2HPO4的添加量。乙酸鈉的質(zhì)量濃度為5 g·L?1時（圖7），對LV02 抑菌效果最好，與未添加相比兩者具有顯著差異（P＜0.05）。質(zhì)量濃度為5 、10 g·L?1時，兩者差異不顯著（P＞0.05），但考慮成本，故選5 g·L?1作為乙酸鈉的添加量。圖8 中，隨著硫酸鎂質(zhì)量濃度的增加，抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，質(zhì)量濃度為0.2 g·L?1時，對大腸桿菌YS 的抗菌效果最佳。高玉榮等[26]研究結(jié)果表明向植物乳桿菌G1-28 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.3%的硫酸鎂時活菌數(shù)可達到最高，低于或高于此劑量都會使活菌數(shù)的優(yōu)化不利。故以0.2 g·L?1進行硫酸鎂的添加。由圖9 可知，硫酸錳對LV02 的抑菌效果影響較大，與其他各處理組差異明顯（P＜0.05），隨著質(zhì)量濃度的增加抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢。0.2 g·L?1時抗菌效果最佳，抑菌圈直徑為23.50 ± 0.50 mm，與其他各處理量呈顯著性差異（P＜0.05）。王帥[27]研究影響植物乳桿菌L69 發(fā)酵液OD 值的影響因子時，發(fā)現(xiàn)硫酸錳相較硫酸鎂及吐溫80，對L69 的OD 值具有顯著影響。因此本實驗對硫酸錳以0.2 g·L?1進行添加。

圖 6 磷酸氫二鉀對LV02 的細(xì)菌素抗菌效果的影響Fig. 6 Effect of dipotassium hydrogen phosphate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 7 乙酸鈉對LV02 的細(xì)菌素抑菌效果的影響Fig. 7 Effect of sodium acetate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 8 硫酸鎂對LV02 的細(xì)菌素抗菌效果的影響Fig. 8 Effect of magnesium sulfate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.5.3 吐溫 80、生長因子的優(yōu)化 吐溫 80 的優(yōu)化結(jié)果見圖10，不同含量的吐溫80 對LV02 的細(xì)菌素抗菌作用影響不同。在1 mL·L?1時，LV02 的細(xì)菌素抗菌效果最佳。而在此含量以上添加量越大會出現(xiàn)抗菌效果下降的趨勢。因此以1 ml·L?1作為吐溫80 的添加量。生長因子的優(yōu)化結(jié)果如圖11，5 種生長因子均可提高LV02 的細(xì)菌素抗菌能力，其中胡蘿卜汁所作用的抗菌效果最佳（P＜0.05），其次為西紅柿汁、黃瓜汁。這可能是3 種蔬菜均含有大量B 族維生素及多種礦物質(zhì)[27?28]，而胡蘿卜還含有胡蘿卜素及多種維生素，可刺激LV02 的菌體產(chǎn)出更多的細(xì)菌素，增強抑菌效果。而這些是黃瓜和西紅柿所不可替代的，故以50 mL·L?1的胡蘿卜汁作為單一生長因子進行添加。

圖 9 硫酸錳對LV02 的細(xì)菌素抗菌效果的影響Fig. 9 Effect of manganese sulfate in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 10 吐溫對LV02 的細(xì)菌素抗菌效果的影響Fig. 10 Effect of Tween-80 in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

圖 11 不同生長因子對LV02 細(xì)菌素抗菌效果的影響Fig. 11 Effect of growth factors in medium on antibacterial activity of LV02 bacteriocin

2.6 爬坡試驗結(jié)果

Plackett-Burman 試驗結(jié)果及各因子貢獻率及效應(yīng)值見表4、5。表5 中，葡萄糖（X1）、硫酸錳（X7）及酵母浸粉（X2）這3 種因子對LV02 抑菌能力的貢獻率最高其中葡萄糖可達到41.39%。其次為硫酸錳、酵母浸粉，分別為19.61%和15.41%。根據(jù)各組分的效應(yīng)值結(jié)果可知，葡萄糖為正效應(yīng)，設(shè)計最陡爬坡試驗的取值范圍應(yīng)以低水平往上增。酵母浸粉與硫酸錳為負(fù)效應(yīng)，取值應(yīng)以高水平往下減。3 種組分相對于其他4 種具有顯著性差異（P＜0.05）。因此，以葡萄糖、酵母浸粉及硫酸錳進行最陡爬坡試驗，其余因素按照單因素結(jié)果比例進行添加。

2.7 最陡爬坡試驗結(jié)果

最陡爬坡試驗的設(shè)計方案及結(jié)果見表6。5 組試驗中，4 號試驗組的抑菌圈直徑最大。故將4 號試驗組，即葡萄糖（35.00g·L?1）、硫酸錳（0.16 g·L?1）及酵母浸粉（18.00 g·L?1），作為CCD 試驗中心點。

2.7.1 CCD 試驗結(jié)果 采用Design Expert 12 做方程擬合與顯著性分析，CCD 試驗設(shè)計及結(jié)果見表7。得到了植物乳桿菌LV02 抑制桿菌LV02 抑制大腸桿菌YS 的抑菌圈直徑及OD600相對于葡萄糖（X1）、硫酸錳（X7）及酵母桿菌LV02 抑制大腸桿菌YS 的抑菌圈直徑及OD600相對于葡萄糖（X1）、硫酸錳（X7）及酵母浸粉（X2）的回歸方程：

表 4 Plackett-Burman 試驗結(jié)果Table 4 Results of Plackett-Burman experiment

表 5 各因子貢獻率及效應(yīng)值Table 5 Contribution rates and effect values of individual factors

表 6 最陡爬坡試驗結(jié)果Table 6 Results of steepest ascent experiment

對Y抑菌圈直徑及YOD600這2 個回歸方程進行方差分析，由表8，9 可知，模型均為P＜0.0001，說明模型均可行且可達到極顯著水平（P＜0.01）。2 組模型的失擬項均P＞0.05，說明實驗結(jié)果與模型高度匹配。另外，2 組模型的R2分別為0.9263 和0.9408，均＞0.9，說明2 組模型能夠分別反應(yīng)LV02 的細(xì)菌素抑菌圈直徑及OD600與葡萄糖、硫酸錳及酵母浸粉之間的關(guān)系，可描述90%以上的試驗值。2 組模型的R2

abj分別86.01%與88.76%，表明培養(yǎng)基配方對抑菌圈直徑和OD600的影響達到了85%以上。變異系數(shù)（C·V）均＜5%，表明該模型的重現(xiàn)性高。并且由Prob 值分析可知，Y抑菌圈直徑模型中二次項X12、為極顯著，X22為顯著，一次項及交互項均不顯著。YOD600模型中交互項X1X2為顯著，說明葡萄糖與酵母浸粉對OD600菌體量有促進作用。X12、X72及為極顯著，其余一次項及交互項均為不顯著。2 組回歸方程中的二次項系數(shù)均為負(fù)值，說明該方程具有最大值。另外根據(jù)Y抑菌圈直徑及YOD600的方差分析結(jié)果，得到影響LV02 的細(xì)菌素抗菌能力及OD600的因素大小順序為：X1＞X2＞X7，即葡萄糖＞酵母浸粉＞硫酸錳。

表 7 中心組合設(shè)計及結(jié)果Table 7 CCD design and response values

影響因子葡萄糖、硫酸錳及酵母浸粉兩兩與響應(yīng)值抑菌圈直徑及OD600之間的響應(yīng)曲面圖及等高線結(jié)果如圖12～15 所示。圖12（a）及圖13（i）反映了酵母浸粉不變的條件下，硫酸錳和葡萄糖對抑菌圈直徑的交互影響。葡萄糖的質(zhì)量濃度為27 ～35 g·L?1內(nèi)抑菌圈直徑有所提高，隨后出現(xiàn)降低。等高線圖形近圓形，說明硫酸錳和葡萄糖之間的交互影響較顯著。圖12（b）及圖13（h）可以看出，在葡萄糖質(zhì)量濃度不變的情況下，隨著硫酸錳的增加、酵母浸粉的降低，抑菌圈直徑呈上升趨勢。當(dāng)硫酸錳達到0.16 g·L?1左右、葡萄糖降低至16 g·L?1之后抑菌圈直徑呈減小趨勢。硫酸錳的響應(yīng)面坡度比酵母浸粉的坡度大，說明硫酸錳對抑菌圈直徑的影響較大。等高線呈現(xiàn)橢圓形，表明酵母浸粉和硫酸錳之間交互作用明顯。從圖12（c）及圖13（d）可知，在硫酸錳一定的條件下隨著葡萄糖的增加與酵母浸粉的降低，抑菌圈直徑呈上升趨勢。當(dāng)葡萄糖添加量達到35 g·L?1時，酵母浸粉降至18 g·L?1之后抑菌圈直徑逐漸降低。等高線呈橢圓形，表明酵母浸粉和葡萄糖之間的交互作用顯著。圖14、圖15中關(guān)于酵母浸粉、硫酸錳及葡萄糖之間與OD600的作用效果與抑菌圈直徑的結(jié)果相同。

2.7.2 驗 證 試 驗 結(jié) 果 為 了 驗 證CCD 模 型 的 可 靠性，以葡萄糖34.07 g·L?1、硫酸錳0.16 g·L?1、酵母浸粉18.12 g·L?1，其他因素固定不變，進行3 次驗證試驗。如表10 所示，抑菌圈直徑實際值為24.50 ± 0.31 mm，預(yù)測值為24.58 mm，與預(yù)測值相差近0.022%；OD600實際值為2.877 ± 0.23，預(yù)測值為2.877，與預(yù)測值相差近0.023%。表明2 個擬合方程優(yōu)化結(jié)果可靠性大。同時，優(yōu)化后的兩種響應(yīng)值相比未優(yōu)化前分別提高了近26%與12%，說明試驗所確定的優(yōu)化方式合理有效，LV02 的抑菌能力及OD600的增加程度達到了預(yù)期目的。

表 8 以抑菌圈直徑為響應(yīng)值的回歸方程方差分析Table 8 Analysis of variance for regression model based on bacteriostatic zone diameter as response value

表 9 以O(shè)D600 為響應(yīng)值的回歸方程方差分析Table 9 Analysis of variance for regression model based on OD600 as response value

圖 12 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 抑菌圈直徑的曲面圖Fig. 12 Curved view on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 inhibition zone diameter

圖 13 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 抑菌圈直徑的等高線圖Fig. 13 Contour lines on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 inhibition zone diameter

圖 14 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 OD600 的曲面圖Fig. 14 Curved view on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 OD600

圖 15 葡萄糖、硫酸錳和酵母浸粉兩兩交互影響LV02 OD600 的等高線圖Fig. 15 Contour lines on effects of glucose, manganese sulfate, and yeast extract in medium on LV02 OD600

表 10 LV02 發(fā)酵培養(yǎng)基驗證試驗結(jié)果Table 10 Verification of LV02 fermentation medium

3 討論與結(jié)論

植物乳桿菌LV02 發(fā)酵培養(yǎng)基對其抑菌能力及OD600有著重要影響，這決定著LV02 對腐敗菌的抗菌效果與活菌數(shù)。有研究表明，經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基可明顯提高抗菌能力，細(xì)菌素是原先的1.62倍[9]，具有較高的研究與利用價值。研究者曾發(fā)現(xiàn)酵母提取物對植物乳桿菌的生物量影響最大[14]。本研究選用以大腸桿菌YS 為指示菌，抑菌圈直徑及生物量OD600為評價指標(biāo)。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用PB 試驗及最陡爬坡試驗使影響因子的步長及方向接近最大產(chǎn)值，確定CCD 試驗中心點。采用CCD設(shè)計試驗，確定關(guān)鍵影響因子的最佳水平。并通過牛津杯法研究LV02 的抑菌特性，來確定LV02 對溫度及pH 的穩(wěn)定性。試驗結(jié)果顯示，酵母浸粉、葡萄糖及硫酸錳這3 種因子對LV02 發(fā)酵培養(yǎng)基抑菌功效影響較大，這與章檢明[24]、王莉[25]和王帥[26]等的研究結(jié)果一致，可能是酵母浸粉中含有利于抗菌物質(zhì)合成的氨基酸、生長因子；葡萄糖是最基礎(chǔ)的單糖，可以使植物乳桿菌LV02 得到直接的碳源吸收；而硫酸錳可能是其Mn2+可促進合成植物乳桿菌LV02 的抗菌物質(zhì)；PB 試驗結(jié)果表明，胡蘿卜汁可促進植物乳桿菌LV02 分泌抑菌物質(zhì)，但其不屬于關(guān)鍵因子，優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方中除了胡蘿卜汁用量無變化之外，其余多種組分含量有變更，分析可能不同培養(yǎng)基成分之間存在相互作用[16,29]，降低了胡蘿卜汁的正效應(yīng)。

pH 在偏酸性環(huán)境下更利于發(fā)揮LV02 的抑菌性，可能是在該環(huán)境下更有利于LV02 抑菌物質(zhì)的合成；LV02 在100 ℃處理120 min 后可保留抗菌活性，可能是LV02 菌株自身可耐高溫；LV02 可以抑制大腸桿菌YS，可能是其產(chǎn)生的細(xì)菌素可以抑制大腸桿菌形成生物膜[30]。本文最終得到LV02 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化配方為：葡萄糖34.07 g·L?1、酵母浸粉18.12 g·L?1、磷酸氫二鉀2 g·L?1、硫酸錳0.16 g·L?1、乙酸鈉5 g·L?1、硫酸鎂0.2 g·L?1、檸檬酸銨1 g·L?1、吐溫80 1 mL·L?1、胡蘿卜汁50 mL·L?1，蒸餾水1 L。用該配方培養(yǎng)LV02，使對大腸桿菌YS 的抑菌圈直徑比未優(yōu)化前提高了近26%，OD600提高了12%，說明優(yōu)化方式合理有效。通過抑菌特性分析，確定了粗提植物乳桿菌LV02 的細(xì)菌素所需硫酸銨飽和度為80%，證明了植物乳桿菌LV02 具有熱穩(wěn)定性（100 ℃，120 min）、酸堿穩(wěn)定性（pH 3.0～7.5）與抑菌性。本試驗可為植物乳桿菌LV02 開發(fā)抗菌保鮮類產(chǎn)品提供技術(shù)參考。